专利名称：甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物检测领域，特别涉及一种甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸。
背景技术：
甲肝是法定乙类传染病，迄今仍是全世界普遍的公共卫生问题，全球年发病人数约140万，实际病例则是报告数的3至10倍，是急性病毒性肝炎中感染率和发病率最高的一种。即使在卫生条件非常发达的美国，感染率也高达30%。我国是发展中国家，发病率更高。目前我国甲肝的发病率和感染率仍居其它各型病毒性肝炎首位，每年报告的急性病毒性肝炎约100万例，其中50%为甲肝，约50万例。如按美国甲肝的漏报率推算(即实际发病数为报告病例数的4倍)，则我国每年实际新发的甲肝病例数为200万例；如临床型与亚临床型甲肝的比例按I :1推算，则我国每年甲肝新感染例数为400万例。在我国人群中，甲肝平均感染率高达80%以上，30岁以上人群感染率高达95%以上。城市人群感染率在80%以上，在农村，甲肝流行尤其严重，感染率在90%以上，15岁一下儿童感染率可达85%，成为影响居民健康的公共卫生问题。表明预防控制甲肝爆发与流行仍将是一项艰巨长期的任务。甲肝病毒是导致甲肝的病原体，而传染源就是感染甲肝病毒的人，包括急性期病人和无症状感染者。甲型肝炎潜伏期为2 6周。显性和隐性感染者均可随粪便排出甲肝病毒，排毒自感染后2 4周开始，至临床症状出现后2周或黄疸出现后I周消失。甲肝病毒只有借助电子显微镜才能观察到。甲肝是经消化道传播俗称粪口途径传播，具有以下几种传播方式(1)日常生活接触传播；(2)经水传播由于饮用了病人粪便污染了的水源；(3)经食物传播由于食用了被污染的食物特别是水产品，病毒进入体内在肝脏中增殖由粪便大量排出。甲肝的发病主要是以散发为主。如果甲肝病毒污染面过大，也可造成大量人群的同时发病，被称为暴发流行。凡是未感染过甲型肝炎病毒的人，无论是儿童还是成人均是易感者。但由于甲肝病毒感染与社会经济状况及个人卫生习惯密切相关，故在我国，15岁以下的儿童及青少年最容易患甲型肝炎。甲肝的潜伏期一般在15至45天。而潜伏期末到急性期期间都有排毒现象，传染性很强。在居住拥挤，人口密度大，环境卫生差的学校、工厂、农村、托幼机构或家庭中，更容易发生甲型肝炎的感染和流行。甲肝病毒感染者大部分没有临床症状，即使有，一般也是急性感染，大都能治愈，所以不太引起人们的重视。但病人年纪越大，症状一般越重。而且，需要引起重视的是，老人或免疫力低下者，或患有其它肝脏病变者，一旦感染甲肝病毒，有可能引起重症肝炎或暴发性肝炎在某些条件下，甲肝还能引起城市或地区大面积暴发流行，造成难以估计的人力物力财力的损失。总体上讲，甲型肝炎是一种自限性疾病，一般来说预后很好，较易恢复，且极少演化为慢性肝病。但甲肝容易集体暴发，可以导致严重社会公共卫生问题。患者必须隔离治疗，少则21天，完全康复需半年。患病自然会给个人健康带来危险，大面积暴发时还会造成较大的经济损失和社会影响。因此，进一步做好丙型肝炎的诊断、预防和控制流行是非常迫切的任务。[0007]1991年国际病毒分类委员会将HAV重新分类为RNA病毒科的一个新属肝病毒属，又称为嗜肝RNA病毒属(Hepamaviruses)。HAV呈球形,无包膜,有蛋白衣壳，内含单链正股RNA.衣壳由60个衣壳子粒(Prototners)组成，每一衣壳子粒都由四种病毒蛋白Vpl、Vp2.Vp3.vp4组成它们结合在一起使HAV呈二十面体。体内研究证明病毒对肝细胞的损伤是因为病毒侵人和复制激发了 T细胞介导的细胞免疫反应HAV对物理化学因子的耐受力较强，耐酸碱(PH3-12)，耐乙醚60°C 12小时不能完全灭活，I. 5mg / L余氯60分钟仍能存话。4°C放置一年，室温放置300天，仍保持抗原性及组织培养活性。I :4000的福尔马林37°C作用72小时可完全灭活。对紫外线照射较敏感，HAV随患者粪便入水后很快与水中的浮游物结台，视水温不同最少可存活100天。人类感染HAV后，经14-45天的潜伏期，出现消化道症状和肝实质细胞损伤后导致的生物化学指标的异常，伴有肝肿大，叩压痛等指征，潜伏期后期至发病后的2-3星期。血及粪便中均有HAV存在。人类在患甲肝后的急性期，血清呈现抗-HAV IgM抗体阳性，在恢复期抗-HAV IgG升高。抗-HAV IgM在发病后20-30天达高峰并可持续3-6个月，故抗-HAV IgM可以作为甲肝早期诊断的指标和病原学分型标准。感染甲肝病毒(HAV)后，一般在症状出现前5-10天产生特异性甲型肝炎抗体 IgM(HAVIgM),该抗体持续存在6个月左右，是甲肝诊断的重要指标。抗体IgG(HAV IgG)出现得较晚，但可持续10年以上，甚至终身，提示以往感染过甲肝病毒或接种过甲肝疫苗。HAV IgG是一种保护性抗体，可以防止甲肝病毒的再次感染。目前，国内外多以检测血清抗-HAV IgM诊断甲型肝炎，亦有人自早期甲肝病人唾液、粪便中检测抗-HAV IgM而加以证实。抗-HAV IgM是目前公认的甲型肝炎早期特异性诊断的主要指标。目前，临床上对甲型肝炎病毒IgM抗体的诊断主要采用酶标法(EIA)、放免法(RIA)和化学发光法等。最普及的方法仍是酶联免疫法(ELISA)。放免法(RIA)因其标记物有效期短和有放射性污染物而被市场逐步淘汰。化学发光法(CLIA)，它是在化学发光反应的基础上与免疫反应相结合建立的新技术，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性。采用化学发光测量仪，具有灵敏度高、稳定性好、快速、准确和简便等优点，无放射性污染，但所用试剂和自动化分析仪均为国外产品，价格昂贵尚难全面普及；EIA法，须经孵育、洗涤、显色、判读等步骤，过程较为繁琐，检测时间长。以膜为固相载体的胶体金快速诊断技术(以下简称金标免疫快速试验)是20世纪80年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观且适合临床医生、临床实验室、及野外的现场诊断及家庭的自我检测或自我保健。近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。自从胶体金标记技术被引入免疫化学和组织化学后，这一技术已在近10年来发展成为一项重要的免疫标记技术。在药物检测、生物医学等许多领域已经得到越来越多的发展。其中，胶体金技术被广泛应用于胶体金试纸和胶体金试剂盒检测。免疫层析分析技术是以条状纤维层析材料为固相。通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上针对待测物的抗原或抗体发生高特异、高亲和性免疫反应，层析过程中免疫复合物富集或截留在层析材料的一定层域(带)通过直接应用的胶体金标记物而得到直观的实现结果。而游离标记物越过检测条带，达到与结合物标记无自动分离的目的。
发明内容本实用新型根据上述领域的空白，提供一种甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸。本发明所提供的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，包括粘连在片状载体材料上的反应层，所述反应层一端到另一端依次为点样区、胶体金结合区、检测区、回收区，其特征在于所述检测区设置有检测线，所述检测线上包被有抗人-IgMy链抗体，所述胶体金结合区固着有胶体金标记的甲型肝炎病毒抗原。所述检测区还设置有对照线，所述对照线上包被有抗兔IgG多克隆抗体。所述胶体金结合区还包被有胶体金标记的兔IgG。所述点样区的覆盖材料的末端压着所述胶体金结合区的覆盖材料的始端，所述胶体金结合区的覆盖材料的末端压着所述检测区的覆盖材料的始端，所述回收区的覆盖材料的始端压着所述检测区的覆盖材料的末端。所述检测区的覆盖材料为硝酸纤维素膜，所述点样区的覆盖材料为玻璃纤维，所述回收区的覆盖材料为滤油纸。所述胶体金结合区的覆盖材料为胶体金结合垫，所述胶体金结合垫为固定有胶体金标记试剂的一层玻璃纤维。所述片状载体材料为双面胶。 所述双面胶的另一面粘附在硬质防水载体板上。以基因重组抗人-IgM μ链抗体，抗兔IgG多克隆抗体分别固相于硝酸纤维素膜检测区(T)和对照区(C)，当样本中含有抗HAV IgM时，抗HAV IgM能与胶体金标记HAV抗原结合形成复合物，该复合物在层析过程中又与(T)线区的抗人-IgM μ链抗体结合形成红色沉淀条带。当样本中不含抗HAV IgM时,胶体金标记的HAV抗原无法与(T)线区的抗人-IgM μ链抗体结合。无论样本中是否含有抗HAV IgM，(C)线区的抗兔IgG多克隆抗体都会与胶体金标记的兔IgG结合形成一条红色对照(C)线。(C)线的显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为该试剂的内控标准。利用免疫层析法原理，采用胶体金标记技术，研制出甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，它采用高度特异性的抗原-抗体反应、免疫层析技术及胶体金标记技术，可快速检测人血清或血浆样本中的甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)，适合于辅助甲型肝炎的早期特异性诊断。本发明所提供的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，具有快速、简便、灵敏、特异的特点，以符号显示结果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，可广泛用于甲型肝炎的早期诊断，市场发展前景良好。
图I为甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸结构示意图的俯视图。图2为甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸结构示意图的剖视图。其中1_点样区，2-胶体金结合区，3-检测区，4-回收区，5-片状载体材料，6-检测线，7-对照线，Ia-玻璃纤维，2a-胶体金结合垫，3a-硝酸纤维素膜，4a_滤油纸。
具体实施方式
实施例I、甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸单克隆抗体/重组抗原是该诊断试剂研发成败的关键。经过多次试验，选择特异抗原/抗体的亲合性及特异性良好，且抗体/抗原本身的稳定性好的单克隆抗体、重组抗原用于该诊断试剂的生产。抗兔IgG多克隆抗体(ARTRON BIORESEARCH INC,产品目录号为Ad21)，抗A-IgMu 链抗体(购自 ARTRON BIORESEARCH INC.产品目录号为 Aml4)，兔 IgG (ARTRONBIORESEARCH INC，产品目录号为Aa3)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原(购自ARTRON BI0RESEARCHINC，产品目录号为Aol4)。I、甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸的结构 如图I和图2所示，本实用新型所提供的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，包括粘连在片状载体材料上的反应层，所述反应层一端到另一端依次为点样区I、胶体金结合区
2、检测区3、回收区4，所述点样区的覆盖材料的末端压着所述胶体金结合区的覆盖材料的始端，所述胶体金结合区的覆盖材料的末端压着所述检测区的覆盖材料的始端，所述回收区的覆盖材料的始端压着所述检测区的覆盖材料的末端。所述检测区设置有检测线6，所述检测线6上包被有抗人-IgM μ链抗体,所述胶体金结合区2包被有胶体金标记的HAV抗原。本实用新型应用免疫层析式捕获法原理，当样本中含有抗HAV IgM时，抗HAV IgM能与胶体金标记HAV抗原结合形成复合物，该复合物在层析过程中又与检测线6上的抗人-IgMy链抗体结合形成红色沉淀条带,试验结果为阳性。当样本中不含抗HAV IgM时，胶体金标记的HAV抗原无法与检测线6上的抗人-IgM μ链抗体结合，于是在检测线6处不出现红色线条，试验结果为阴性。本实用新型优选在所述检测区3还设置有对照线7，所述对照线7上包被有抗兔IgG多克隆抗体，所述胶体金结合区还包被有胶体金标记的兔IgG。无论样本中是否含有抗HAVIgM，对照线7的抗兔IgG多克隆抗体都会与胶体金标记的兔IgG结合形成一条红色对照线。对照线的显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为该试剂的内控标准。本实用新型的点样区I、胶体金结合区2、检测区3及回收区4所用材料可用本领域技术人员熟知的与这些区域的功能符合的材料，本实用新型优选采用玻璃纤维Ia作为点样区I的覆盖材料，硝酸纤维素膜3a作为检测区3的覆盖材料，滤油纸4a作为回收区的覆盖材料，胶体金结合区覆盖有胶体金结合垫2a，所述胶体金结合垫为固定有胶体金标记试剂的一层无纺布。所述片状载体材料为双面胶；所述双面胶的另一面粘附在硬质防水载体板上。2、甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸的制备方法2. I基因重组抗原-胶体金标记物的制备2. I. I胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法制备。即氯金酸水溶液加热煮沸，加入柠檬酸三钠，混匀后煮沸，待胶体金溶液颜色至紫红色，继续煮沸15-20分钟，冷却即可。2. I. 2金标记抗原的制备[0040]用碳酸钾溶液调整胶体金溶液PH值至8-9后，加入基因重组HAV抗原，3-5分钟后加入聚乙二醇，离心制得金标抗原浓缩液后保存，使用前稀释至工作浓度。2. I. 3胶体金垫的制备取已经制备好的金标记抗原溶液浸湿样品垫，干燥，检测，备用。2. 2硝酸纤维反应膜的制备即检测线和对照线的制备。用适宜工作浓度的抗人-IgM μ链抗体溶液在硝酸纤维膜上包被检测线；用适宜工作浓度的抗兔IgG多克隆抗体溶液在硝酸纤维膜上包被对照线。2. 3 组装将双面胶的一面粘附在塑料板上，在双面胶的另一面顺次贴上包被有检测线和对照线的硝酸纤维反应膜、吸附有胶体金标记的HAV抗原的胶体金结合垫、玻璃纤维和滤油纸，且所述玻璃纤维的末端压着所述胶体金结合垫的始端，所述胶体金结合垫的末端压着所述硝酸纤维反应膜的始端，所述滤油纸的始端压着所述硝酸纤维反应膜的末端。将各组装材料组装成反应体后切成适宜条宽的测试条，卡型产品是将检测条组装在检测卡中。3、甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸的使用方法检验前请将试剂和样本恢复至室温。3. I、从铝箔袋中取出甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸；3. 2、放在水平工作台面上平置并做好样本标记；3. 3、用微量移液器取4μ L血清、血浆或全血样本，加入到盛放稀释液的试剂瓶中；3. 4、将加入样本的试剂瓶旋紧，摇匀；3. 5、在甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸的加样端滴加稀释样本2滴；3. 6、20_30分钟内判读结果，30分钟后检验结果无效。4、检验结果的解释4. I、阴性只在质控线(C)位置出现一条红色条带。4. 2、阳性质控线(C)和检测线(T)位置出现两条红色条带。4. 3、无效质控线(C)位置没有出现红色条带。
权利要求1.甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，包括粘连在片状载体材料上的反应层，所述反应层一端到另一端依次为点样区、胶体金结合区、检测区、回收区，其特征在于所述检测区设置有检测线，所述检测线上包被有抗人-IgMy链抗体，所述胶体金结合区包被有胶体金标记的甲型肝炎病毒抗原。
2.根据权利要求I所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述检测区还设置有对照线，所述对照线上包被有抗兔IgG多克隆抗体。
3.根据权利要求I所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述胶体金结合区还包被有胶体金标记的兔IgG。
4.根据权利要求I所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述点样区的覆盖材料的末端压着所述胶体金结合区的覆盖材料的始端，所述胶体金结合区的覆盖材料的末端压着所述检测区的覆盖材料的始端，所述回收区的覆盖材料的始端压着所述检测区的覆盖材料的末端。
5.根据权利要求4所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述检测区的覆盖材料为硝酸纤维素膜，所述点样区的覆盖材料为玻璃纤维，所述回收区的覆盖材料为滤油纸。
6.根据权利要求4所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述胶体金结合区的覆盖材料为胶体金结合垫，所述胶体金结合垫为固定有胶体金标记试剂的一层玻璃纤维。
7.根据权利要求I所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述片状载体材料为双面胶。
8.根据权利要求7所述的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，其特征在于所述双面胶的另一面粘附在硬质防水载体板上。
专利摘要本实用新型公开了甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸。本实用新型所提供的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸，包括粘连在片状载体材料上的反应层，所述反应层一端到另一端依次为点样区、胶体金结合区、检测区、回收区，其特征在于所述检测区设置有检测线，所述检测线上包被有抗人-IgMμ链抗体，所述胶体金结合区包被有胶体金标记的甲型肝炎病毒抗原。本实用新型所提供的甲型肝炎病毒IgM抗体检测试纸具有快速、简便、灵敏、特异的特点，以符号显示结果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，对于辅助甲型肝炎的治疗有重要意义，市场发展潜力很大。
文档编号G01N33/576GK202676700SQ20122023781
公开日2013年1月16日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者程鸿宇, 张莹, 孙茜 申请人:蓝十字生物药业(北京)有限公司