专利名称：一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种具降血糖功能制剂的检测方法，特别是指一种以L-阿拉伯糖与壳寡糖为主要原料制成的复方制剂检测方法，属于对食品或保健食品进行质量控制的技术领域。
背景技术：
一种具有降血糖功能制剂是本申请人研制的一种由以L-阿拉伯糖与壳寡糖为主要原料制成的复方制剂，参见本申请人于2012-09-10申请的申请号为201210333553X名称为一种具有辅助降血糖功能的组合物及其制品的专利申请，壳寡糖是由2-20个D-氨基葡萄糖通过β -1, 4糖苷键组成的水溶性低聚糖，是壳聚糖经化学或酶降解后的产物，L-阿拉伯糖为戊醛单糖，通常与其他单糖结合，以杂多糖形式广泛地存在于植物中。临床实验证明，两者均有降血糖作用，将壳寡糖与L-阿拉伯糖进行联合服用具有协同作用，通过结合壳寡糖的促进人体胰岛素分泌、增加胰岛受体敏感性作用，与L-阿拉伯糖抑制蔗糖降解、降低葡萄糖吸收作用相结合，起到双向调节作用，可有效地将血糖值控制在人体正常范围内。质量标准对产品安全稳定、质量可控有着重要的意义,本品为复方制剂,对产品中功效成分进行定性或定量测定，将提高产品质量的可控度，保证产品疗效。鉴于目前尚无制剂中壳寡糖鉴别方法、L-阿拉伯糖含量测定方法，本发明将首次建立制剂中壳寡糖鉴别方法及L-阿拉伯糖含量测定方法。
发明内容
本发明所述的一种含有L-阿拉伯糖与壳寡糖、具降血糖功能制剂的质量控制方法，包括性状、检查、鉴别和含量测定，其中鉴别将采用化学显色法和薄层色谱法对制剂中壳寡糖进行鉴别，含量测定采用高效液相色谱法对衍生化的L-阿拉伯糖进行检测。经文献查询及实验研究发现，本品原料壳寡糖为多糖类成分，无法提供标准品，故无法进行含量测定，但其分子结构中有特征性的游离氨基，因而可以对水解后产生的特有氨基葡萄糖进行Elson — Morgan法鉴别及薄层鉴别，专属性强。L-阿拉伯糖可以采用高效液相法进行含量测定，但采用高效液相-示差检测器、高效液相-蒸发光检测器法进行测定时，多糖壳寡糖对L-阿拉伯糖的测定存在严重干扰，而采用柱前衍生-高效液相-紫外分光光度计进行测定时，可以有效的降低含量测定的干扰。—种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，该制剂以L-阿拉伯糖与壳寡糖为主要原料提取制成，分别对L-阿拉伯糖与壳寡糖进行定量测定和定性鉴别，其中，对L-阿拉伯糖的定量测定方法如下:向待测试样中加入氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液进行衍生化反应，反应结束后加入适量盐酸中和，滤膜过滤后进行高效液相色谱测定；
对壳寡糖的定性鉴别采用化学显色鉴别或薄层色谱鉴别。所述高效液相色谱测定的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，O.1-ο. 2mol/L pH5. 0-6. O醋酸铵缓冲溶液-乙腈为流动相，醋酸铵缓冲溶液_乙腈的体积比为 80-70 20 :30，检测波长为 244-252nm。所述反应样品溶液中L-阿拉伯糖浓度为O. 0133mol/L时，氢氧化钠溶液的浓度为O. 07-0. 15mol/L,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液浓度为O. 2-0. 4mol/L,即控制氢氧化钠、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和L-阿拉伯糖三者的摩尔比为5. 22-11. 18
11.21-22. 43 :1。所述衍生化反应条件为60-80°C水浴中反应至少30min，每10_20min振摇一次。所述化学显色鉴别方法为根据壳寡糖酸性条件下与乙酰丙酮缩合形成生色原2-甲基-3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再与对-二甲基苯甲醛在浓盐酸甲醇溶液中发生络合反应，生成紫色溶液，从而进行鉴别。所述薄层色谱鉴别方法是以盐酸水解后的壳寡糖为供试品，盐酸氨基葡萄糖为对照品，以体积比7-9:3-1的甲醇氨水为展开剂，茚三酮试液为显色剂的薄层色谱鉴别方法。本发明建立的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，根据壳寡糖分子中特征氨基基团进行化学显色法鉴别，或以盐酸氨基葡萄糖为对照品对水解后的壳寡糖进行薄层鉴别，对制剂中L-阿拉伯糖采用衍生化后，采用高效液相色谱-紫外光谱法进行测定，可实现对具有降血糖功能制剂的良好质量控制。
附图1为本发明的化学显色鉴别试验图谱，其中I为空白溶剂，2为阴性空白，3为对照品溶液，4为供试品溶液(批号20120501)，5为供试品溶液(批号20120502)，6为供试品溶液(批号=20120503)；附图2为本发明的薄层色谱鉴别图谱，其中I为对照品溶液，2为制剂样品溶液，3为壳寡糖原料溶液，4为壳寡糖未水解溶液制备，5为阴性对照溶液制备；附图3为本发明的含量测定系统适应性试验-对照品溶液图谱，其中I为衍生试剂峰，2为衍生化L-阿拉伯糖峰；附图4为本发明的含量测定系统适应性试验-供试品溶液图谱，其中I为衍生试剂峰，2为衍生化L-阿拉伯糖峰；附图5为本发明的含量测定系统适应性试验-阴性对照溶液图谱，其中I为衍生试剂峰；图6为具体实施方式
的4. 4节中L-阿拉伯糖含量线性范围图。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例一一种具有降血糖功能制剂的化学显色鉴别法考察壳寡糖的鉴别实验参照Elson-Morgan法进行,并加以改进。其原理是壳寡糖经盐酸水解可生成氨基葡萄糖单糖，氨基葡萄糖结构中的游离氨基在碱性条件下与乙酰丙酮缩合形成生色原2-甲基3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再与P-DABA (对-二甲氨基苯甲醛)在浓盐酸甲醇溶液中发生络合反应，生成紫色溶液。试验方法供试品溶液制备取本品内容物O. lg，置具塞试管中，加盐酸3ml，密塞，水浴加热3小时，冷却至室温后，加水IOml分次洗涤蒸发皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，滤过，滤液合并至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。对照品溶液制备取氨基葡萄糖盐酸盐对照品适量，加水制成每Iml含O. 5mg的溶液，作为对照品溶液。阴性对照溶液制备取缺壳寡糖样品(即L-阿拉伯糖)O. 05g，置具塞试管中，力口盐酸3ml，密塞，水浴加热3小时，冷却至室温后，加水IOml分次洗涤蒸发皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，滤过，滤液合并至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5ml分别置具塞试管中，另取具塞试管I支，加蒸馏水5ml作为溶剂空白，各加乙酰丙酮试液(取乙酰丙酮2ml，加
O.5mol/L碳酸钠溶液至50ml，临用前配置)1. 0ml，摇匀，置沸水浴中，加热25分钟，取出，用冰水迅速冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液(对二甲氨基苯甲醛O. Sg,加无醛乙醇15ml及盐酸15ml,摇勻)1. Oml,即可。根据实验结果，供试品溶液与对照品谱，均显紫红色，阴性对照溶液与空白试剂均未显色，故本方法可用于壳寡糖的鉴别。结果见图1。根据上述化学显色鉴别法考察结果，制定一种具有降血糖功能制剂中壳寡糖化学显色鉴别方法如下取本品内容物O. lg，置具塞试管中，加盐酸3ml，密塞，水浴加热3小时，冷却至室温后，加水IOml分次洗涤蒸发皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，滤过，滤液合并至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，取5ml置具塞试管中，加乙酰丙酮试液(取乙酰丙酮2ml，加O. 5mol/L碳酸钠溶液至50ml，临用前配置)1. Oml，摇匀，置沸水浴中，加热25分钟，取出，用冰水迅速冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液(对二甲氨基苯甲醛O. Sg，加无醛乙醇15ml及盐酸15ml,摇勻)1. Oml,即显紫红色。实施例二一种具有降血糖功能制剂的薄层色谱鉴别法考察对壳寡糖水解产物氨基葡萄糖进行薄层色谱法鉴别，以盐酸氨基葡萄糖对照品，由于结构中2位羟基被氨基取代，而呈现碱性，因而采用甲醇/浓氨水、氯仿/甲醇/浓氨水等展开剂系统进行考察，结果以甲醇/浓氨水为展开系统分离度好，斑点清晰，展开效果好，制剂样品色谱中、壳寡糖原料色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且缺壳寡糖的阴性对照色谱、未水解壳寡糖色谱中无干扰，图谱见附图2。实验方法如下对照品溶液制备取盐酸氨基葡萄糖对照品，加水制成每Iml含5mg的溶液，作为对照品溶液。制剂样品溶液制备取本品内容物O. lg，置具塞试管中，加盐酸3ml，密塞，水浴加热3小时，冷却至室温后，加水IOml分次洗涤蒸发皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，滤过，滤液合并至50ml量瓶中，取20ml浓缩至5ml，即得。
壳寡糖原料溶液制备取壳寡糖0.05g，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得。壳寡糖未水解溶液制备取壳寡糖0.05g,置具塞试管中，按制剂样品溶液制备方法制备，即得。阴性对照溶液制备取缺壳寡糖的阴性对照样品(即L-阿拉伯糖)0.05g，按制剂样品溶液制备方法制备，即得。 点样对照品溶液、制剂样品溶液、壳寡糖原料溶液、壳寡糖未水解溶液和阴性对照溶液各2 μ I薄层板硅胶G板展开剂甲醇:浓氨水=9: I展开方式展开剂预平衡30分钟，上行展开定位取出，晾干，105°C烘3分钟，喷以茚三酮试液，105°C下烘干，置日光下检视。根据上述薄层色谱鉴别法考察结果，制定一种具有降血糖功能制剂中壳寡糖薄层鉴别方法如下:取本品内容物0.lg，置具塞试管中，加盐酸3ml，密塞，水浴加热3小时，冷却至室温后，加水IOml分次洗涤蒸发皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，滤过，滤液合并至50ml量瓶中，取20ml浓缩至5ml，作为供试品溶液；同时取盐酸氨基葡萄糖对照品，加水制成每Iml含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，甲醇-氨水(9:1)为展开剂，展开，取出，晾干，105°C下烘3分钟，喷以茚三酮试液，105°C下烘干，置日光下检视，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的紫色斑点。实施例三一种具有降血糖功能制剂的含量测定方法选择研究目前并没有针对制剂中L-阿拉伯糖的定量测定方法及标准，考虑糖类可经衍生化后转变成具有紫外吸收的物质，使原本难以检测的成分可以用常用的紫外检测器进行检测，本专利首次针对制剂中L-阿拉伯糖采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化处理，对样品前处理过程中衍生试剂用量、反应温度、反应时间、碱用量、有机试剂萃取次数等衍生条件进行了考察，结合高效液相色谱法，得出L-阿拉伯糖含量测定条件。3.1液相条件及检测波长的选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，分别对①水-乙腈(75:25)②0.15mol/L(pH5.5)醋酸铵缓冲溶液-乙腈(75:25)③0.lmol/L(pH6.5)磷酸盐缓冲溶液三种流动相体系进行考察，采用DAD检测器。样品前处理方法:精密称取0.2g L-阿拉伯糖置IOOml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，取2ml置具塞试管中，加入0.lmol/L NaOH溶液2ml，再加入0.2mol/LPMP甲醇溶液1.5ml，控制反应温度为70°C，反应60min，期间每20min振摇一次，反应结束后放入冷水中冷却至室温，并加入0.lmol/L HCL溶液2.5ml中和，用水洗至IOOml容量瓶中，并用水定容至刻度，微孔滤膜过滤后，取10μ I注入色谱仪，记录色谱图，同时以试剂为空白同法测定。实验结果显示，在醋酸铵缓冲溶液-乙腈流动性体系条件下，L-阿拉伯糖衍生峰系统适应性最佳，理论塔板数大于4000，与衍生试剂峰分离度大于1.5，因而选择0.15mol/L(pH5.5)醋酸铵缓冲溶液-乙腈(75:25)为液相测定方法。同时根据DAD全波长扫描结果，L-阿拉伯糖色谱峰在248nm处有最大吸收，实验结果表明本液相条件适用于L-阿拉伯糖衍生峰的含量测定，检测波长为248nm。3.2衍生试剂去除考察衍生反应完成后通常需使用有机溶剂萃取多余的衍生试剂，以消除衍生试剂对样品测定色谱峰的干扰。本实验对衍生反应结束后试液的氯仿萃取过程进行考察。取0.2gL-阿拉伯糖溶于IOOml水中，取2ml置具塞试管中，加入0.lmol/L NaOH溶液2ml，再加入
0.2mol/L PMP甲醇溶液1.5ml，控制反应温度为70°C，反应60min，期间每20min振摇一次，反应结束后加入适量HCL中和，用水洗至50ml容量瓶中，并用水定容至刻度，取IOml置分液漏斗中，分别用氯仿IOml萃取一次和两次后，水溶液蒸干，用水溶解并稀释定容至25ml容量瓶中，采用HPLC分析，取未萃取溶液10ml，用水稀释定容至25ml容量瓶中，采用HPLC分析，结果见表1。表1萃取次数-去除率/回收率考察[0057权利要求
1.一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，该制剂以L-阿拉伯糖与壳寡糖为主要原料提取制成，其特征在于:分别对L-阿拉伯糖与壳寡糖进行定量测定和定性鉴别，其中，对L-阿拉伯糖的定量测定方法如下:向待测试样中加入氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液进行衍生化反应，反应结束后加入适量盐酸中和，滤膜过滤后进行高效液相色谱测定；对壳寡糖的定性鉴别采用化学显色鉴别或薄层色谱鉴别。
2.如权利要求1所述的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，其特征在于:所述高效液相色谱测定的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1-0.2mol/LpH5.0-6.0醋酸铵缓冲溶液-乙腈为流动相，醋酸铵缓冲溶液-乙腈的体积比为80-70:20:30，检测波长为244-252nm。
3.如权利要求1所述的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，其特征在于:所述衍生化反应过程中，控制氢氧化钠、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和L-阿拉伯糖三者的摩尔比为 5.22-11.18:11.21-22.43:1。
4.如权利要求1所述的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，其特征在于:所述衍生化反应条件为:60-80°C水浴中反应至少30min，每10-20min振摇一次。
5.如权利要求1所述的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，其特征在于:所述化学显色鉴别方法为根据壳寡糖酸性条件下与乙酰丙酮缩合形成生色原2-甲基-3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再与对-二甲基苯甲醛在浓盐酸甲醇溶液中发生络合反应，生成紫色溶液，从而进行鉴别。
6.如权利要求1 所述的一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，其特征在于:所述薄层色谱鉴别方法是以盐酸水解后的壳寡糖为供试品，盐酸氨基葡萄糖为对照品，以体积比7-9:3-1的甲醇:氨水为展开剂，茚三酮试液为显色剂的薄层色谱鉴别方法。
全文摘要
一种具有降血糖功能制剂的质量控制方法，该制剂以L-阿拉伯糖与壳寡糖为主要原料提取制成，分别对L-阿拉伯糖与壳寡糖进行定量测定和定性鉴别，其中，对L-阿拉伯糖的定量测定方法如下向待测试样中加入氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液进行衍生化反应，反应结束后加入适量盐酸中和，滤膜过滤后进行高效液相色谱测定；对壳寡糖的定性鉴别采用化学显色鉴别或薄层色谱鉴别，可实现对具有降血糖功能制剂的良好质量控制。
文档编号G01N30/90GK103076325SQ201210592158
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者李仲树, 周丽娟, 赖荣胜, 王英, 李新南, 傅珊珊 申请人:厦门金日制药有限公司