专利名称：检测呋喃妥因代谢物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒，特别是检测动物组织中呋喃妥因代谢物的试剂盒。
背景技术：
呋喃妥因，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示 物。目前用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS、LC-MS/MS)等，这些方法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及食品加工企业对检测方法检测限的要求。目前常用的免疫分析法主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测呋喃妥因代谢物的试剂盒。本实用新型的试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括微孔试剂条和8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞，其中冻干有呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4-7mm处，试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。本实用新型试剂盒中的试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果I、灵敏度高。呋喃妥因代谢物检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对呋喃妥因代谢物的检测灵敏度为I μ g/L。2、操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入微孔中，室温(20-25°C )孵育5min后观察结果。3、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸条以显示红色线“I”及“I I”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示被检测样本液中呋喃妥因代谢物的含量高于或等于试剂盒对呋喃妥因代谢物的最低检测限，两条红线“ 11 ”印迹 表示被检测样本中呋喃妥因代谢物的含量低于试剂盒对呋喃妥因代谢物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、呋喃妥因代谢物检测试剂盒的组装制备⑴试纸条样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，检测线4包被有呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂条[0025]微孔试剂条8具有微孔塞9，板孔中冻干有呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将(I)试纸条和(2)微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。二、试剂盒的使用(I)样品前处理取(5. 0±0. 05) g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml 10%三氯乙酸，再加入100 μ I衍生化试剂(向装有151mg 2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至10ml)，充分振荡3min，在60°C放置I. 5h ;取出依次加入Iml O. 5mol/L磷酸氢二钾溶液、I. 5ml 2mol/L氢氧化钠溶液和IOml乙酸乙酯，振荡10s，脂肪含量高的样本轻微振荡8 10下；3000g以上，室温(20 25°C )离心5min ;取8ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干，加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入O. 6ml O. 2mol/L磷酸盐缓冲液，涡动IOs充分混匀；3000g以上，室温(20 25°C )离心5min，除去上层有机相，取下层100 μ I用于分析。(2)用试剂盒检测用微量移液器吸取100 μ I待检样品溶液到微孔试剂中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入微孔中，室温(20 25°C )孵育5min后观察结果。三、检测结果分析呋喃妥因代谢物在样本中的含量高于或等于试剂盒对其的最低检测限时，呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物与呋喃妥因代谢物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红色线“I”，判为阳性，如图4. a所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸条以显示红色线“ 11 ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图4. C、4. d所示。四、检测试剂盒中用到的材料制备方法I、呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定呋喃妥因代谢物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。(I)呋喃妥因代谢物半抗原合成取呋喃妥因代谢物(AHD) I. 15g和20ml N，N_二甲基甲酰胺(DMF)混合，得到A液；取对苯二甲醛2. 68 5. 36g和50 100ml DMF混合，得到B液；室温下将A液缓慢滴加入B液中，滴加完毕后室温至60V反应2 4h，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色物质，即为呋喃妥因代谢物半抗原。[0042](2)免疫原的制备——呋喃妥因代谢物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成取呋喃妥因代谢物半抗原12mg用Iml DMF溶解，得到溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA) 40mg用6ml水溶解，得到溶液II ;将溶液I滴加入溶液II中，室温反应24h，得到溶液III ;取NaBH4Hmg用O. 2ml O. lmol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4°C反应2h ;用O. 01mol/L PBS4°C透析3d,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装,于_20°C保存备用。(3)包被原的制备——呋喃妥因代谢物半抗原与卵清蛋白偶联物合成取呋喃妥因代谢物半抗原IOmg用Iml DMF溶解，得到溶液I ;取卵清蛋白(OVA) 36mg用7ml水溶解，得到溶液II ;将溶液I滴加入溶液II中，室温反应24h，得到溶液III ;取NaBH416mg用O. 2ml O. lmol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4 °C反应2h ;用O. 01mol/L PBS 4°C透析3d,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20°C保存备用。(4)呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、呋喃妥因代谢物半抗原、呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物用ρΗ7· 4的PBS配成0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200 SOOnm范围内扫描，得到载体蛋白、呋喃妥因代谢物半抗原、呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联成功。2、呋喃妥因代谢物单克隆抗体的制备(I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8 I (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌呋喃妥因代谢物单克隆抗体的呋喃妥因代谢物单克隆杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备[0062]用双蒸去离子水将1%氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成O. 01 % (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1%柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BGl I-AR-01KG)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用O. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7. 2,按每毫升胶体金溶液中加入50 100 μ g的标准向胶体金溶液中加入上述呋喃妥因代谢物单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOmin后，加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min,4 离心40min,弃上清液,沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. I % O. 3 % (体积百分含量)、吐温-800. 05 % 0.2% (质量百分含量)、ρΗ7· 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。·5、将呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度_50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、ρΗ7·2、0· lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将呋喃妥因代谢物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为l.Oyg/cm2 ;用O. 01mol/L>pH7. 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上具有包被有呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂中冻干有呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
专利摘要本实用新型提供了一种检测呋喃妥因代谢物的试剂盒，试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，呋喃妥因代谢物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中。反应膜上具有包被有呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“|”。本实用新型试剂盒具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在呋喃妥因代谢物残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/00GK202649188SQ20122014062
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者万宇平, 冯才伟, 孙震, 赵正苗, 冯才茂, 冯静, 余厚美, 崔廷婷, 罗贵昆 申请人:北京勤邦生物技术有限公司