专利名称：人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
背景技术：
葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽或抑胃肽(GIP)是由哺乳动物十二指肠和空肠的内分泌细胞K细胞合成和分泌的一种含有42个氨基酸的直链多肽，相对分子质量约5000D。血浆中的GIP水平可在营养物质摄取几分钟内快速升高，释放量在摄食后15 30min达高峰，但其下降速度同样较快，基础研究表明GIP在体内的生物活性半衰期较短，小鼠为不 到2min，在正常人及2型糖尿病患者则分别为7min和5min。体内广泛表达的氨基多肽酶二肽基肽酶IV (DPP-IV)是GIP的主要降解酶，在其作用下GIP从2号位上丙氨酸处裂解失活；GIP的生理作用的发挥主要通过与其受体GIPR结合发挥。GIPR为G蛋白耦联受体，其分布较为广泛，可分布于胰岛的β细胞、脂肪细胞、胃及肠内皮细胞，肾上腺及脑等多个部位的细胞表面。GIP通过与靶细胞表面的G I PR作用可产生不同的生理作用。GIP具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌活性，同时也可以刺激前胰岛素基因的转录和翻译，刺激β胰岛细胞的生长、分化、增殖和存活。不仅如此，GIP还能抑制肝糖原分解，促进肌糖原生成以及促进脂肪细胞吸收葡萄糖生成脂肪。此外GIP还可以促进脂蛋白酶的活性。这些生物活性使得GIP成为治疗糖尿病、肥胖以及相关的代谢失调的潜在药物，具有广泛的应用前景。目前评价GIP的主要方法为放射免疫法(RIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)。放射免疫法检测灵敏度较高，但是保存时间较短，而且由于应用到放射性物质，对于实验室的要求较高，且实验废液难处理。相比之下，ELISA法操作简便，不需大型仪器，同时由于亲和素-生物素放大系统的应用，极大的提高了其灵敏度。因此，旨在通过该项目的实施开发一种方便经济的检测产品。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量反应待测样本中靶分子含量的技术。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。ELISA试剂盒中的关键因素是获得高特异性、高亲和力的抗体，但由于GIP是小分子物质，免疫原性较弱，通过传统的免疫方法不易产生特异性的抗体，而本实用新型专利利用偶联载体来增加其免疫原性，获得高质量的抗体。本专利从ELISA试剂盒制备的源头入手，将GIP与BSA偶联，通过利用新技术提高偶联效率，制备稳定的GIP-BSA，再使用免疫技术制备特异性高亲和力强的抗体，为试剂盒的制备提供高品质原材料。因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶的测定。
实用新型内容本实用新型目的是提供人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案本实用新型一方面涉及人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的包被层含有人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。本实用新型的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。
图I为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2包被层,3封闭层。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GIP的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GIP，形成待测标本中的GIP和生物素化的GIP竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。主要的技术路线如下2)人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其具体步骤为a、GIP全抗原的制备将70mg GIP与50mg牛血清白蛋白溶于4mL O. lmol/L磷酸钠缓冲液(PB, pH 7. 4)中，加O. 2mL 25%的偶联剂戊二醛(GA)连接成GIP-GA-BSA复合物，室温反应20h后，用
0.05mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7. 2)透析。b、抗人GIP抗体的制备健康雄性新西兰大白兔I只，用GIP-GA-BSA复合物免疫。将上述透析后的偶联产物进行紫外扫描、蛋白质谱、BCA(或其它方法如Bradford)进行偶联比例的分析及蛋白的定量。蛋白定量后分装冻干_80°C保存。取上述冻干偶联产物若干，用高压除菌的蒸馏水或去离子水重悬GIP-GA-BSA至终浓度为200 μ g/mL。取600 μ I重悬好的GIP-GA-BSA然后加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀。兔后足垫、背部皮下多点免疫。14d后，进行加强免疫，剂量与基础免疫剂量相同。每两周免疫一次，共免疫四次，第四次免疫后14天，从颈动脉取全血，测定抗体效价。C、人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒的研制人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GIP的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GIP，形成待测标本中的GIP和生物素化的GIP竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。2、经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线
权利要求1.人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。
2.根据权利要求I所述的人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的包被层含有人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽抗体。
3.根据权利要求I所述的人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。
4.根据权利要求I或2所述的人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的多个微孔是指96个微孔。
5.根据权利要求I或2所述的人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。
专利摘要本实用新型公开了人葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽酶联免疫吸附测定试剂盒，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。本实用新型的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。
文档编号G01N33/68GK202583216SQ201220224439
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月13日 优先权日2012年5月13日
发明者杨娟, 李华渊, 李庆, 童晓玲, 从旭霞, 姚雯, 何峰容 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司