专利名称：一种对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法。
背景技术：
肌动蛋白丝(actin filament)由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝,是细胞骨架的主要成分之一。肌动蛋白丝和它的结合蛋白(association protion)以及肌球蛋白 (myosin)三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运动，对细胞贴附、铺展、运动、内吞、细胞分裂等许多细胞功能具有重要作用。在高等动物的生命活动过程中，细胞的定向运动与胚胎发育、伤口愈合、免疫应答、组织发育等活动都密切相关。此外，人类许多重大疾病，如肿瘤发生和转移等，也与细胞运动息息相关。因此，为了直观的观察肌动蛋白丝在行事以上各功能时的结构，各类细胞中肌动蛋白丝的着色观察成为研究的热点。
肌动蛋白丝的着色方法主要有固定染色和显微注射两种，可以阶段性或者持续性地观察肌动蛋白丝的结构变化。因为悬浮细胞个体小，又不能贴壁生长，所以这两种方法都不能对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行很好地标记。为了解决悬浮细胞不贴壁的问题，许多学者虽然做了培养附着基质的改良，比如增加涂层(多聚赖氨酸)，构建三维框架等方法。但是现实中总有一些细胞很难贴壁生长，因此，需要一种能简便、快速的染色方法可以对这类细胞的肌动蛋白丝进行着色。
本人在对紫菜的一种无性生殖孢子(单孢子)的研究过程中发现，这类生殖孢子放散出来后浑圆、没有细胞壁、个体小(直径为10-20μπι)而且在一段时间内(约1-2小时)很难贴壁生长，总是漂浮在海水中。鉴于这类细胞与悬浮细胞的性质相似，因此对于单孢子的染色方法应该可以推广到悬浮动物细胞的染色中。发明内容
由于悬浮细胞在培养过程中很难贴壁生长，不能按照贴壁细胞的着色方法操作， 本发明旨在解决悬浮细胞肌动蛋白丝的染色问题，以便于对悬浮细胞肌动蛋白丝进行观察。
本发明提供一种对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法，包括以下步骤Α)收集悬浮细胞，通过离心的方法对单孢子进行收集，在800 IOOOrpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞；B)配置染色液，用微丝缓冲液稀释肌动蛋白丝的荧光标记物质Alexa Fluor 488 phalloidin至5U mL—1，添加体积百分含量为2%的甘油以增强染色效果，其中所述微丝缓冲液包括IOOmM PIPESUOmMEGTA,5mM MgSO4和0. 3M mannitol，所述微丝缓冲液的pH为6. 9 ；C)将收集到的细胞悬浮到上述染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在800 IOOOrpm条件下离心收集细胞。
本发明还提供一种对使用上述方法进行染色的悬浮细胞的肌动蛋白丝进行观察的方法，其特征在于，用磷酸缓冲液对收集到的细胞重新离心洗涤一次，将再次收 集到的细胞置于载玻片上进行观察。所述磷酸缓冲液浓度为O. 01M, pH为7. 4
为了减少荧光物质的淬灭，在观察时还可以向载玻片上被观察的染色细胞加入体 积百分含量为4%的没食子酸丙酯，其中溶剂使用90%甘油和10%磷酸缓冲液配成的溶 液。
通过实际染色观察发现，发现本发明的技术可以对单孢子的肌动蛋白丝进行很好 的标记，而且离心的过程可以去除细胞碎片和多余的染色液，使观察结果变得更加清晰明 了。
图1a示出的是传统技术中在盖玻片上附着单孢子肌动蛋白丝进行染色后在显微 镜的明场环境下观察的效果图。
图1b示出的是传统技术中在盖玻片上附着单孢子肌动蛋白丝进行染色后在显微 镜的荧光环境下观察的效果图。
图2a示出的是按本发明实施例二提供的方法对单孢子肌动蛋白丝进行离心染色 后在显微镜的明场环境下观察的效果图。
图2b示出的是按本发明实施例二提供的方法对单孢子肌动蛋白丝进行离心染色 后在显微镜的荧光环境下观察的效果图。
具体实施方式
实施例一
本实施例中，通过以下步骤对条斑紫菜单孢子肌动蛋白丝进行染色。具体步骤为 通过离心的方法对单孢子进行收集，在SOOrpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞。用微 丝缓冲液(IOOmM PIPES, IOmM EGTA, 5mMMgS04 and O. 3M mannitol,pH 6.9)稀释肌动蛋白 丝的突光标记物质 AlexaFluor 488phalloidin (Molecular Probes, USA)至 51M71 制成肌 动蛋白丝染色液，另外添加2% (v/v)的甘油以增强染色效果。将收集到的细胞悬浮到上述 染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在SOOrpm条件下离心收集细胞。
实施例二
本实施例中，通过以下步骤对条斑紫菜单孢子肌动蛋白丝进行染色。具体步骤为 通过离心的方法对单孢子进行收集，在900rpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞。用微 丝缓冲液(IOOmM PIPES, IOmM EGTA, 5mMMgS04and O. 3M mannitol, pH 6. 9)稀释肌动蛋白 丝的突光标记物质 Alexa Fluor 488 phalloidin (Molecular Probes, USA)至 51M71 制成 肌动蛋白丝染色液，另外添加2% (v/v)的甘油以增强染色效果。将收集到的细胞悬浮到上 述染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在900rpm条件下离心收集细胞。
实施例三
本实施例中，通过以下步骤对条斑紫菜单孢子肌动蛋白丝进行染色。具体步骤为 通过离心的方法对单孢子进行收集，在IOOOrpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞。用 微丝缓冲液(IOOmM PIPES, IOmM EGTA, 5mMMgS04and 0. 3M mannitol, pH 6. 9)稀释肌动蛋 白丝的突光标记物质 AlexFlour 488phalloidin (Molecular Probes, USA)至 51M71 制成肌 动蛋白丝染色液，另外添加2% (v/v)的甘油以增强染色效果。将收集到的细胞悬浮到上述染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在IOOOrpm条件下离心收集细胞。
对实施例二中收集的细胞进行观察，为了减少观察中荧光物质造成的背景，可以 用磷酸缓冲液对收集到的细胞重新离心洗涤一次，离心速率900rpm，再次收集到的细胞置 于载玻片上观察。为了减少荧光物质的淬灭，加入4%的没食子酸丙酯(溶剂为90%甘油 和10%磷酸缓冲液)。
图la、图1b给出了使用传统的在盖玻片上附着单孢子肌动蛋白丝进行染色之后 的效果图。图2a、图2b给出了本发明实施例二中采用本发明的染色液(Alexa Fluor 488 phalloidin)进行离心染色之后的效果图。通过比较附图可以看出，本发明采用的染色液 (Alexa Fluor 488 phalloidin)和染色技术与常规采用的考马斯亮兰和荧光染色剂FITC 及染色技术相比，对个体较小的细胞和组织的肌动蛋白丝的染色效果更好，可以更清晰的 观察肌动蛋白微丝的结构。分析其原因在于，传统染色方法中，一旦紫菜单孢子悬浮细胞附 着就会开始做变形虫运动，只能从一大堆变形虫运动的细胞中寻找发育迟缓的细胞。而且 这个阶段的细胞已经具有细胞壁，必须固定之后才能染色，所以细胞的结果和颜色均会受 到破坏。而离心收集的细胞发育同步，是浑圆的悬浮细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
权利要求
1.一种对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法，包括以下步骤A)收集悬浮细胞，通过离心的方法对单孢子进行收集，在800 IOOOrpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞；B)配置染色液，用微丝缓冲液稀释肌动蛋白丝的荧光标记物质Alexa Fluor488phalIoidin至5U mL—1，添加体积百分含量为2%的甘油以增强染色效果，其中所述微丝缓冲液包括IOOmM PIPESUOmM EGTA、5mM MgSO4和O. 3Mmannitol，所述微丝缓冲液的pH为6. 9 ;C)将收集到的细胞悬浮到上述染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在 800 IOOOrpm条件下离心收集细胞。
2.一种对使用如权利要求1所述的方法进行染色的悬浮细胞的肌动蛋白丝进行观察的方法，其特征在于，用磷酸缓冲液对收集到的细胞重新离心洗涤一次，将再次收集到的细胞置于载玻片上进行观察。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液浓度为O.01M, pH为7. 4。
4.如权利要求2和3所述的方法，其特征在于，向载玻片上被观察的染色细胞加入体积百分含量为4%的没食子酸丙酯，其中溶剂使用90%甘油和10%磷酸缓冲液配成的溶液
全文摘要
本发明涉及一种对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法。本发明提供的对悬浮细胞的肌动蛋白丝进行染色的方法包括以下步骤A)收集悬浮细胞(条斑紫菜的单孢子)，通过离心的方法对单孢子进行收集，在800～1000rpm条件下离心收集需要染色的悬浮细胞；B)配置染色液，用微丝缓冲液稀释肌动蛋白丝的荧光标记物质Alexa Fluor 488phalloidin至5UmL-1，添加体积百分含量为2％的甘油以增强染色效果，其中所述微丝缓冲液包括100mM PIPES、10mM EGTA、5mM MgSO4和0.3M mannitol，所述微丝缓冲液的pH为6.9；C)将收集到的细胞悬浮到上述染色液中，在室温、黑暗条件下染色10分钟后，重新在800～1000rpm条件下离心收集细胞。本发明提供的染色方法可以对单孢子的肌动蛋白丝进行很好的标记，而且离心的过程可以去除细胞碎片和多余的染色液，使观察结果变得更加清晰明了。
文档编号G01N1/30GK103063499SQ20121050877
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者李琳, 严兴洪 申请人:上海海洋大学