基于亲水作用机理富集糖肽的酰胺型整体柱及制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种糖肽富集专用的酰胺型整体柱的制备和应用。所述的整体柱采用带有酰胺功能基团的单体和交联剂，加入适当比例的致孔剂和引发剂，通过快速光聚的方法在紫外透明石英毛细管中制备的整体柱。该类整体柱具有制作简单快速、结构稳定均一、亲水性较好、酰胺功能基团多等优点，本发明的整体柱可以实现对微量生物样品中糖肽的基于亲水作用机理的柱上富集。在生物样品糖蛋白预处理和在线糖蛋白分析平台的构建方面具有很好的实用价值和应用前景。
【专利说明】基于亲水作用机理富集糖肽的酰胺型整体柱及制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖肽富集装置，即一种基于亲水作用机理富集糖肽的酰胺型整体柱及其制备和在生物样品糖蛋白预处理技术中的应用。
【背景技术】
[0002]在蛋白质组学的研究领域中，蛋白质的组成和结构对其功能的影响一直受到人们的关注，尤其是对于翻译后修饰的蛋白来说，不同的修饰位点和修饰基团对蛋白的功能产生巨大的影响，但是因其本身低丰度和高复杂程度的特点而成为蛋白质组学中的研究热点和难点。
[0003]糖蛋白是一类具有重要生物学意义的蛋白，在细胞运输、信号传导、免疫调节、生物应激性等生物过程中都有着不可或缺的作用，并且还是一些疾病的生物标志物和临床治疗靶标。作为糖蛋白研究中的一项重要技术，采用质谱对糖蛋白的糖基化位点信息和糖链结构的解析使得人们对糖蛋白的结构和功能探索有了进一步的认识。但是糖蛋白丰度较低，酶解后产生的糖肽占总肽段的比例小，在质谱鉴定过程中糖肽信息容易被其他肽段信息所掩盖，因此在样品预处理过程中，必须要对糖蛋白和糖肽进行有效地富集。
[0004]目前常用的糖肽富集方法包括了酰肼氧化法、硼酸功能化材料富集和亲水作用色谱。其中亲水作用色谱主要是利用糖链部分所带来的糖肽与非糖肽在亲水性上的差异，从而实现糖肽的选择性富集，此方法的特点是可以在不破坏糖肽本身结构的基础上，对各种具有不同类型糖链的糖肽进行普适性的富集，同时操作条件温和，且与后续液相-质谱联用系统兼容。近年来，很多课题组都发展了不同类型的基于亲水作用色谱的材料，包括商品化琼脂糖凝胶颗粒、亲水型聚合物微球、和表面亲水修饰磁球等(S e I man，M.H.，McDonnell,L.A.，Palmbladj Μ.，Ruhaakj L.R.，Deelderj A.Μ.，Wuhrerj Μ.，Anal.Chem.20 10, 82，1073 - 1081.Yuj L.Li, X.Guoj Ζ.Zhang, X.Liang, X.Chem.Eur.J.2009，15，12618-12626 ;Yeh，C.H.Chen, S.Η.Li, D.Τ.Linj H.P.Huang, H.J.Chang, C.1.Shihj W.L Chernj C.L Shij F.K.Hsuj J.L J.Chromatogr.A2012，1224，70-78 ；)，这些材料的合成过程或操作流程相对来说比较繁琐，同时离线操作进行糖肽的富集会带来不可避免的样品损失和时间消耗。进而，研究人员利用不同的材料发展了很多糖肽富集的装置来克服上述问题，包括商品化的填充柱、开管柱和固相微萃取装置(SPE tips)等(Lam，M.P.，Siuj S.0.，Lauj E.，Maoj X.，Sun，H.Z.，Chiu, P.C.，Yeungj W.S.，Coxj D.M.，Chuj 1.K.，Anal.Bioanal.Chem.2010，398，791-804 ；Luo, Q.，Rejtarj T.，Wuj S.L，Kargerj B.L，J.Chromatogr.A.2009，1216，1223 - 1231 ;Zhu，J.Wang, F.Chen, R.Cheng, K.Xuj B.Guoj Z.Liang, X.Yej M.Zouj H.，Anal.Chem.2012，84，5146-5153)。
【发明内容】
[0005]针对目前研究存在的问题，本发明的目的在于发展一种快速制备的糖肽富集专用的酰胺型整体柱，通过亲水作用机理实现对糖肽良好的选择性富集，能够实现柱上操作，减少样品的损失和实验时间。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]以N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酰胺为单体，N, N’ -亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，在适当比例的致孔剂的条件下和适当溶剂体系中，通过光照聚合的方式在紫外透明石英毛细管中形成整体材料，从而快速制备得到一种基于亲水作用机理富集糖肽的酰胺型整体柱。
[0008]所述酰胺型整体柱制备的具体步骤如下:
[0009]I)将摩尔比0.5:1-1.5:1的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和丙烯酰胺(AM)作为单体，加入摩尔量为单体量的50%-200%的N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，同时加入质量比0.5:1-2:1的致孔剂1，4-丁二醇和十二醇，混合溶液中交联剂和致孔剂的质量比为1:5-1:10，以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，其加入量为单体和交联剂总质量的0.5%_2%，混合均匀后，再将二甲基亚砜加入到上述溶液中，使其体积分数为30%-70%，振荡至澄清，通入30秒至90秒的N2 ；
[0010]2)将混合溶液通入透光毛细管中，紫外光照射条件下，反应5-20分钟；
[0011 ] 3)反应结束后用乙腈(ACN)清洗毛细管内的柱体，即可获得酰胺型整体柱。
[0012]制得的酰胺型整体柱可以用于糖肽亲水机理选择性富集，其技术方法的具体步骤如下:
[0013]I)称取Img的蛋白样品，经过变性、还原烷基化和酶解之后，溶于lmL85%-75%ACN(含0.1%FA)溶液中；
[0014]2)截取IOcm酰胺型整体柱，将2 μ L上述lmg/mL蛋白酶解产物，用85%_75%ACN(含 0.1%FA)以 0.25-2 μ L/min 的流速上样，冲洗 10_30min ；
[0015]3)采用70%_50%ACN (含0.1%FA)的溶液对糖肽进行洗脱，收集洗脱下来的富集产物，直接进行质谱分析。
[0016]本发明具有如下优点:
[0017]1.本发明中的酰胺型整体柱，制备简单快速，结构稳定均一，通透性好，同时具有良好的亲水性和与液质联用系统的兼容性。
[0018]2.本发明使用的两种单体和交联剂的亲水性都比较好，酰胺基团同时存在于所采用的单体和交联剂中，保证了制备的整体柱上能够有足够的酰胺功能基团用于糖肽的亲水机理富集，提高了其选择性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为酰胺型整体柱制备流程图。
[0020]图2为整体柱的扫描电镜表征图，a和b的放大倍数分别为1000和5000倍。
[0021]图3-1为酰胺型整体柱对2 μ g人血清免疫球蛋白(IgG)中糖肽富集效果图，a和b分别为原样和富集产物。
[0022]图3-2为图3-1中富集产物在质荷比为2500-3500范围内的放大图。
[0023]图4-1为酰胺型整体柱对糖蛋白(人血清免疫球蛋白，IgG)和非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的混合溶液中(质量比为1:1)糖肽的富集效果图，a和b分别为原样和富集产物。
[0024]图4-2为图4-1中富集产物在质荷比为2500-3500范围内的放大图。[0025]图5-1为酰胺型整体柱对糖蛋白(人血清免疫球蛋白，IgG)和非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的混合溶液中(质量比为1:100000)糖肽的富集效果图，a和b分别为原样和富集产物。
[0026]图5-2为图5-1中富集产物在质荷比为2500-3500范围内的放大图。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]1.酰胺型整体柱的制备
[0029]如图1所示，称取11.5mg丙烯酰胺、22.2mg N-乙烯基吡咯烷酮和56mgN，N’ -亚甲基双丙烯酰胺，加入420 μ L 二甲基亚砜，振荡溶解至澄清后，再加入0.9mg偶氮二异丁腈，混合至澄清；加入0.15gl, 4- 丁二醇和0.3g十二醇，混合均匀之后，通入N230秒除去溶液中的O2，将该溶液灌入到12cm长的紫外透明石英毛细管中，两端用硅胶封口。在365nm紫外光照射下，反应15min。取出毛细管，通入乙腈Ih左右，除去未反应的物质，从而制得酰胺型整体柱。
[0030]2.整体柱材料内部表征
[0031]扫描电镜图如图2所示，制备的整体柱结构稳定均一，整体材料贴壁紧密，从放大后的图中能够观察到多级孔结构的存在。
[0032]实施例2
[0033]1.标准蛋白样品预处理
[0034]称取Img人血清免疫球蛋白(IgG)溶于lmL20mM碳酸氢铵溶液中，90°C下加热反应1011^11，冷却至室温后，再加入41^现二硫苏糖醇溶液(用20mM碳酸氢铵溶液配制)，在56°C下加热反应1.5h ;冷却至室温后，加入8 μ LlM碘乙酰胺溶液(用20mM碳酸氢铵溶液配制)，在室温下避光反应40min。反应结束后,加入40 μ Llmg/mL的胰蛋白酶溶液(用20mM碳酸氢铵溶液配制)，37°C下加热反应20h，之后加入适量甲酸(FA)使溶液的pH在2-3左右以终止反应，最后得到lmg/mL标准蛋白酶解产物。
[0035]采用C18预柱对上述酶解产物进行除盐、冻干，最后将样品溶解在lmL80%ACN (含
0.1%FA)中。
[0036]2.糖肽的柱上富集
[0037]截取IOcm酰胺型整体柱，将2 μ L上述lmg/mL标准蛋白酶解产物，用80%ACN (含
0.1%FA)以I μ L/min的流速上样，冲洗20min，然后采用70%ACN (含0.1%FA)的条件对糖肽进行洗脱lOmin，收集洗脱下来的富集产物，直接进行质谱分析。
[0038]3.MALD1-TOF MS (基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析
[0039]将IyL富集产物与lyL2，5-二羟基苯甲酸(DHB)基质(20mg/mL DHB溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。MALD1-TOF MS 实验是在 Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上进行，检测时采用线性反射正离子模式。如图3-lb所示，IgG中的糖肽信号强度较原液(图 3-la)显著提高，通过对比文献(Yu, L.Li, X.Guo, Z.Zhang, X.Liang, X.Chem.Eur.J.2009, 15，12618-12626)，经酰胺型整体柱富集之后，一共得到信噪比大于3的糖肽18条(图3-2)，且大部分非糖肽都得到了去除，表明材料具有较好的糖肽富集能力和选择性。[0040]实施例3
[0041]1.BSA酶解产物干扰下的糖肽选择性富集
[0042]将制备好的lmg/mL IgG和BSA酶解产物(溶于含0.1%FA的80%ACN中)按质量比1:1和1:100000混合，截取IOcm酰胺型整体柱，上样2 μ L上述标准蛋白酶解产物的混合溶液，用80%ACN (含0.1%FA)冲洗30min，然后采用70%ACN (含0.1%FA)的条件对糖肽进行洗脱lOmin，收集洗脱下来的富集产物，直接进行MALD1-TOF MS分析。
[0043]2.MALD1-TOF MS 分析
[0044]将I μ L富集产物与I μ LDHB基质(20mg/mL DHB溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次点于MALDI祀板上,待样品点干燥后进行质谱鉴定。如图4-1、4-2和图5_1、5-2所示，质量比为1:1的混合样品经酰胺型整体柱富集之后，该整体材料能够选择性的富集到IgG中的10条糖肽(图4-2)，同时排除了大部分BSA酶解肽段的干扰。进一步增大干扰比例到1:100000，仍能够选择性的富集到IgG中的6条糖肽(图5-2)，证明了该整体柱良好的抗干扰能力和在实际样品中应用价值。
[0045]该类整体柱具有制作简单快速、结构稳定均一、亲水性较好、酰胺功能基团多等优点，本发明的整体柱可以实现对微量糖蛋白样品中糖肽的基于亲水作用机理的柱上富集。在糖蛋白样品预处理和在线糖蛋白分析平台的构建方面具有很好的实用价值和应用前景。
【权利要求】
1.基于亲水作用机理富集糖肽的酰胺型整体柱，其特征在于:采用具有酰胺功能基团的单体和交联剂，加入致孔剂和引发剂，通过光引发聚合的方法在紫外透明石英毛细管中制备结构均一且稳定的整体柱，所带有的酰胺基团具有良好的亲水性。
2.按照权利要求1所述的整体柱，其特征在于:所述的紫外透明石英毛细管为50-150 μ m内径的紫外透明石英毛细管。
3.—种权利要求1所述酰胺型整体柱的制备方法，其特征在于:将聚合物混合溶液均匀引入紫外透明毛细管中，通过原位光引发聚合的方式，在毛细管中形成具有中空多孔结构的整体材料； 具体步骤为: 1)将单体、交联剂、致孔剂和引发剂的混合溶液加入到溶剂体系中，振荡混匀，混合液通入30秒至90秒的N2 ； 所述单体为摩尔比0.5:1-1.5:1的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和丙烯酰胺(AM)，所述交联剂为N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，混合溶液中单体和交联剂的摩尔比为0.5:1-2:1 ;所述溶剂体系为二甲基亚砜，在反应溶液中所占体积为混合液总体积的30%-70% ； 2)将混合液通入紫外透明毛细管中，紫外光照射条件下，反应5-20分钟； 3)反应结束后用乙腈(ACN)清洗毛细管内的柱体，即可获得酰胺型整体柱。
4.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于:所述引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，其加入量为单体和交联剂总质量的0.5%-2%。
5.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于:所述致孔剂为1，4-丁二醇和十二醇，两者之间的质量比为0.5:1-2:1，混合溶液中交联剂和致孔剂的质量比为1:5-1:10。
6.一种权利要求1所述酰胺型整体柱的应用,酰胺型整体柱用于生物样品中糖肽的富集。
【文档编号】G01N1/40GK103877955SQ201210560167
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】张丽华, 蒋好, 袁辉明, 梁玉, 杨开广, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所