Urod自身抗体识别的抗原多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及UROD自身抗体识别的抗原多肽。其中，该多肽具有如SEQ?IDNO：1-5所示氨基酸序列至少之一。利用本发明的UROD自身抗体识别的抗原多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品（例如血清样品）中的UROD自身抗体。
【专利说明】UROD自身抗体识别的抗原多肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及UROD自身抗体识别的抗原多肽及其用途。更具体地，本发明涉及一种UROD自身抗体识别的抗原多肽、该多肽在制备检测肿瘤血清中UROD抗体的用途、一种用于检测样品中UROD抗体的试剂盒。
【背景技术】
[0002]肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)生物学特性十分复杂，早期无创性诊断困难，目前寻找肿瘤相关标志物已成为NSCLC等肺癌早期诊断和免疫治疗的研究热点。而近年研究表明，肿瘤患者自身免疫系统会对肿瘤相关抗原产生自身抗体，这些自身抗体存在于肺癌患者体循环中，甚至在肺癌临床症状出现5年前就可以出现了，因此自身抗体可能成为监测肿瘤发生的早期标志物。相较于血清中肿瘤抗原型标志物,血清中肿瘤抗原相应自身抗体同时具有丰度高，易检测等优势，可能成为更为可靠的血清肿瘤标志物，将有助于肿瘤的早期诊断。因此，寻找NSCLC等肺癌抗原相应自身抗体，对于NSCLC等肺癌的早期诊断以及预后检测意义重大。然而，目前相关报道很少。
【发明内容】
[0003]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
[0004]发明人在肺癌T7噬菌体展示cDNA文库结合血清学筛选研究中发现，UROD为肺癌相关的肿瘤相关抗原之一，血液样本中UROD的自身抗体水平在肺癌患者中远高于健康对照者。UROD自身抗体可能成为 更为有效的肿瘤标志物，但是目前尚未有商品化的UROD自身抗体检测试剂盒。
[0005]其中，UROD (uroporphyrinogen decarboxylase,尿卟啉原脱羧酶)是一种参与生产血红素分子的酶，而血红素对身体所有器官都是至关重要的(尽管它在血液、骨髓和肝脏中最丰富)。血红素是一类叫做血红素蛋白(其中包括在血液中携带氧气的蛋白:血红蛋白)的含铁蛋白中的主要成分。在小鼠中，阻断UROD基因的表达可增加癌细胞的死亡。对头颈部癌症组织样本的分析披露，肿瘤中的UROD蛋白表达水平比正常组织显著升高。此外，研究人员确认，临床结果的改善与病人体内较低的UROD水平有关联，提示UROD可被用来预测病人对放疗的反应。UROD抑制剂将来可与放疗和化疗共同使用以降低副作用。
[0006]进一步，发明人发现，UROD自身抗体水平检测可能有助于肿瘤中UROD浓度的无创性检测，另外，UROD自身抗体可能存在拮抗肿瘤中UROD的作用，UROD自身抗体具有保护性作用。
[0007]由此，本发明提出了一种UROD自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一:
[0008]I) SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0009]2) SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0010]3) SEQ ID NO:3: SARECVGKTVTLQGN ；[0011]4) SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0012]5) SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ；
[0013]6) SEQ ID NO: 1_5所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。[0014]根据本发明的实施例，优选地，本发明的UROD自身抗体识别的抗原多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0015]另外，本发明还提出了前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肿瘤血清UROD抗体试剂盒中的用途。尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中UROD自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
[0016]为此，本发明提出了一种用于检测样品中UROD抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。具体地，根据本发明的实施例，该试剂盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。进一步，该试剂盒可以进一步包括:阴性对照样品，所述阴性对照样品为UROD抗体为阴性的血清，或者/额外地可以进一步包括:标准样品，所述标准样品为UROD抗体浓度分别为lU/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。根据本发明的实施例，UROD自身抗体识别的抗原多肽的浓度可以为，每个反应孔I μ g/ml。根据本发明的实施例，尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。
[0017]为此，在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽具有如SEQ ID NO:1-5所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0018]SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0019]SEQ ID N0:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0020]SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；
[0021]SEQ ID N0:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0022]SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL。
[0023]根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品(例如血清样品)中的UROD自身抗体。由此，可以用于检测患者是否患有肿瘤，例如肺癌。另外,还可以通过检测对象血液中UROD自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
[0024]根据本发明的实施例，优选地所述多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ IDNO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0025]在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述多肽在检测样品中UROD自身抗体的用途。
[0026]根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
[0027]在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的UROD自身抗体。
[0028]根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
[0029]在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测样品中UROD自身抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根据本发明的实施例，可以有效地借助根据本发明的多肽对样品中的UROD自身抗体进行检测。
[0030]根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括:适于进行ELISA检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的UROD自身抗体进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0031]根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中。由此，可以方便地高通量地进行检测。可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0032]根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
[0033]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【具体实施方式】
[0034]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0035]UROD自身抗体识别的抗原多肽
[0036]根据本发明的一个方面，本发明提出了一种UROD自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一:
[0037]1) SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0038]2) SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0039]3) SEQ ID NO:3: SARECVGKTVTLQGN ；
[0040]4) SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0041]5) SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ；
[0042]6) SEQ ID NO: 1_5所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
[0043]根据本发明的实施例，优选地，本发明的UROD自身抗体识别的抗原多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0044]在本发明的再一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽具有如SEQ ID NO:1-5所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0045]SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0046]SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；[0047]SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；；
[0048]SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0049]SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL。
[0050]上述氨基酸序列均衍生自UROD的全长序列(UR0D的全长序列见NCBI_NP_000365.3)。另外，在本文中所使用的术语“多肽”是指至少两个氨基酸通过肽键连接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸残基的数目并不受特别限制。根据本发明的实施例，多肽可以含有15~20个氨基酸，优选15个氨基酸。当然，本领域技术人员可以理解的是，还可以对上述多肽进行化学修饰，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品(例如血清样品)中的UROD自身抗体。发明人发现从UROD完整序列得到的上述多肽可以作为UROD的抗原表位，能够与血液样本中UROD自身抗体特异性的反应，因而，可以有效地用于检测对象血液样本中的UROD自身抗体，由此，可以有效地用于筛查肺癌疑似患者血清，为肺癌的诊断提供了一个新的检验指标。
[0051]根据本发明的实施例，优选地所述多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ IDNO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。
[0052]本领域技术人员可以理解的是，可以有效地通过常规合成方法，合成上述多肽，从而代替重组表达的生物合成方式。 [0053]UROD自身抗体识别的抗原多肽的应用及试剂盒
[0054]由此，在本发明的又一方面，本发明还提出了前面所述多肽在检测样品中UROD自身抗体的用途。根据本发明的实施例，可以用上述多肽进行检测的样品的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，优选的样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样本。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样本中的UROD自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者提供恶性肿瘤例如肺癌的早期筛查。
[0055]利用本发明的多肽检测样品中UROD自身抗体的方法并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法，借助本发明的多肽检测样品中的UROD自身抗体。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体的效率。作为示例，可以采用下列方法利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD抗体:
[0056]首先，用ρΗ9.6 的碳酸盐缓冲液(NaCO3 0.159g，NaHCO3 0.293g，加水至 100ml，pH值为9.6)稀释多肽至I μ g/ml,以100 μ I/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4°C过夜。
[0057]接下来，弃去孔中的液体，0.P/oTBS-T洗涤缓冲液(即含0.l%Tween_20的TBS-T溶液，其配制方法为:NaCl 8.7g, Tris 1.21g，加去离子水至1000ml，pH 7.5，再加入Tween-20 lml)洗漆酶标板5次,每次3min。
[0058]接着，向孔中添加5%BSA/0.05%TBS_T封闭缓冲液(其配制方法为:NaC10.87g，Tris 0.121g,加去离子水至 100ml, pH 7.5,再加入 Tween-20 0.5ml, BSA 5g),每孔300 μ 1，封板膜密封后37°C孵育lh。[0059]接着，添加待测样品。用5%BSA/0.05%TBS_T封闭缓冲液稀释血清，稀释比例为1:100，完全弃去孔中液体，每孔加血清稀释液100 μ 1，每例血清样本3个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知阳性血清，每板设立2个空白对照孔，加入0.P/oTBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后37°C孵育2h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
[0060]接着，进行第二抗体免疫反应。利用5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:5000，每孔加100μ 1，封板膜密封后37°C孵育lh。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
[0061]接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书(例如康为世纪TMB显色试剂盒)，加入显色底物，每孔加入100 μ 1，室温避光条件下显色lOmin，每孔加入50 μ I 2ΜH2SO4终止反应。
[0062]接着，酶标仪492nm波长条件下测定光密度OD值。
[0063]最后，基于所得到的光密度OD值与预定的参考值的区别，确定待测样品是否来自于患有肺癌患者。根据本发明的实施例，可以利用确诊癌症患者和健康人(健康志愿者)的血液样品进行平行试验所得到的数值作为预定的参考值。
[0064]例如，用ELISA方法检测血液样本中的抗UROD的自身抗体水平。如果待测样本中的酶底物显色反应的光密度值高于X+2SD，则待测血清为肺癌疑似患者血清，其中在X+2SD中，X为健康人血清中的酶底物显色反应的光密度平均值，2SD为健康人血清中的酶底物显色反应的光密度值的二倍标准差。具体地，根据本发明的实施例，本发明所采用的X+2SD值是通过下列方法获得的:按照前述利用本发明的多肽检测样品中UROD自身抗体的方法，采用89例健康对照血液样本，测定其酶底物显色反应的OD值，将测得的OD值以单样本K-S检验分析符合正态分布(p>0.05)后，计算获得各OD值的平均值(X=0.15)及标准差(SD=0.07)，则以X+2SD (0.29)为正常值的上限。
[0065]根据本发明的另一方面，本发明还提出了前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肿瘤血清UROD抗体试剂盒中的用途。尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。另外,利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中UROD自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
[0066]为此，根据本发明的再一方面，本发明提出了一种用于检测样品中UROD抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。具体地，根据本发明的实施例，该试剂盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。进一步，该试剂盒可以进一步包括:阴性对照样品，所述阴性对照样品为UROD抗体为阴性的血清，或者/额外地可以进一步包括:标准样品，所述标准样品为UROD抗体浓度分别为lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。根据本发明的实施例，UROD自身抗体识别的抗原多肽的浓度可以为，每个反应孔I μ g/ml。根据本发明的实施例，尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。在本发明的再一方面，本发明提出了前面所述多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的UROD自身抗体。根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样品。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者监控恶性肿瘤例如肺癌的进展。
[0067]在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测样品中UROD自身抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根据本发明的实施例，可以有效地借助根据本发明的多肽对样品中的UROD抗体进行检测。根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括:适于进行ELISA检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的UROD抗体进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD抗体的效率。根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中，例如可以包被96孔板的孔，例如可以通过常规处理如借助包被液和阻滞液进行。由此，可以方便地高通量地进行检测。可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的UROD抗体的效率。试剂盒中还可以包含其他试剂，例如冲洗缓冲液，样品稀释缓冲液，TMB底物溶液，反应终止液，辣根酶标记的二抗，阴性对照样品，标准样品。其中，阴性对照样品为UROD抗体为阴性的血清，标准样品为UROD抗体浓度分别为IU/ml, 5U/ml, 10U/ml, 15U/ml 的血清。
[0068]根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样品。
[0069]需要说明的是，在本文中，有时也将“UR0D自身抗体识别的抗原多肽”简称为“多肽”，将“UR0D自身抗体”简称为“UR0D抗体”。
[0070]下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。
[0071]实施例1多肽的制备
[0072]按照中国肺癌杂志2008年10月第11卷第5期第686~690页的描述，构建噬菌体cDNA展示文库，筛选获得 阳性克隆。将所得到的阳性克隆中插入的cDNA片段编码氨基酸序列制备成多肽芯片(Piptide Array)。
[0073]实施例2筛选与肺癌相关的多肽
[0074]2.1多肽芯片的水化
[0075]首先，将实施例1所制备的多肽芯片浸入40ml 100%乙醇中，摇床上摇5分钟。然后，将该多肽芯片浸入40ml 75%乙醇中，摇床上摇5分钟。接下来，将多肽芯片浸入40ml50%乙醇中，摇床上摇5分钟。接着，加入150ml PBS浸泡30分钟(以膜上的白点完全退色为准)。最后，将多肽芯片浸入40ml 5%脱脂奶粉/PBS-T溶液中，室温下孵育3小时进行封闭。
[0076]2.2多肽阵列与血清反应
[0077]将10例肺癌患者血清等量混合，制备肺癌血清池，用5%脱脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀释制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按0.lml/cm2加反应液，去除袋内所有气泡，封膜机封口，4°C轻轻振荡过夜。
[0078]将10例健康对照血清混合，制备健康对照血清池，用5%脱脂奶粉/PBS-T溶液
I: 1000稀释制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按0.lml/cm2加反应液，去除袋内所有气泡，封膜机封口，4°C轻轻振荡过夜。
[0079]血清免疫反应结束后，剪开杂交袋，弃去反应液，PBS-T 40ml洗多肽芯片6次，每次10分钟，将多肽芯片放入杂交袋内，加1:10000稀释的山羊抗人IgG溶液，按0.lml/cm2加二抗反应液，封好杂交袋，室温下轻轻振荡2小时，40ml PBS-T洗膜3次，每次10分钟，40ml PBS洗膜3次，每次10分钟。
[0080]接下来，进行ECL显影，曝光，将胶片进行扫描，用AlphaView软件系统分析图像。
[0081]2.3 筛选
[0082]根据上述Piptide Array免疫反应结果,挑选与肺癌患者血清反应阳性而与健康对照组血清反应阴性的差异多肽点(序列见表1 )，组成多肽原位Dot-Blot膜，按照实施例1中所述制备方法，制备包含这4条多肽及对照在内的多肽芯片，通过与15例肺癌患者血清进行免疫反应计算各点阳性频度值，确定特异性序列(见下表1)。
[0083]表1
【权利要求】
1.一种UROD自身抗体识别的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段为下列至少之
1)SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
2)SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
3)SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；
4)SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
5)SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ； 6)SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
2.根据权利要求1所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽，其特征在于，所述多肽具有如 ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肿瘤血清UROD抗体试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。
5.一种用于检测样品中UROD抗体的试剂盒，其特征在于，包括: 权利要求1或2所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括: 96孔板，所述96孔板的孔中包被 权利要求1或2所述的UROD自身抗体识别的抗原多肽。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括:阴性对照样品，所述阴性对照样品为UROD抗体为阴性的血清。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括:标准样品，所述标准样品为UROD抗体浓度分别为lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述UROD自身抗体识别的抗原多肽的浓度为，每个反应孔I μ g/ml。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品为肿瘤血清， 任选地，所述肿瘤为肺癌。
【文档编号】G01N33/68GK103848892SQ201210507755
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】岳文涛, 张丽娜, 赵晓婷, 顾勐, 王玥 申请人:北京市结核病胸部肿瘤研究所