专利名称：一种基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于蛋白质分离领域的具有亲和性分离功能的透射电镜支持膜
背景技术：
人类基因组测序的完成并不足以使人们解释及推测细胞的各种生命现象，细胞的活性及功能是蛋白质之间的相互作用完成的。蛋白质之间通过相互作用形成蛋白质复合物，从而决定生物体的复杂功能。从分子水平揭示蛋白质复合物的三维结构是蛋白质相互作用研究中的核心方向，这对于理解生物调控机制等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机制、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供了重要的理论基础。[I]然而，当今蛋白质复合物结构的研究在很大程度上取决于其技术方法水平的高低。人体内的蛋白质有10万种以上，而蛋白质之间通过相互作用而形成的复合物则有上千万种之多。目前，世界上对于蛋白质复合物的结构研究工作刚刚起步，绝大多数蛋白质复合物的结构并没有获得解析。其主要原因为大多数蛋白质复合物不稳定，在分离过程中容易分解。当前的主要的蛋白质纯化方法为色谱法和亲和性分离，其中色谱法使用柱层析进行分离，耗时长[3];而使用亲和性分离法，如链酶亲和素-生物素，NTA-6His相互作用，需要较为强烈的洗脱条件，大多数蛋白质之间的相互作用为瞬时作用，其作用力较为薄弱因而蛋白质复合物不稳定，随时间和环境的变化而发生解离，导致获得高纯度的目标蛋白质复合物成为一个难题，这已经成为阻碍该领域发展的一个瓶颈。如何克服该瓶颈，开发出快速纯化蛋白质的方法以用于结构表征，是目前该领域方法学研究中的一个新问题。透射电镜单粒子分析是解决蛋白质复合物三维结构的一种有效手段，该方法是将蛋白质在各个角度的二维图像通过三维重建的方法还原为三维结构。这种方法过程简单，不需要像X射线衍射分析法(XRD)那样需要结晶过程；该方法也不像NMR—样，需要大量的蛋白质样品(毫克级)。因此该方法是一种可以解决蛋白质复合物三维结构的有效方法。2010年，刘遵峰等提出使用链酶未和素修饰石墨稀，可用作生物素标记的蛋白质的快速分离，不需要经过淋洗等步骤，便可将其应用于透射电镜单粒子分析。[4]然而，该方法存在很大的缺陷，就是石墨烯具有很强的吸附能力，用作蛋白质分离时，石墨烯表面对杂质蛋白的非专一性吸附能力很强，因此纯化的纯度不能够保证。对石墨烯表面使用聚乙二醇等高分子进行处理，用以减少非专一性吸附，又会增加石墨烯的尺寸，影响电子透射率，从而影响蛋白质结构分析的精度。这成为该方法进一步应用的瓶颈。目前，急需一种既能达到快速蛋白质分离、可应用于结构分析、并能解决杂质非专一性吸附的方案。参考文献1.Phizicky, E.M.;Fields，S.Protein-Protein Interactions-Methods forDetection and Analysis.Microbiological Reviews 1995，59 (I)，94-123.[0009]2.Mastrobattista, E.；van der Aa，M.A.E.M.；Hennink, W.E.；Crommelin,D.J.A.Artificial viruses:a nanotechnological approach to gene delivery.NatureReviews Drug Discovery 2006,5 (2),115-121.[0010]3.Graslund, S.；Nordlund, P.；Weigelt, J.Bray, J.；Hallberg, B.M.;Gileadi，0.；Knapp, S.;Oppermann，IL ；Arrowsmith, C.；Hui, R.；Ming, J.;Dhe_Paganon，S.;Park，H.W.；Savchenko, A.；Yee, A.；Edwards, A.；Vincentelli, R.；Cambillau, C.；Kim, R.;Kim，S.H.;Rao，Z.;Shi，Y.；Terwilliger, T.C.;Kim，C.Y.;Hung，L.W.；Waldo, G S.;Peleg，Y.;Albeck，S.；Unger, T.;Dym，0.；Prilusky, J.;Sussman，J.L ;Stevens，R.C.;Lesley，S.A.；Wilson, 1.A.；Joachimiak, A.;Collart，F.;Dementieva，1.;Donnelly，M.1.；Eschenfeldt，W.H.;Kim，Y.;Stols，L.；Wu, R.;Zhou，M.;Burley，S.K.;Emtage，J.S.；Sauder, J.M.；Thompson, D.;Bain，K.;Luz，J.;Gheyi，T.；Zhang, F.;Atwell，S.;Almo，S.C.；Bonanno, J.B.；Fiser, A.；Swaminathan, S.；Studier, F.W.；Chance, M.R.；Sali, A.；Acton, T.B.；Xiao, R.;Zhao，L ；Ma, L.C.；Hunt, J.F.;Tong，L ；Cunningham, K.；Inouye,M.；Anderson, S.；Janjua, H.；Shastry, R.;Ho，C.K.；Wang, D.Y.；Wang, H.；Jiang, M.；Montelione，G.T.;Stuart，D.1.；Owens, R.J.;Daenke，S.;Schutz，A.;Heinemann，U.；Yokoyama,S.；Bussow,K.；Gunsalus,K.C.Protein production and purification.NatureMethods2008，5(2)，135-146.[0011]4.Liu, Z.F.；Jiang, LH.;Galli，F.1gor Nederlof, ReneC.L.0lsthoom, Gerda
E.M.Lamers, Tjerk.H.0osterkamp, Jan Pieter Abrahams.A Graphene Oxide center dotStreptavidin Complex for Biorecognition-Towards Affinity Purification.AdvancedFunctional Materials 2010，20 (17)，2857-2865.发明内容本发明是使用亲和性识别分子修饰碳纳米管，并将其连接到透射电镜支持膜上，从而获得具有亲和性分离功能的透射电镜支持膜。由于碳纳米管是一维的管状结构，因此将碳纳米管连接到透射电镜支持膜之后，将形成镂空结构，杂质蛋白质将从镂空结构的孔中漏下去，而目标蛋白质将附着于碳纳米管上，从而可以解决杂质蛋白质的非专一性吸附问题。基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜是一种功能化的透射电镜支持膜，由3部分组成，包括镂空透射电镜支持膜，一维碳纳米材料，和亲和性分离基团，其特征是亲和性分离基团连接到一维碳纳米材料上，一维碳纳米材料连接到透射电镜支持膜上。所述的一维碳纳米材料为碳纳米管、碳纳米线、碳纳米带,优选的，该一维碳纳米材料为单壁碳纳米管；该一维碳纳米材料的长径比为10-10000之间；所述的亲和性分离基团为可专一性识别特定分子或功能基团的分子或功能基团；所述的亲和性分离基团为链酶亲和素及其衍生物与生物素，6X组氨酸及其衍生物与镍NTA标记、甲壳素与甲壳素结合蛋白、麦芽糖与麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽，抗原与抗体等一种或几种亲和性识别功能对之一；所述的一维碳纳米材料使用表面活性剂处理；所述的表面活性剂为单臂或多臂聚乙二醇等。下面给出本发明所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜的设计原理。本发明针对当前蛋白质复合物的纯化与结构分析，提出了如下解决方案。通过对碳纳米管进行化学方法修饰，使具有亲和性分离的基团连接到碳纳米管上，从而使碳纳米管具有了亲和性分离的功能，可以用来从细胞裂解液中俘获目标蛋白。由于单臂碳纳米管直径较小，因此电子透射率好，当目标蛋白质位于单臂碳纳米管两侧时，更不会受到该碳纳米管的影响。将单臂碳纳米管连接到镂空的透射电镜分离膜上，使该透射电镜支持膜具有亲和性分离功能。进行蛋白质分离前，可将目标蛋白质进行修饰，使其可识别电镜膜上的亲和基团，从而可使用该透射电镜分离膜将目标蛋白质进行分离。杂质蛋白质可以从碳纳米管之间的空间漏下去，因此不会对目标蛋白质的成像造成影响。碳纳米管使用单臂或多臂聚乙二醇进行处理，可以减小碳纳米管本身对杂质蛋白质的非专一性吸附，从而获得高纯度。本发明与现有技术相比具有的有益效果:(I)蛋白质复合物的纯化、浓缩、以及结构分析可以集中在碳纳米管上，整个分离、纯化过程可以在几秒至几分钟内完成。(2)对于结构分析所需的蛋白质的量可大大很少，对于整个结构分析过程，只需少量细胞即可。(3)碳纳米管的高导电性可以有效减小透射电镜分析过程中的静电效应，从而避免样品在成像过程中的飘移。(4)沿着碳纳米管，可以有效且方便的找到目标蛋白质复合物，从而使取样简单化。(5)目标蛋白质粒子被碳纳米管俘获后，其去向可以被有效限制，从而大大减少结构分析过程中所需的计算机处理过程。(6)杂质蛋白质可以从碳纳米管周围的空隙中漏下去，从而有效避免杂质蛋白质的非专一性吸附，减少目标蛋白质在成像过程中受到的干扰。
: 图1.基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜示意图。1.透射电镜支持月吴;2.一维碳纳米材料；3.亲和性功能基团图2.基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜的透射电镜图。标尺长度:2.5微米
具体实施方式
:实施例一:将IOmg单臂碳纳米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加热搅拌2h，过滤，洗涤烘干，获得SWNT-C00H。取2.5mg SffNT-COOH分散于Iml DMF中，加入Img氨基封端的生物素(Biotin-PEG8-NH2)，2mg(3H-l，2，3-三唑并[4，5_b]吡啶 _3_ 氧基)三-1-吡咯烷基鱗六氟磷酸盐(PyAOP)，2mg N, N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温搅拌lh，过滤、洗涤，得到SWNT-biotin,将其分散于IOml H2O中。将5ml SWNT-biotin与5mg链酶亲和素混合，过滤，得到链酶亲和素修饰的单臂碳纳米管(SWNT-strep)，将其溶解于2ml含0.5%的4臂聚乙二醇2000的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.5)中。取10 μ I SWNT-strep滴加在镂空透射电镜支持膜上，获得可用于亲和性分离的透射电镜支持膜。使用Iml含有0.1% triton的tris-HCl缓冲液将培养于IOcm培养皿中的表达有生物素标记的绿色荧光蛋白的H293T细胞裂解。使用上述功能化的透射电镜支持膜在裂解液中捞取，之后使用细胞裂解液冲洗。使用荧光显微镜观测到俘获在透射电镜膜上的绿色荧光蛋白，说明蛋白质俘获能力很好。实施例二:将IOmg单臂碳纳米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加热搅拌2h，过滤，洗涤烘干，获得 SffNT-COOH0 取 2.5mg SffNT-COOH 分散于 5ml H20 中，2mg 碳二亚胺(EDC)，2mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌lh，过滤、洗涤，得到SWNT-NHS，将其分散于5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-赖氨酸混合，过滤，得到NTA修饰的单臂碳纳米管(SWNT-NTA)，将其溶解于2ml含0.5%的4臂聚乙二醇2000的PBS缓冲液中。取10 μ I SffNT-NTA滴加在镂空透射电镜支持膜上，滴加1%的NiCl2，获得可用于亲和性分离的透射电镜支持膜。使用Iml含有0.1 % triton的tris-HCl缓冲液将培养于IOcm培养皿中的表达有6His标记的绿色荧光蛋白的H293T细胞裂解。使用上述功能化的透射电镜支持膜在裂解液中捞取，之后使用上述缓冲液冲洗。使用荧光显微镜观测到俘获在透射电镜膜上的绿色荧光蛋白，说明蛋白质俘获能力很好。实施例三:将IOmg单臂碳纳米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加热搅拌2h，过滤，洗涤烘干，获得 SWNT-C00H。取 2.5mg SWNT-C00H 分散于 5ml H20 中，2mg EDC, 2mg NHS，室温搅拌lh，过滤、洗涤，得到SWNT-NHS，将其分散于5ml H2O中。加入N，N，- 二(羧甲基)-L-赖氨酸混合，过滤，得到NTA修饰的单臂碳纳米管(SWNT-NTA)，将其溶解于2ml含0.5%的单臂聚乙二醇2000的PBS缓冲液中。取10 μ ISffNT-NTA滴加在镂空透射电镜支持膜上，滴加1%的NiCl2，获得可用于亲和性分离的透射电镜支持膜。
使用Iml含有0.1 % triton的tris-HCl缓冲液(细胞裂解液)将将培养于IOcm培养皿中的同时表达有6His标记的绿色荧光蛋白，和无标记的红色荧光蛋白的H293T细胞裂解。使用上述功能化的透射电镜支持膜在裂解液中捞取，之后使用上述细胞裂解液冲洗。使用荧光显微镜观测到俘获在透射电镜膜上的绿色荧光蛋白，未观测到红色荧光蛋白，说明蛋白质纯化效果很好。实施例四:将IOmg单臂碳纳米管(SWNT)于硝酸中(2.8M)中120°C加热搅拌2h，过滤，洗涤烘干，获得 SffNT-COOH0 取 2.5mg SffNT-COOH 分散于 5ml H2O 中，加入 2mg EDC, 2mg NHS,室温搅拌lh，过滤、洗涤，得到SWNT-NHS，将其分散于5ml H2O中。加入谷胱甘肽S-转移酶，反应lh，过滤，得到谷胱甘肽S-转移酶修饰的单臂碳纳米管(SWNT-GST)，将其溶解于2ml含
0.5 %的4臂聚乙二醇2000的PBS缓冲液中。取10 μ I SffNT-GST滴加在镂空透射电镜支持膜上，获得可用于亲和性分离的透射电镜支持膜。使用Iml 0.1 % triton的tris-HCl缓冲液(细胞裂解液)将将培养于IOcm培养皿中的同时表达有GST标记的绿色荧光蛋白，和无标记的红色荧光蛋白的H293T细胞裂解。使用上述功能化的透射电镜支持膜在裂解液中捞取，之后使用上述细胞裂解液冲洗。使用荧光显微镜观测到俘获在透射电镜膜上的绿色荧光蛋白，未观测到红色荧光蛋白，说明蛋白质纯化效果很好。
权利要求1.一种基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，它是一种功能化的透射电镜支持膜，由3部分组成，包括镂空透射电镜支持膜，一维碳纳米材料，和亲和性分离基团，其特征是亲和性分离基团连接到一维碳纳米材料上，一维碳纳米材料连接到透射电镜支持膜上。
2.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的一维碳纳米 材料为碳纳米管、碳纳米线、碳纳米带。
3.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的一维碳纳米材料为单壁碳纳米管。
4.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的一维碳纳米材料的长径比为10-10000之间。
5.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的亲和性分离基团为可专一性识别特定分子或功能基团的分子或功能基团。
6.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的一维碳纳米材料使用表面活性剂处理。
7.根据权利要求1所述的基于一维碳纳米材料的亲和性分离透射电镜支持膜，其特征在于所述的一维碳纳米材料使用表面活性剂处理，所述的表面活性剂为单臂或多臂聚乙二醇。
专利摘要本实用新型属于生物医药技术领域，基于一维碳纳米材料设计的一种具有蛋白质分离功能的亲和性分离透射电镜支持膜。该亲和性分离透射电镜支持膜由3部分组成，包括镂空透射电镜支持膜，一维碳纳米材料，和亲和性分离基团，其中亲和性分离基团连接到一维碳纳米材料上，一维碳纳米材料连接到透射电镜支持膜上。本实用新型通过使用亲和性识别分子修饰一维碳纳米材料，并将其连接到镂空的透射电镜支持膜上，从而形成孔隙结构。杂质蛋白质可从一维碳纳米材料的的缝隙中漏下去，而目标蛋白质将被俘获于一维碳纳米材料上，该过程可以迅速完成。从而可以解决杂质蛋白质复合物纯化以及结构分析过程中的易分解、纯度低等问题。本实用新型的用途是蛋白质分离，可用于蛋白质复合物的分离、纯化、和三维结构分析。
文档编号G01N23/04GK203083854SQ20122016069
公开日2013年7月24日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘遵峰, 刘倩, 王楠 申请人:刘遵峰, 刘倩, 王楠