专利名称：一种观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用GFP融合蛋白处理水稻根尖观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，具体涉及一种利用融合GFP的稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物处理水稻根尖0.5cm处，激光共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白从根尖0.5cm处转运至水稻叶芽的方法，属于植物保护和细胞生物学领域。
背景技术：
病原细菌是通过III型分泌系统转运效应子，其转运机制研究得较为清楚。但对于丝状真菌来说，尽管诸如吸器等专化的侵染结构参与了效应蛋白的转运，但其效应蛋白是如何被转运进入寄主细胞仍然未知。卵菌效应蛋白都具有一个保守的基序即RXLR，该基序位于 目号妝下游并且参与效应蛋白在寄主细胞内的转运。许多研究表明，RXLR基序在卵菌效应蛋白转运进入寄主细胞中起作用。绿色突光蛋白(green fluorescence protein, GFP)作为基因标记已经完全应用于微观定位和数量性状的测定，利用原核表达技术构建效应蛋白基因与GFP基因融合的原核表达载体，通过化学方法诱导融合蛋白表达，利用融合蛋白处理水稻根尖，将融合蛋白处理过根尖的水稻植株的叶芽进行冷冻切片，用荧光染料对切片进行染色，共聚焦显微镜观测效应蛋白在水稻植株体内的转运。稻瘟病菌效应蛋白能在水稻根组织内的转运已有报道，但目前还没有关于稻瘟病菌蛋白在水稻植株体内转运，即从水稻根尖转运至叶芽的报道
发明内容
本发明的目的是克服现有技术之不足，而提供一种快速、简便、准确的用GFP融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处，叶芽进行冷冻切片，PI荧光染料进行切片染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽的方法。本发明的技术方案是:一种观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，该方法将GFP融合蛋白处理水稻根尖后，处理过根尖的水稻植株叶芽进行冷冻切片，PI荧光染料进行切片染色后，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽。进一步，该方法的具体步骤是:5.0mg/ml的GFP融合蛋白处理种子发芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm处24h，灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片进行染色，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运；将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液悬浮菌体；在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5.0mg/ml的浓度处理种子发芽至14天的黑谷幼嫩植株的根尖0.5cm处24h，灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运。共聚焦显微镜观测到GFP融合蛋白已经从水稻根尖转运到叶芽。进一步，缓冲液为20mM Tris-HCl,pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;IOmMβ -巯基乙醇。本发明的有益效果在于:1、方法简便、准确、快速。2、利用GFP融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处，叶芽被冷冻切片后PI染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽，能直接定性地了解GFP融合蛋白在水稻植株内的长距离转运情况。3、GFP融合蛋白直接处理水稻根尖0.5cm处，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白转运至叶芽可为进一步开展效应蛋白能引起水稻系统防御反应提供非常强有力的证据。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。5.0mg/ml的GFP融合蛋白处理种子发芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm处24h，灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片进行染色，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运。将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;IOmMβ -巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5.0mg/ml (含25mM MES)的浓度处理种子发芽至14天的丽江新团黑谷幼嫩植株的根尖
0.5cm处24h，灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运。共聚焦显微镜观测到GFP融合蛋白已经从水稻根尖转运到叶芽。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，其特征在于，该方法将GFP融合蛋白处理水稻根尖后，处理过根尖的水稻植株叶芽进行冷冻切片，切片后PI荧光染料进行染色，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽。
2.如权利要求1所述的观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，其特征在于，该方法的具体步骤是: 5.0mg/ml的GFP融合蛋白处理种子发芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm处24h,灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片进行染色，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运； 将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液悬浮菌体； 在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。
处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5.0mg/ml的浓度处理种子发芽至14天的黑谷幼嫩植株的根尖0.5cm处24h，灭菌水漂洗4h，叶芽进行冷冻切片，PI对切片染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白在水稻植株内的转运。共聚焦显微镜观测到GFP融合蛋白已经从水稻根尖转运到叶芽。
3.如权利要求1所述的观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，其特征在于，缓冲液为 20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;10πιΜβ -巯基乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种观测融合蛋白长距离转运至水稻叶芽的方法，该方法将GFP融合蛋白处理水稻根尖后，处理过根尖的水稻植株叶芽进行冷冻切片，切片后PI荧光染料进行染色，共聚焦显微镜直接观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽。该方法利用GFP融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处，叶芽被冷冻切片后PI染色，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽，能直接定性地了解GFP融合蛋白在水稻植株内的长距离转运情况。GFP融合蛋白直接处理水稻根尖0.5cm处，共聚焦显微镜观测GFP融合蛋白转运至叶芽可为进一步开展效应蛋白能引起水稻系统防御反应提供非常强有力的证据。该方法简便、准确、快速。
文档编号G01N21/64GK103175810SQ20121055473
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者杨静, 李成云, 刘林, 朱有勇, 杜云龙, 徐畅, 施竹凤 申请人:云南农业大学