专利名称:一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其 制备方法和检测方法技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和纳米磁微 粒化学发光测定技术的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法。本 发明还特别涉及该试剂盒的制备方法。
背景技术:
甲状腺素,即3,5,3’,5’ -四碘甲状腺原氨酸(T4)是一种分子量为777的甲状腺 激素。T4在循环中有结合态和游离态两种形式,正常情况下两种形式之间保持着动态平衡。 循环中T4有75%与甲状腺结合球蛋白(TBG)结合,15%与前白蛋白,10%与白蛋白结合。游 离T4(FT4)仅占O. 03%,却发挥着真正的生理作用。妊娠期、肝炎、先天性TBG增高、服用雌 激素(口服避孕药)等引起TBG浓度增高时,总T3、T4的浓度也随之升高。肾病、肝功能衰 竭、先天性TBG缺乏、服用雄激素或大剂量糖皮质激素引起TBG浓度降低时,总Τ3、Τ4的浓 度也随之降低。这些情况下测定总Τ3、Τ4不能准确反映甲状腺的功能状态。游离Τ3、游离 Τ4的水平受到影响程度较小,因此很多情况下测定游离态的甲状腺激素能更好的了解甲状 腺功能。
FT4是目前医院开展的常规免疫检测项目,对甲状腺疾病的诊断有无可替代的重 要参考价值。目前我国已批准上市的FT4免疫检测试剂有进口和国产两大类,其中进口试 剂有雅培等跨国定量检测公司的产品,采用的方法学多为化学发光,而国产试剂中采用的 方法学多数为放免法,近两年开始出现化学发光类产品。
放免分析法存在线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。而纳米磁微 粒化学发光测定法具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便,自动化程度高等优势。目前 纳米磁微粒化学发光测定技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。
然而,在实际的免疫检测中,由于待测样品中所含的杂质成分较多,一定程度上影 响了检测灵敏度和准确性,所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物,是临床 检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作载体,以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗 原等各种免疫活性物质,具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细 胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点,在外加磁场作用下可定向运动,使得某些 特殊成分得以分离、浓集或纯化。
中国发明专利公开CN101639481A公开了一种了游离甲状腺素的磁微粒纳米磁微 粒化学发光测定试剂盒,该试剂盒包括游离甲状腺素系列校准品,抗异硫氰酸荧光素单克 隆抗体包被的磁微粒溶液,异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液,辣根过氧化物 酶标记的游离甲状腺素,化学发光底物液,浓缩洗涤液。该试剂盒中抗异硫氰酸荧光素单克 隆抗体包被的磁微粒溶液、异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液以及辣根过氧化 物酶标记的游离甲状腺素构成免疫反应步骤用的免疫反应试剂。该试剂盒虽然能够实现快速、准确地检测,但是其中,辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素的制备过程非常繁琐,工艺稳定性不好,且标记率低,限制其检测效果特别是分析间精密度和导致成本增加。发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,其能够以较低的成本制备得到,且能够实现游离甲状腺素准确和高精确地定量测定。
本发明同时还提供一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法,该方法工艺稳定,成本低,且所得试剂盒的精密度特别是分析间精密度高。
为解决以上技术问题,本发明采取的一种技术方案是
一种游离甲状腺素(FT4)的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,其包括用于免疫反应步骤的免疫反应试剂,该免疫反应试剂包括含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液和包被有抗荧光素(FITC)抗体的磁微粒的悬浮液,其特征在于所述的免疫反应试剂还包括含有碱性磷酸酶(ALP)标记的游离甲状腺素抗原的溶液,该碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与游离甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。
进一步地,所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的pH为7 9,其中的荧光素标记的游离甲状腺抗体的浓度为O. 5 1 μ g/mL。所述的含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的PH为7 9,其中碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的浓度为O.02^0.1 μ g/mL。
根据本发明,所述的含有荧光素标记的抗游离甲状腺素抗体能够通过成熟和稳定的工艺容易地制备。
根据本发明,所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒的制备也是较为容易的,且现有技术已有成熟的制备工艺可以参照。例如可以通过常规的物理吸附或化学偶联包被方式制备,没有特别限制。作为本发明的一种优选实施方案该包被有抗荧光素抗体的磁微粒中, 抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒中,抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。
本领域技术人员应知晓,本发明的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试剂,例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制,因此,虽然试剂盒中可以包括这些试剂,但它们对于本发明试剂盒来说并非必不可少。
本发明采取的又一技术方案是一种上述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法,其包括分别制备所述含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液、 所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液以及包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤,其中所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的制备过程如下
①使游离甲状腺素抗原与交联剂 辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中,在室温下反应,使生成甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物,于疒8°C下保存备用,其中所述的游离甲状腺素抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ;
②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1. Γ1. 3的比例混合,在室温下反应, 使生成所述碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原,反应结束,将反应液通过G-25凝胶柱除盐,选择具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH值即得,其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为O.5 L 5mg/mL。
根据一个具体方面,步骤①中,取游离甲状腺素抗原,加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL,加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯,室温反应2 3小时,用二甲基亚砜将反应液1:10稀释,于2 8°C下保存备用。
根据又一具体方面,步骤②中,取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液,用PHflO的碳酸氢钠缓冲液稀释至O. 5^1. 5mg/mL,加入步骤①所得反应液,室温静置反应2(T60min。
在一个具体的实施方式中,步骤②中,将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1. 2 的比例混合。
进一步地,所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的制备方法如下配制含有荧光素的pH为9 10的缓冲液,然后按照荧光素与抗游离甲状腺素抗体的分子比为 20^200:1的比例,将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与抗游离甲状腺素抗体的pH为 9^10的缓冲液混合,混匀后,室温静置反应,然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离,除去游离的荧光素,得到含有荧光素标记的抗游离甲状腺素抗体的溶液,接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH,即得。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。
进一步地,所述的包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的制备方法如下使含有羧基活性基团的磁微粒与抗荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下,室温反应疒18小时,反应结束,磁分离,去上清,用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度,即得,其中所述的磁微粒具有超顺磁性,其直径为O. 5 2μπι,每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4mmol ;所述的抗荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体,纯度大于等于90wt%,稀释效价大于1:100万。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的 TRIS缓冲液。
优选地,上述的具有适当pH值的缓冲液为含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS 缓冲液。
本发明所述的荧光素可以是已知的各种荧光素,常用的有例如异硫氰酸荧光素, 四乙基罗丹明,四甲基异硫氰酸罗丹明等。
本发明的试剂盒应用于化学发光免疫检测时的步骤与传统的检测方法一样,即包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤。
优选地,所述的免疫反应步骤具体实施如下在检测样管中加入待测样本原液或稀释液,然后依次加入含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶 液、含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液,混匀,在25 40 °C下进行第一次温育,然后加入包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液,混匀,在25 40°C下进行第二次温育;所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。
进一步地,所述第一次温育的时间可以为l(T20min,通常为15min ;第二次温育的时间可以为3 15min,通常为5min。
上述的使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤均可参照常规方法实施,所用的设备以及装置也是常规的。其中,碱性磷酸酶化学发光底物溶液对于本领域人员来说也是已知的,可商购获得。
由于以上技术方案的实施,本发明与现有技术相比具有如下优点
1.申请人发现,采取辛二酸二琥珀酰亚胺酯作为交联剂进行碱性磷酸酶和游离甲状腺素抗原的偶联时,具有和其它交联剂相比更高的偶联效率,在降低制备成本的同时,有利于提高检测效果。因此,本发明的试剂盒中的三种试剂均可以通过稳定的制备工艺制备得到,生产成本低,且由于制备工艺的稳定性,试剂盒分析批间差小,检测的分析间精密度提闻;
2.本发明的试剂盒中的含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的制备方法,能够有效将游离甲状腺素抗原与碱性磷酸酶偶联,偶联效率高,进一步降低试剂盒的成本低和确保试剂盒的检测效果。
3、采取本发明的试剂盒进行检测,准确度好,精密度高,灵敏度高,检测范围宽,样品无序预稀释,操作简单省时。与采用进口试剂盒进行检测的方法相比,本发明的检测方法在成本上具有显著的优势。
图1为测试校准品标准曲线;
图2为灵敏度评价拟合曲线;
图3为血清样本检测结果相关性(其中横坐标X为实施例4制备得的试剂盒样本测值,浓度单位为pg/mL,纵坐标y为雅培公司试剂盒样本测值,浓度单位为pg/mL)。
具体实施方式
为描述方便,下文中,用第一试剂、第二试剂以及磁分离试剂分别代表本发明中的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液、含有碱性磷酸酶(ALP)标记的游离甲状腺素抗原的溶液和包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
实施例1第一试剂的制备
(I)材料与仪器以磷酸盐缓冲液保存的抗FT4单克隆抗体(纯度超过95wt%,浓度为2mg/mL);异硫氰酸荧光素(FITC),碳酸氢钠等试剂应达到化学纯;G_25凝胶纯化柱采购自GE公司。
(2)制备步骤
①用O. Γ0. 2mol/L pH9. (TlO. O的碳酸盐缓冲液配制O. 5mg/mL的FITC溶液;
②按照FT4抗体与FITC分子比为1:20的比例在抗体溶液中加入步骤①所配FITC 溶液,混合均匀,室温静置12h小时,反应生成FT4抗体-FITC连接物;
③将经过步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离,除去未反应的FITC,得到含有FT4抗体-FITC连接物(即FITC标记的FT4抗体)的溶液;
④将步骤③所得含有FT4抗体-FITC连接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) PH8. O的O. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到FT4抗体-FITC连接物浓度为O. 5 I μ g/mL, pH为即为第一试剂。
实施例2第二试剂的制备
(I)材料与仪器FT4抗原(固体粉末,纯度超过95%);以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶(ALP溶液,ALP纯度为约99%,比活性为约1500U/mg,浓度为10mg/mL);偶联剂DSS购自THERMO公司,TRIS等化学试剂应达到化学纯;G_25凝胶纯化柱为GE公司产品。
(2)制备步骤
①取Img FT4抗原,加入DMSO溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL,加入DSSO. 5mg, 室温反应2小时,用DMSO将反应液1:10稀释,2-8°C保存备用;
②取Img的ALP溶液,用O.1M ρΗ9· 5的NaHCO3缓冲液将ALP溶液稀释到Img/ mL,稀释后的ALP缓冲液中加入步骤①制备的FT4-DMS0溶液进行连接反应,加入FT4-DMS0 溶液体积为ALP缓冲液体积的1/20,室温静置反应30min,用G-25凝胶柱除盐,2_8°C保存备用;
③将步骤②的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH8. O的O. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到O. 02 O.1 μ g/mL和pH9 10,即为第二试剂。
实施例3磁分离试剂的制备
(I)材料与仪器
磁微粒的悬浮液 磁微粒含量5wt%,磁微粒含羧基(COOH)活性集团,每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩尔(mmol ),具有超顺磁性,直径在0. 5-2 μ m之间
抗FITC抗体可以是多克隆抗体,也可以是单克隆抗体,纯度为90wt%以上,稀释效价超过1:100万;
2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、TRIS和其他试剂应达到化学纯。
(2)制备步骤
①取IOOmg磁微粒的悬浮液,磁分离去上清,用0. 05mol/L, pH4. 5 5MES缓冲液 IOmL重悬;
②加入2 4mg的抗FITC抗体,室温混悬3(T60min ;
③加入0. 5 ImL新鲜配制的10mg/mL的EDC水溶液,室温混悬2 12h ;
④磁分离,去上清,用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0. lmol/L的TRIS缓冲液重悬到lmg/mL, pH8. O,即为磁分离试剂。
实施例4游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒
该试剂盒包括
按照实施例1方法制备的第一试剂(浓度为0. 75 μ g/mL), 50mL ;
按照实施例2方法制备的第二试剂(浓度为0. 05 μ g/mL), 50mL ;
按照实施例3方法制备的磁力分离试剂50mL。
实施例5游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒
该试剂盒包括
按照实施例1方法制备的第一试剂(浓度为0. 5 μ g/mL), 5mL ;
按照实施例2方法制备的第二试剂(浓度为0. 02 μ g/mL), 5mL ;
按照实施例3方法制备的磁力分离试剂5mL。实施例6采取实施例4的试剂盒进行游离甲状腺素的定量检测(1)检测步骤①免疫反应在检测管中加入30 U 1待测样本(血清或血衆)原液,然后加入50 U 1 第一试剂,50iU第二试剂,混匀,37±1°C条件下温育15min ;加入50 yl磁分离试剂,混匀, 37±1°C条件下温育5min ;②洗涤使磁微粒在磁场中沉降,去除上清,加入600 yl的清洗液,去除磁场,震 荡使磁微粒充分混悬,然后磁分离,去除上清。此步骤重复3次;③加底物溶液检测发光强度在检测管中加入150 U 1碱性磷酸酶化学发光底物 溶液(北京阿匹斯生物技术有限公司APCL- I ),震荡使磁微粒充分混悬,检测单位时间内发 光强度。(2)绘制校准品标准曲线校准品标准曲线参见图1。(3)灵敏度评价检测“0”浓度样本,重复检测20次,计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准 差(SD),并计算M-2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归 拟合得出一次方程,将M-2SD值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限。本 方法的灵敏度不大于2pg/mL。其中A点发光值分别参见表1 :表权利要求
1.一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,所述试剂盒包括用于免疫反应步骤的免疫反应试剂,所述的免疫反应试剂包括含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液和包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液,其特征在于所述的免疫反应试剂还包括含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液,该碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与游离甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。
2.根据权利要求1所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,其特征在于所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的pH为7 9,其中的荧光素标记的游离甲状腺抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,其特征在于所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒中,抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。
4.根据权利要求1或2所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒,其特征在于所述的含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的PH为7 9,其中碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/mL。
5.—种如权利要求广4中任一项权利要求所述的游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法,其包括分别制备所述含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液以及所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤,其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液的制备过程如下①使游离甲状腺素抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中,在室温下反应,使生成甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物,于疒8°C下保存备用, 其中所述的游离甲状腺素抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ;②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1. Γ1. 3的比例混合,在室温下反应,使生成所述碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原,反应结束,将反应液通过G-25凝胶柱除盐, 选择具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH值即得,其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为O.5 L 5mg/mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤①中,取游离甲状腺素抗原,加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL,加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯,室温反应2 3小时,用二甲基亚砜将反应液1:10稀释,于疒8°C下保存备用。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于步骤②中,取浓度大于等于5mg/ mL的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液,用pH 9^10的碳酸氢钠缓冲液稀释至O. 5^1. 5mg/mL,加入步骤①所得反应液,室温静置反应2(T60min。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述的含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液的制备方法如下配制含有荧光素的PH为扩10的缓冲液,然后按照荧光素与抗游离甲状腺素抗体的分子比为2(Γ200:1的比例,将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与抗游离甲状腺素抗体的pH为9 10的缓冲液混合,混匀后,室温静置反应,然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离,除去游离的荧光素,得到含有荧光素标记的抗游离甲状腺素抗体的溶液,接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH,即得。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述的包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的制备方法如下使含有羧基活性基团的磁微粒与抗荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下,室温反应2 18小时,反应结束,磁分离,去上清,用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度,即得,其中所述的磁微粒具有超顺磁性,其直径为O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4mmol ;所述的抗荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体,纯度大于等于90wt%,稀释效价大于1:100万。
10.根据权利要求5或8或9所述的制备方法,其特征在于所述的具有适当pH值的缓冲液为含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。
全文摘要
本发明涉及一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法,试剂盒包括含有荧光素标记的游离甲状腺抗体的溶液、包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液,以及含有碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原的溶液,该碱性磷酸酶标记的游离甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与游离甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。本发明使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对游离甲状腺素进行定量检测。
文档编号G01N33/78GK103063852SQ20121057130
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者于大为, 程晓蕾, 李冬冬 申请人:苏州浩欧博生物医药有限公司