专利名称：一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酸的分析检测方法，具体涉及一种大米脂肪中脂肪酸的检测方法。
背景技术：
脂肪是大米的重要成分，而大米脂肪的主要成分是不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸对人体有诸多益处，具有缓解血液中过量的胆固醇、增强细胞膜透性、阻止心肌组织和动脉硬化等功能。由于脂肪的劣变速度很快，容易发生水解使游离脂肪酸增多，而不饱和脂肪酸容易发生氧化而造成不饱和脂肪酸的减少，从而导致陈化的大米往往酸度增高、香味散失。因此，大米脂肪的脂肪酸的含量和组成可作为大米品质的评价手段。作为啤酒生产中常用的辅料，大米具有降低啤酒生产成本、调整麦汁组分等意义。脂肪酸尤其不饱和脂肪酸对酵母的发酵性能和啤酒品质的影响非常大；因此，测定大米脂肪酸对生产高品质的啤酒有一定的指导意义。
现有技术中有多种手段可用于检测大米脂肪中的脂肪酸，脂肪酸甲酯化可降低汽化温度，提高分离效果，有利于气相色谱法分离并逐一测定其组成和含量。目前，在油脂的甲酯化分析中经常采用的有两种手段(1)将油脂分解成脂肪酸再进行甲酯化；(2)直接把油脂和甲醇进行醇解反应得到甲酯化产物。第一种方法一般是在乙醇液中皂化后，再用无机酸酸化分解，最后用乙醚提取分解出的游离脂肪酸，然后对脂肪酸进行甲酯化。第二种方法常用的有三氟化硼甲酯化法、碱法甲酯化法和酸法甲酯化法，其中三氟化硼催化甲酯化率高，但其毒性强，不易保存，不利操作者使用；酸催化甲酯化油脂则具有反应慢、甲酯化率低以及要求温度高等特点，不适合用于固相微萃取技术。因此，多数方法都或多或少采用了有机溶剂，并且步骤繁琐。回瑞华等利用索氏抽提或有机溶剂提取脂肪后，再进行甲酯化进样，采用GC-MS或GC-FID分析大米油脂的脂肪酸(不同产地稻米油脂中脂肪酸的气相色谱-质谱分析，质谱学报，2008，29 ￠) :349 352)。该方法不但采用了有机溶剂，还必须先将脂肪从待测大米中提取出来，步骤过于繁琐。此外，有研究者向大米直接加入酯化试剂甲酯化，然后添加过量NaCl、水和石油醚分层，将上层液体除水后在氮气的保护下浓缩得到脂肪酸甲酯，最后进样 GC-FID 分析检测(Chemical Composition and Fatty Acid Analysisof Saudi HassawiRice Oryza sativa L ， Pakistan Journal of Biological Sciences，2002，5 (2) :212 214)。该方法避免了脂肪酸的提取步骤，但仍然采用了大量的有机溶剂，而且还要在氮气的保护下浓缩，步骤仍然繁琐，测样时间长，满足不了实际生产中大量检测的需要。专利201110462886. 8公开了 “瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法”，该方法采用了酸催化甲酯化法对样品进行瓶内甲酯化。然而，大米中脂肪含量高，游离脂肪酸少，因此该法采用的酸催化甲酯化法不适用于大米中脂肪酸的分析。由于作为甲酯化试剂的甲醇具有易挥发的特点，因此甲酯化反应在顶空瓶内发生时，甲醇进入顶空部分，导致脂肪酸甲酯化率降低，并影响萃取效果，甚至会发生萃取头对挥发性物质和甲醇的竞争性吸附，不利于脂肪酸甲酯的富集。另外，现有技术中很少有定量检测脂肪酸的报道，其中有文章报道采用内标法定量测定油脂脂肪酸的检出限仅为4. Omg/L (毛细管气相色谱内标法测定沙棘油中的脂肪酸，中国粮油学报，2008，23(1):198 202)。本发明中甲酯化反应以水为基体，甲醇水溶液大大降低甲醇对萃取头的不利影响，碱催化脂肪生成脂肪酸甲酯，之后进入顶空部分，固相微萃取通过涂布在石英纤维表面的高分子涂层完成对脂肪酸甲酯的萃取和预富集，解吸之后利用GC-MS-MS进行分离检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述问题，提供了一种检测大米脂肪的脂肪酸方法，该方法使用溶剂少，步骤简单，检测准确度高，能快速有效测定大米脂肪酸。本发明的技术方案一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，大米样品借助于多功能进样器在顶空瓶内碱催化甲酯化和固相微萃取同时进行，之后进入气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS-MS )检测并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。本发明包括以下步骤①仪器参数的设置a.多功能进样器温度60°C，时间60min，采用85 μ m PA萃取头；b.气相色谱仪DB-225MS毛细管柱，30mX0. 25mmX0. 25μπι;载气为高纯氦气，恒流模式，进样口流量为1. Oml/min，不分流进样；柱温箱在50°C保持2min，然后以5°C /min升温至230°C ；
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c.串联质谱传输线温度250°C，电子轰击离子源(EI)，电子能量为70Ev，离子源温度为200°C，碰撞气(氩气)压力为1. 5mTorr，检测方式采用多反应监测(MRM)；表I串联质谱多反应监测(MRM)模式下各脂肪酸甲酯的检测条件
权利要求
1.一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于大米样品借助于多功能进样器在顶空瓶内碱催化甲酯化和固相微萃取同时进行，之后进入气相色谱-串联质谱联用仪检测，并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述在顶空瓶内同时进行的碱催化甲酯化和固相微萃取步骤包括以下步骤①大米经过旋风磨粉碎三次后，将25mg大米粉溶解在200mL水中，充分搅拌；②取2mL样品稀释液到顶空瓶内，加入IgNaCl和O.75mL llmmol/L的氢氧化钾/甲醇甲酯化试剂，旋紧顶空瓶盖；③自动进样器将样品瓶移动到保温箱内，插入85μ m PA萃取头，使其在60°C、250r/min震荡条件下边甲酯化边萃取lh。
3.根据权利要求2所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述碱催化甲酯化反应以水为基体，所述水是经过超纯水系统处理得到的，所述超纯水系统为Mill1-Q超纯水系统。
4.根据权利要求2所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述大米经过旋风磨粉碎三次，颗粒细度能够通过120目筛，所述旋风磨为Cyclotec 1093旋风磨。
5.根据权利要求1所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述气相色谱-串联质谱联用仪的检测步骤为①进样条件PA萃取头移入气相色谱-串联质谱联用仪的进样口，在250°C下解吸2min,不分流进样；②色谱条件DB-225MS毛细管柱，30mX0.25mmX0. 25 μ m ;载气为高纯氦气，恒流模式，进样口流量为1. Oml/min ;柱温箱在50°C保持2min，然后以5°C /min升温至230°C ；③串联质谱条件传输线温度250°C，电子轰击离子源，电子能量为70Ev，离子源温度为200°C,碰撞气压力为1. 5mTorr,所述碰撞气为気气；测定方式米用多反应监测。
6.根据权利要求3所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述多反应监测的条件为①肉豆蘧酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯，均选择质荷比为74(母离子)和43 (子离子)的离子对作为定量离子对，质荷比为87 (母离子)和55 (子离子)的离子对为定性离子对，所述质荷比为43的子离子是采用5Ev的碰撞能量轰击所述质荷比为74的母离子得到，所述质荷比为55的子离子是采用IOEv的碰撞能量轰击所述质荷比为87的母离子得到；②油酸甲酯选择质荷比为74(母离子)和43 (子离子)的离子对作为定量离子对，质荷比为69 (母离子)和41 (子离子)的离子对为定性离子对，所述质荷比为43的子离子是采用5Ev的碰撞能量轰击所述质荷比为74的母离子得到，所述质荷比为41的子离子是采用IOEv的碰撞能量轰击所述质荷比为69的母离子得到；③亚油酸甲酯选择质荷比为81(母离子)和79 (子离子)的离子对作为定量离子对，质荷比为67 (母离子)和41 (子离子)的离子对为定性离子对，所述质荷比为79的子离子是采用IOEv的碰撞能量轰击所述质荷比为81的母离子得到，所述质荷比为41的子离子是采用IOEv的碰撞能量轰击所述质荷比为67的母离子得到；④亚麻酸甲酯选择质荷比为67(母离子)和41 (子离子)的离子对作为定量离子对，质荷比为67 (母离子)和39 (子离子)的离子对为定性离子对，所述质荷比为41的子离子是采用IOEv的碰撞能量轰击所述质荷比为67的母离子得到，所述质荷比为39的子离子是采用15Ev的碰撞能量轰击所述质荷比为67的母离子得到。
7.根据权利要求1所述的一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述定量分析大米脂肪中脂肪酸含量的步骤包括 ①绘制标准曲线 a.称取适量的三肉豆蘧酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三油酸甘油酯、三亚油酸甘油酯和三亚麻酸甘油酯，用甲苯配制成不同浓度的混标溶液； b.取2mL样品溶液到顶空瓶内，加入IgNaCl和O.75mL llmmol/L的氢氧化钾/甲醇甲酯化试剂，添加10 μ L混标溶液到顶空瓶内，使其浓度梯度为O. 5 μ g/L、2. 5 μ g/L、12.5 μ g/L、50 μ g/L 和 100 μ g/L ； c.顶空瓶旋紧瓶盖后移送至60°C的保温箱内，插入85μ m PA萃取头，完成吸附后，将萃取头插入气相色谱仪进样口，并在250°C下解吸2min保证完全解吸； d.采用仪器检测后，以不加混标的样品为空白，分别测定加标后各脂肪酸甲酯的峰面积，扣除空白后，以加标后各组分的峰面积增加值为y，加标量为X，绘制一条标准曲线，标准曲线强制过原点； ②通过标准曲线和待测样品的检测结果计算大米中各种甘油三酯的含量； ③采用公式(I)换算得到大米脂肪中脂肪酸的含量
全文摘要
一种检测大米脂肪中脂肪酸含量的方法，大米样品借助于多功能进样器在顶空瓶内碱催化甲酯化和固相微萃取同时进行，之后进入气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS-MS)检测并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。本发明采用在线甲酯化固相微萃取与气相色谱-串联质谱联用技术，在一个过程中同时完成了甲酯化、萃取、富集、进样和检测五个步骤，操作简单，耗时短；而且在甲酯化反应中以水为基体，降低了萃取头对甲醇与挥发性物质的竞争性吸附，有效提高了固相微萃取对脂肪酸甲酯的萃取和预富集；脂肪酸最低检测限为0.001~0.049μg/L，明显低于采用内标法定量测定油脂脂肪酸的最低检出限4.0mg/L。
文档编号G01N30/88GK103048414SQ201210525239
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月8日 优先权日2012年12月8日
发明者樊伟, 董建军, 郝俊光, 陆健, 陈华磊, 杨理章, 闫鹏, 田玉红, 张宇昕, 杨朝霞 申请人:青岛啤酒股份有限公司