专利名称：一种黄曲霉毒素b1残留快速检测试纸卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡。
背景技术：
黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液、动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素BI (AFBl)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素BI的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。当哺 乳动物摄入黄曲霉毒素BI污染的饲料后，在体内经羟基化会将黄曲霉毒素Ml分泌于乳汁当中，奶牛经摄入黄曲霉毒素BI污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素Ml。由于黄曲霉毒素Ml相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其消除，所以检测黄曲霉毒素Ml不仅要检测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒素Ml的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等)中黄曲霉毒素Ml的最闻允许含量为O. 5 ng/ml。现有技术中常用的黄曲霉毒素残留检测主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫学分析法等。采用理化分析方法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但黄曲霉毒素BI分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需要将它转变为具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难，而且具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要专业人员操作等缺点。ELISA检测方法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、能进行批量检测等优点，但国内报道的黄曲霉毒素BI残留检测试剂盒较少。胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。与ELISA相比，具有样品前处理简单，显色时间短(3-5 min)，且所有试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏、高效的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。
发明内容本实用新型解决的技术问题是提供了一种操作简单、快速准确、灵敏度高、成本低、稳定性好，可进行批量检测的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡。本实用新型的技术方案是一种黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线(C线)，两者间距5 mm，其中黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)位于靠近样品垫的一侧，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体。本实用新型所述的支撑层是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本实用新型所述的吸收垫是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本实用新型所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。本实用新型所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 mm,吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 _。本实用新型所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。本实用新型所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。本实用新型具有以下优点(1)灵敏度高、特异性强。黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子通过异性电荷间范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小。因此，快 速检测试纸卡具有较高的灵敏度和特异性，其检测灵敏度可达O. 5 ng/ml ；(2)操作简单、方便快捷。使用快速检测试纸卡时无需其它任何试剂，只要将处理后的样品溶液用滴管滴入试纸卡加样孔内3 4滴，3飞min即可观察结果；(3)检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“ I ”或“ Il ”作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹时，表示被检测样品溶液中黄曲霉毒素BI残留含量> O. 5 ng/ml ;若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹时，表示样品溶液中黄曲霉毒素BI残留含量<0.5 ng/ml。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判；(4)胶膜的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；(5)成本低、投资少。使用本实用新型试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一步到位，成本低廉，见效快；(6)易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监督、规模养殖及个体生产等，具有广阔的市场前景和较大的经济效益和社会效益。
图I是本实用新型的结构示意图；图2是本实用新型中试纸条的侧视图；图3是本实用新型中试纸条的俯视图；图4是本实用新型检测结果为阴性的使用状态参考图；图5是本实用新型检测结果为阳性的使用状态参考图；图6是本实用新型检测结果无效的使用状态参考图。
具体实施方式
结合附图详细描述实施例。一种黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体I和封装于塑料盒体I内的试纸条2，所述的试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫4、金标抗体结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，所述的塑料盒体I上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上的样品垫4位置相对应，观察窗9与试纸条2上的硝酸纤维素膜6位置相对应，所述的硝酸纤维素膜6上有黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线(C线)10，两者间距5 mm，其中黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11位于靠近样品垫4的一侧，所述的结合垫5上灌注有胶体金标记的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体。本实用新型所述的支撑层3是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本实用新型所述的吸收垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本实用新型所述的样品垫4和金标抗体结合垫5是由玻璃纤维棉制作而成的。本实用新型所述的样品垫4和金标抗体结合垫5的叠压宽度为2 mm,吸收垫7与硝酸纤维素膜6 的叠压宽度为2 _。本实用新型所述的样品垫4、金标抗体结合垫5和吸收垫7上方覆盖有胶膜保护层12。本实用新型所述的硝酸纤维素膜6两端分界处有标记线13。本实用新型所述的试纸卡的制备方法I)硝酸纤维素膜的制备将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线(T线)和质控线(C线)。室温自然干燥后，将其浸入封闭液(质量浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，pH 7. 4)中30 min, 37 °C烘干后，加入干燥剂，4 °C密封保存。2)结合垫的制备将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含质量浓度为5%的BSA,质量浓度为2%的蔗糖，质量浓度为O. 8%的NaCl和质量浓度为O. 05%的NaN3的PBS处理液中20 min, 37 1恒温烘干，然后将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为结合垫。3)样品垫的制备玻璃纤维棉要用含质量浓度为2%的BSA，质量浓度为1%的蔗糖，质量浓度为O. 5%的硼酸钠和质量浓度为O. 1%的NaN3的PBS处理后，干燥备用，即为样品垫。4)吸收垫的制备将吸水能力极强的植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用。5)试纸条的制备在支撑板(PVC板)上，将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸收垫和胶膜等按一定工艺组装在一起，用CM4000切割机制成4 mm宽的试纸条，放入带干燥剂的密闭容器中储存。6)试纸卡的组装按一定工艺将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的特制的塑料盒体中，即为本实用新型试纸卡。本实用新型所述的试纸卡的检测原理试纸卡根据抗原抗体竞争性免疫层析原理设计。滴加样品液后，在吸收垫和硝酸纤维素膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，到达结合垫时，金标抗体将被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素BI时，它们将和金标抗体结合，并一起向上迁移，到达固定有AFBl-OVA的检测线位置时，检测抗原将和黄曲霉毒素BI竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点。样品中AFBl含量越高，检测抗原和金标抗体结合数量就越少，T线显色就越弱；当样品中AFBl高于一定数值(O. 5 ng/ml)时,检测抗原就无法和金标抗体结合，T线不显色。无论样品中是否有AFBl存在，过量的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗RaMIgG结合，在C线形成 红色。本实用新型所述的试纸卡的使用方法I)样品前处理饲料样取3 g粉碎饲料样品,加入9 ml样品提取液；剧烈振荡10 min ；4000 r/min离心5 min,或用定量分析滤纸过滤；上清液稀释后待测。食用油称取5 ml食用油样品于50 ml离心管中；加入10 ml石油醚(或正己烷)混勻；再加入15 ml样品提取液,振荡5 min ；6000 r/min离心5 min ;弃掉上层液体,用样品稀释液稀释后待测。2)样品滴加将试纸卡平放后，用滴管将样品溶液滴入试纸卡加样孔内3 4滴，3飞min后即可观察结果。3)检测结果分析阴性若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹时,表示样品溶液中黄曲霉毒素BI残留含量< O. 5 ng/ml,判为阴性,如图4所示。阳性若硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹，而检测线(T线)不显色，表示被检测样品溶液中黄曲霉毒素BI残留含量> O. 5 ng/ml，判为阳性，如图5所
/Jn ο无效若硝酸纤维素膜上质控线(C线)不显示红色条带，则无论检测线(T线)是否出现红色印迹，该试纸卡均判为无效，如图6所示。
权利要求1.一种黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，两者间距5 _，其中黄曲霉毒素BI —载体蛋白偶联物溶液印制的检测线位于靠近样品垫的一侧，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的支撑层是PVC板。
3.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的吸收垫是由植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。
4.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。
5.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 mm,吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 _。
6.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。
7.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI残留快速检测试纸卡，其特征在于所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。
专利摘要本实用新型公开了一种黄曲霉毒素B1残留快速检测试纸卡。本实用新型的技术方案要点为一种黄曲霉毒素B1残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应。本实用新型操作简单、快速准确、灵敏度高、成本低、稳定性好，可进行批量检测。
文档编号G01N33/558GK202794181SQ20122045741
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者姜金庆, 齐永华, 徐之勇, 郭芳, 葛会会, 赵莉 申请人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技学院