专利名称：特异性抗小鼠tigit的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一株抗小鼠TIGIT(全称T cell Ig and ITIM domain)的单克隆抗体。具体地说，涉及到对TIGIT有特异性的单克隆抗体，本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的制备方法及应用。
背景技术：
天然杀伤细胞(即，NK细胞)作为主要的天然免疫细胞，在机体杀伤病毒感染细胞以及肿瘤细胞方面起着重要的作用，NK细胞通过其表面不同的活化型受体和抑制型受体来控制NK细胞的活化、增殖和杀伤等功能。TIGIT (T cell Ig and ITIM domain)分子是2009年新发现表达在NK细胞表面的抑制性受体，主要包含胞外IgV-样结构域,跨膜区和胞内ITIM基序(Immunoreceptortyrosine-based inhibitor y motif),以高亲和力结合配体 PVR(poliovirus receptor),并通过胞内ITIM基序传递抑制信号，从而抑制NK细胞的杀伤功能，与活化性受体CD226/CD96协同调控NK细胞的活化与功能。在黑色瘤荷瘤小鼠中，TIGIT表达上调，肿瘤细胞又高表达配体PVR，并且TIGIT结合PVR的能力远高于⑶226/⑶96，这使得NK细胞活性受到抑制，会造成肿瘤免疫耐受，导致肿瘤免疫逃逸。真核表达mTIGIT-hFc融合蛋白，免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤IR983F细胞融合，筛选出能分泌对mTIGIT有反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，且其抗体能高效阻断mTIGIT与配体mPVR的结合，从杂交瘤培养上清中或者从腹腔接种杂交瘤细胞的裸鼠腹水中获取单克隆抗体。制备mTIGIT阻断性单克隆抗体，为mTIGIT分子的检测以及mTIGIT功能的研究提供了基础，该抗体可广泛用于分子免疫学的研究中，并且可作为打破肿瘤免疫耐受的潜在治疗工具。
发明内容
本发明的一个目的是提供对小鼠TIGIT (mTIGIT)有特异性的单克隆抗体。本发明的再一个目的是提供产生特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体用于检测mTIGIT的应用，所述单克隆抗体能够阻断mTIGIT与其配体PVR的结合,能通过用于Western blot、ELISA或FlowCytometry 检测 mTIGIT。本发明的一个方面涉及一种对mTIGIT有特异性的单克隆抗体以及其制备方法，所述抗体的类型为IgG2a，K，并且能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。
本发明的另外一个方面涉及一株稳定分泌mTIGIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其命名为mTIGIT-mAb-13G6，保藏编号为CCTCC NO:C201299，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉，武汉大学，邮编:430072)。本发明的另外一个方面涉及筛选能够表达特异性结合小鼠TIGIT的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，所述方法包括:mTIGIT与人Fe的融合蛋白mTIGIT-hFc的表达与纯化，用mTIGIT-hFc免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤IR983F细胞融合，筛选杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体能特异性高亲和mTIGIT-hFc，将筛选得到的细胞株命名为mTIGIT-mAb-13G6，保藏编号为CCTCC NO:C201299。由细胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌的抗小鼠TIGIT单克隆抗体能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。另外，本发明所述的抗小鼠TIGIT单克隆抗体也称为13G6单克隆抗体。本发明的一个优选方面涉及制备抗小鼠TIGIT单克隆抗体的方法，所述方法包括从保藏号为CCTCC NO:C201299的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb_13G6培养上清中或者从腹腔接种所述杂交瘤细胞株的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。本发明的另一方面涉及单克隆抗体对mTIGIT和mPVR结合的阻断作用。用本发明的单克隆抗体检测阻断效率，结果显示，单克隆抗体能高效的阻断mTIGIT与mPVR的结合。本发明的另一方面涉及单克隆抗体在Western blot检测mTIGIT中应用。用本发明的单克隆抗体鉴定mTIGIT蛋白的表达，Western blot实验显示:单克隆抗体能在Western blot水平用于检测mTIGIT-hFc融合蛋白。本发明的另一方面涉及单克隆抗体在ELISA水平检测mTIGIT的应用。用本发明的单克隆抗体检测不同浓度的mTIGIT-hFc，结果显示:单克隆抗体能用于ELISA检测mTIGIT-hFc 蛋白。本发明的另一方面涉及单克隆抗体能用于Flow Cytometry检测mTIGIT。用本发明的单克隆抗体标记可以用于标记mTIGIT阳性细胞，而不标记mTIGIT阴性细胞。表明本发明的单克隆抗体能用于Flow Cytometry检测mTIGIT的表达。本发明还涉及本发明的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体在制备用于检测mTIGIT的试剂盒中的应用，所述试剂盒利用本发明所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体通过Westernblot、ELISA 或 Flow Cytometry 来检测 mTIGIT。本发明还涉及一种检测mTIGIT的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体。本发明还涉及一种检测mTIGIT的方法，所述方法包括下述步骤:(I)将本发明的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育，(2)判断是否有阳性反应。其中所述阳性反应是指本发明的特异性抗mTIGIT抗体与待测样品中mTIGIT的结合，所述阳性反应可以通过免疫印记、ELISA或流式细胞术检测进行判断。本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。术语“单克隆抗体的反 应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。根据本发明的公开，选择mTIGIT-hFc融合蛋白，按照本文描述的方法制备有特异性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的，应该视为包含在本发明的范围内。综上所述，本发明的有益效果在于:本发明提供了一种抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的制备方法、鉴定及应用，该单克隆抗体具有效价高，特异性好等优点，且能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合，适用于不同标本的检测。本发明提供的单克隆抗体，可以广泛用于Western blot、ELISA、f1wCytometry等不同手段检测mTIGIT蛋白，为研究mTIGIT的功能提供了基础。缩略语的含义:mTIGIT:小鼠 TIGIT(T cell Ig and ITIM domain)mPVR:小鼠 PVR(poliovirus receptor),小鼠 TIGIT 的配体
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:图1，载体 pcDNA3-mTIGIT_hFc 的构建。图2，mTIGIT-hFc融合蛋白表达、纯化及鉴定，其中:图2A，mTIGIT-hFc融合蛋白纯化的鉴定结果；图2B, mTIGIT-hFc 融合蛋白的 Western blot 鉴定结果；图3，本发明的单克隆抗体纯度鉴定结果。图4，本发明的单克隆抗体特异性鉴定结果，其中:图4A, Flow cytometry方法鉴定单克隆抗体对mTIGIT特异性的结果；l)293T-mTIGIT/hTIGIT/mCD226/mCD96 阳性率检测2)本发明的单克隆抗体不识别细胞表面的hTIGIT/⑶226/⑶96分子图4B，间接ELISA法验证单克隆抗体对mTIGIT的特异性的结果；图4C, Western blot方法鉴定单克隆抗体对mTIGIT特异性的结果。图5，本发明的单克隆抗体阻断功能的鉴定结果，其中:图5A，293T-mPVR转染效率检测；图5B，本发明的单克隆抗体高效阻断293T-mPVR和mTIGIT-hFc蛋白的结合；图6,本发明的单克隆抗体用于Western blot检测mTIGIT的结果。图7，本发明的单克隆抗体用于ELISA检测mTIGIT的结果。图8，本发明的单克隆抗体用于FACS检测mTIGIT的结果。A.本发明的单克隆抗体检测293A-mTIGIT细胞表面的mTIGIT ；
B.商品化的流式抗体(Ant1-Mouse TIGIT Alexa IHliOrCR' 647, eBioscience, Cat.N0.50-9501)检测 293A-mTIGIT 细胞表面的 mTIGIT。保藏说明分泌特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉，武汉大学，邮编:430072)，保藏编号为 CCTCC NO:C201299。
序列表说明
权利要求
1.一种特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体，所述抗体由保藏号为CCTCC N0:C201299的大鼠杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌产生。
2.按照权利要求1所述的抗体,其亚型为IgG2a，K。
3.按照权利要求1所述的抗体，其能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。
4.产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6，其保藏号为CCTCC NO:C201299o
5.制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括从保藏号为CCTCCC201299的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6培养上清中或者从腹腔接种所述杂交瘤细胞株的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。
6.权利要求1的单克隆抗体在制备用于检测mTIGIT的试剂盒中的应用，所述试剂盒利用权利要求1的单克隆抗体通过Western blot、ELISA或Flow Cytometry来检测mTIGIT。
7.一种检测mTIGIT的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体。
8.一种检测mTIGIT的方法，所述方法包括下述步骤:(1)将权利要求1所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育；(2)判断是否有阳性反应。
9.根据权利要求8的方法，其中所述阳性反应通过免疫印记、ELISA或流式细胞术检测进行判断。
全文摘要
本发明涉及一种抗小鼠TIGIT的单克隆抗体，本发明还涉及生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6(保藏编号CCTCC NOC201299)，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及应用，本发明的单克隆抗体能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合，可以用于Western blot、ELISA、Flow Cytometry检测mTIGIT分子。
文档编号G01N33/577GK103073644SQ201210590618
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者孙汭, 毕嘉成, 张清, 郑晓东, 田志刚, 魏海明 申请人:中国科学技术大学