用来进行流动式细胞量测术的方法、系统及仪器的制造方法

用来进行流动式细胞量测术的方法、系统及仪器的制造方法
【专利摘要】本发明提供一种用于侦测一样品中的一分析物的仪器，其包括一照射源，用于产生电磁能以照射一询问区域处的该样品；一凹形收集器组件，其具有一光轴及一焦点，该询问区域与该凹形收集器组件的该焦点重合；一封闭流槽，其具有一设定于一样品入口与一样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及一安置于该询问区域下游的分选区域。该流径中穿过该询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准。该仪器进一步包括包含或怀疑包含该分析物且流入该流径的该样品，其中该分析物回应于照射而产生可侦测信号。该仪器也包括一用于侦测该可侦测信号的侦测器。
【专利说明】用来进行流动式细胞量测术的方法、系统及仪器
[0001]相关申请案的交叉参照
[0002]本申请案根据35U.S.C.§ 119(e)主张美国临时专利申请案第61 / 443，174号(2011年2月15日申请)、第61 / 443，178号(2011年2月15日申请)及第61 / 482, 504号(2011年5月4日申请)的权益，该等案的各别揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003]揭示领域
[0004]本发明大体是关于用于侦测分析物的方法、仪器及系统，且详言之用于侦测流过封闭流槽的样品中的分析物且在侦测后视情况使用控制能源影响该封闭流槽中的该分析物的至少一部分的方法、仪器及系统。
[0005]相关技术简述
[0006]流动式细胞量测分选术允许选择、富集、分配或分裂所关注细胞、病毒、物体或粒子(下文称为细胞)的群体。选择准则包括自细胞外部借助于或不借助于化学试剂或与细胞缔合或可使得与细胞缔合的复合物或物体可侦测到的个别细胞的可量测性质。举例而言，细胞性质可通过侦测及/或定量细胞与 一或多种标记(诸如发荧光或已经修饰而使得发荧光的分子、复合物或物体)的缔合来量测或估计。根据细胞的定性或定量性质，包括细胞中、细胞上或与细胞缔合的蛋白质、脂质、磷蛋白、醣蛋白、磷脂、醣脂、核酸(包括核酸的数量、序列或组织化)、碳水化合物、盐/离子及任何其它分子的组成，该等荧光分子、复合物及/或物体可与细胞有差别地缔合。此外，根据细胞的物理或生理特征，其实例包括(但不限于)膜通透性、膜组成、膜流动性、化学或膜电位、存活力、化学梯度、活动力、氧化电位或氧化态的降低及其它参数或性质，该等荧光分子、复合物及/或物体可与细胞有差别地
鋪A
?φ π O
[0007]细胞(无论经标记或未经标记、经修饰或未经修饰)的可为细胞选择提供根据的其它可量测性质可包括(但不限于):
[0008]-与细胞相互作用的光的性质，诸如荧光、吸收、反射、散射、偏振或其它性质；
[0009]-细胞的电学性质或细胞对其环境的影响，包括电导、电感、电阻、膜电位或电压或其它性质；
[0010]-细胞的磁或电磁性质，包括细胞的磁性、顺磁性、磁共振及/或与电磁能的相互作用；
[0011]-细胞的外观、影像或形态性质；及
[0012]-关于以任何方式直接或间接量测的任何物质或参数的细胞组成。
[0013]此外，直接或间接、单一或组合量测该等数量及质量可反映所关注的简单或复杂细胞性质。
[0014]该性质的一个实例为二倍体、单倍体或配子基因组中所包括的性染色体，其可为X染色体、Y染色体、Z染色体、W染色体或缺乏性染色体(称为『O』)或其组合,此视细胞类型及生物体而定。此外，已知与其它染色体或DNA序列的存在有关的其它性别判定系统。在许多情况下，细胞的性染色体含量的测定可使用利用一或多种方法直接或间接量测或测定来推断。该等方法包括经相对或绝对测定的细胞的DNA含量的量测；某些DNA序列的存在或不存在，或某些DNA序列的存在或不存在的标记物；细胞或细胞的一部分或细胞器的大小；特性化细胞的性染色体含量的蛋白质或其它标记物的存在、定位或不存在，或该等标记物的表现组合或模式；或反映细胞的性染色体组成的任何其它量测。可进行许多其它该等量测，或测定性质，以鉴别特定实例、情形、系统、疾病、条件、过程或情况中所关注的细胞。
[0015]该等细胞量测术量测允许对细胞、细胞群体、器官、组织或生物体进行定量及/或定性测定。该等测定可用于许多方面，包括(但不限于)诊断、生物医学研究、工程改造、流行病学、药物、农业、畜牧业、家畜管理、动物学、生物制药业及其它领域。除能够进行该等量测外，当前方法及仪器允许基于通过如上文所述的细胞量测术量测的特征或参数分离细胞。细胞可通过浓缩、收集、分离或分配所关注细胞或通过移除制剂中不合需要或不关注的细胞来进行阳性或阴性选择。该选择可基于可如上文所述测定的任何参数、特征或参数或特征的组合来控制。
[0016]通过包括上述方法或与上述方法有关的方法鉴别的细胞可分离、分配、浓缩、耗竭或收集至任意数目的任何群组中。一种常见分离方法(图1A中所描绘)使用静电力将含有具有所需或非所需性质的细胞的带电或带静电的物流或液滴转向。如图1A中所说明，视特定应用情况收集或丢弃转向的细胞。如图1B中所说明，其它分离方法包括使用包括阀门的射流装置，或改变气体或液体流的流动性质或方向的其它方法，将流体流中的细胞转向至替代路径、信道、试管或组件以随后进行收集或处置。如图1B中所说明，其它方法包括使用使流分裂(诸如与可控制的第二物流相交)的方法，将含有所关注细胞或粒子的物流的一部分转向以将流体流中的细胞转向至替代路径、信道、试管或组件以随后进行收集或处置。流体流分离至替代分流路径中可以各种方式达成。举例而言，美国专利第6，400, 453号描述使用液体或压缩气体的流体转换来将流体转向。国际专利公开案第W02010 / 149739号描述使用雷射加热流体流从而引起流分裂及流径转向来将流转向至不同路径中的另一方法。
[0017]现有多种用来进行细胞的流动式细胞量测分选的方法及系统。其中有设计成进行哺乳动物精细胞的流动式细胞量测分选及详言之将精细胞分选为带有X染色体的精细胞群体及/或带有Y染色体的精细胞群体的方法及系统，其目的在于增加卵与经分选精子的受精将繁衍具有所需性别的后代的可能性。举例而言，奶农可能需要分选公牛的精子以使得可通过人工授精、试管内受精或其它方法，使用增加带有X染色体的精细胞的出现率的精细胞制剂制造牛胚胎，以繁衍额外雌性牛后代。
[0018]流动式细胞量测分选方法呈现许多挑战，尤其关于分选哺乳动物精细胞以供以后用于繁衍后代。重要的是，用于标记及/或区分细胞的方法及/或用于分选细胞的方法不得对细胞的存活力产生不利影响。通常，所涉及的方法及/或系统的一或多个目的(例如较快分选、提高准确性等)与方法及/或系统的其它目的相冲突。必须平衡及考虑各种因素，包括细胞所经受的温度、温度变化、压力及/或压力变化，细胞所暴露的射流环境，细胞所暴露的化学环境及物质，施加于细胞的力，及细胞的寿命。举例而言，荧光分子(例如荧光染料)进入细胞以结合于细胞核中的DNA的速率(也即可将细胞染色的速率)可随温度增加而增加。因此，系统的输送量(至少染色过程的输送量)可随细胞环境的温度增加而增力口。然而，温度增加可能证明对细胞的存活力及/或细胞保持有活力的时间长度不利。相比之下，在低温下维持细胞以促使维持良好存活力可能会延长细胞染色所需的时间(及因此延长包含量测及分选的整个操作所需的时间)，以致该过程所用的时间长于实务时间或致使细胞在完成该过程所需的时间后不存活。
[0019]另一与分选细胞相关的挑战是关于细胞的物理及光学性质。详言之，扁平或另外不对称细胞(诸如一些哺乳动物红血球或精细胞)可展现能量(例如光)的各向异性发射。细胞内部的复杂几何形状及/或细胞边界的复杂几何形状起透射、折射及/或反射光的作用，此作用方式高度依赖于细胞相对于任何照射源及/或用于区分细胞的侦测器的位向。举例而言，将哺乳动物精细胞流动式细胞量测术分选为含有X或Y染色体的细胞的出现率增加的群体通常涉及用结合于细胞中的DNA且在结合时发出明亮荧光的分子将细胞染色。大多数哺乳动物物种的X及Y染色体之间的DNA含量变化(Y染色体所含的DNA —般少于X染色体)导致来自含有X染色体的细胞的荧光相对更强。然而，带有X及Y染色体的细胞的DNA含量差异典型地仅约百分之几，且细胞几何形状及/或位向影响所侦测的荧光的百分比通常可超过X与Y染色体之间的DNA含量差异百分比。另外，该分析要求细胞逐一穿过侦测区域，以使得侦测器不会将来自两个细胞的荧光解释为来自单个细胞的荧光。
[0020]流动式细胞量测术分选系统通常使用芯鞘(core-1n-sheath)射流机构来使细胞穿过侦测区域。如图1C中所描绘，将细胞752的水性悬浮液的相对缓慢移动流750注入鞘流体的相对较快移动流754中。此配置将细胞752集中为物流756，称为芯流。在适当选择压力、边界的形状、尺寸、位向及材料及射流系统的组分，及随后芯悬浮液及鞘流体的速度及组织化的情况下，通过鞘流所施加的流体动力使芯流变窄，且使芯流中的细胞纵向分布以使得其几乎逐个带入流中。迫使芯流拉长及变窄的额外益处为使细胞752定向以使得细胞752的纵轴758 —般平行于单行流756的流动方向。然而，细胞关于纵轴758的位向在系统中保持不同程度的随机性，其中芯流及鞘流设计成一般关于流轴呈圆柱形对称。因此，当各细胞752穿过侦测区域时，入射于细胞上的光、自细胞发射的光(例如荧光或散射光或透射光)及自细胞反射离开的光仍依赖于细胞752的位向。此对于许多类型的哺乳动物精细胞尤其成立。
[0021]流动式细胞量测术系统中关于照射及侦测细胞的精细胞位向问题存在多种解决方法。举例而言，图1D说明一种解决方法，该解决方法使用试管762上的切割、斜截尖端760将样品流764注入鞘流766中。扁平、斜截尖端760有助于使细胞关于其纵轴758在鞘流766中定向(图1C中所说明)，以使得细胞的扁平面倾向于以一致方向排列。另一解决方法(其可与斜截尖端解决方法组合)使用彼此正交的两个侦测器768及770 (O度侦测器768及90度侦测器770)，其组合使用以估计各细胞穿过侦测区域772时的位向并量测经发现已适当定向以便可精确定量荧光信号的彼等细胞的荧光。使用流体动力学使细胞关于纵轴定向的解决方法一般得到对于样品流中约60%至约80%的细胞达成荧光量测的所需对准的群体，其降低仪器的输送量且导致丢弃不适当定向的细胞。
[0022]与细胞几何形状及位向相关的问题的又一解决方法利用沿与载运细胞的芯鞘流相同的轴进行光学侦测。在一种该解决方法中，使用落射照射(ep1-1llumination)光学组件照射细胞且侦测细胞所发出的光。如图1E中所描绘，由鞘流776载运的样品流774直接移向显微镜物镜778，从而消除对细胞(例如精细胞780)关于细胞780的纵轴782定向的依赖性。然而，细胞780向着物镜778的轨迹要求细胞780在穿过侦测区域784 (也即物镜778的焦点784)后立即改变轨迹。该系统通过使用横向流体流786来实现此轨迹变化。个别细胞位置的不确定性可在分析后因横向流体流786及鞘流776及样品流774的会聚788而引入。该位置不确定性可使得系统不能有效进行细胞分选，因为会聚流中细胞780的位置可在细胞穿过侦测区域784后立即或不久变得无法预测。
[0023]图1F中说明的另一解决方法利用一或多个抛物形或椭球形反射器802均匀地照射细胞及/或收集细胞径向发出的光。该系统利用喷嘴804发射含有个别细胞792的液体流/射流806。物流806移动穿过侦测区域794并穿过反射器802中的孔796。在穿过侦测区域后的某一时刻，物流806分裂为可带电的液滴790。随后，各液滴790可通过例如使用带电致偏板798使带电液滴790偏转以使液滴偏转至一或多个容器800中来进行分选。问题在于，此「空气中射流(jet-1n-air)」组态使得当物流806离开喷嘴804时物流806 (及物流806中所含的细胞792)经受压降。突然的压力变化(及喷嘴内自身的压力增加)会不利地影响细胞792的存活力，随后会使细胞792冲入容器800中。因此，物流806离开喷嘴804的压力及速度必须保持低于会损坏细胞792的任何临限值，其降低系统的输送量。另夕卜，液滴790移动穿过氛围可能需要环境约束，包括室内空气的洁净度(例如「洁净室」)及温度控制。
[0024]因此，即使使用相对先进的流动式细胞量测术，此项技术中仍需要提供更高效、更灵敏且更精确的细胞鉴别及/或分离方法及装置。

【发明内容】

[0025]根据本发明的一具体实例，用于侦测射流样品中的分析物的仪器包括用于产生电磁能以照射询问区域处的样品的照射源；包含顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，该询问区域与该凹形收集器组件的该焦点重合；及封闭流槽。该封闭流槽包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。包含或怀疑包含该分析物的该样品以芯鞘流或层流形式流入流径，至少穿过询问区域。样品具有自询问区域向该收集器组件的该顶点移动的流动方向，或自收集器的顶点向询问区域移动的流动方向且流径的一部分穿过收集器组件的内部体积。分析物响应于照射而产生可侦测信号。该仪器也包括用于侦测该可侦测信号的侦测器。
[0026]根据本发明的另一具体实例，用于侦测射流样品中的分析物的仪器包括用于照射询问区域处的样品的照射源；第一及第二凹形光学组件，其各包含光轴及焦点；安置于该第一凹形光学组件的内部体积中的圆锥形光学组件，其中该照射源聚焦于圆锥形光学组件上。该仪器也包括包含顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，其中该询问区域与该凹形收集器组件的焦点重合；及封闭流槽。该封闭流槽包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准。流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。包含或怀疑包含该分析物的该样品以芯鞘流或层流形式流入流径，至少穿过询问区域。该第二凹形光学组件将电磁能聚焦于询问区域处的样品上。分析物响应于照射而产生可侦测信号。仪器也包括用于侦测该可侦测信号的侦测器，该可侦测信号由凹形收集器组件收集且反射至该侦测器。
[0027]根据本发明的另一具体实例，用于侦测射流样品中的分析物的仪器包括用于照射询问区域处的样品的照射源；第一及第二抛物形光学组件，其各包含光轴及焦点；安置于该第一抛物形光学组件的内部体积中的圆锥形光学组件，其中该照射源聚焦于该圆锥形光学组件上；及包含顶点、光轴及焦点的椭球形收集器组件。该第一抛物形光学组件及该第二抛物形光学组件、该圆锥形光学组件及该椭球形收集器组件同轴对准，且该询问区域与该椭球形收集器组件的该焦点重合。该仪器进一步包括封闭流槽，其包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。该流槽包括包围询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比询问区域处的流槽壁的折射率大或小0.1范围内。包含或怀疑包含该分析物的该样品以芯鞘流或层流形式流入流径，至少穿过询问区域。该第二抛物形光学组件将电磁能聚焦于询问区域处的样品上。分析物响应于照射而产生可侦测信号。仪器包括用于侦测该可侦测信号的侦测器，该可侦测信号由椭球形收集器组件收集且反射至该侦测器。
[0028]根据本发明的一具体实例，使用仪器侦测射流样品中的分析物的方法包括控制封闭流槽中的样品流以具有⑴自收集器组件的顶点向询问区域或⑵自询问区域向收集器组件的顶点的流动方向，该仪器包含照射源，具有顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，及与该凹形收集器组件的该焦点重合的询问区域。该流槽包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。当该流动方向为自询问区域流向收集器组件的顶点时，流径的一部分穿过收集器组件。该方法进一步包括照射询问区域处的该样品，其中该分析物回应于照射而产生可侦测信号。方法也包括用凹形收集器组件收集可侦测信号，其中收集器组件将该可侦测信号反射至侦测器；及用该侦测器侦测可侦测信号。
[0029]根据本发明的另一具体实例，在仪器中侦测分析物的方法包括控制封闭流槽中的包含或怀疑包含分析物的样品流，该仪器包含照射源，圆锥形光学组件，第一及第二凹形光学组件，具有顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，及与该凹形收集器组件的该焦点重合的询问区域。该封闭流槽包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。该方法进一步包括使用光学配置照射询问区域处的该分析物。分析物响应于照射而产生可侦测信号。该光学配置包括该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件，其各具有光轴及焦点；及安置于第一凹形光学组件的内部体积中的该圆锥形光学组件。圆锥形光学组件将来自照射源的电磁能反射至第一凹形光学组件。第一凹形光学组件将该电磁能反射至第二凹形光学组件，且第二凹形光学组件将电磁能聚焦于询问区域上。方法也包括用凹形收集器组件收集可侦测信号，其中凹形收集器组件将该可侦测信号反射至侦测器；及用该侦测器侦测可侦测信号。
[0030]根据本发明的另一具体实例，在仪器中侦测分析物的方法包括控制封闭流槽中的包含或怀疑包含分析物的样品流，该仪器包含照射源，圆锥形光学组件，第一及第二抛物形光学组件，具有顶点、光轴及焦点的椭球形收集器组件，及设定于该椭球形收集器组件的该焦点处的询问区域。该封闭流槽包括样品入口、样品出口、设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过收集器组件、询问区域及安置于询问区域下游的分选区域。流径中穿过询问区域的部分与该椭圆形收集器组件的该光轴同轴对准，且流径中穿过询问区域及分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉。流槽也包括包围询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比流槽壁的折射率大或小0.1范围内。该方法进一步包括使用光学配置照射询问区域处的该分析物，其中分析物回应于照射而产生可侦测信号。该光学配置包括该第一抛物形光学组件及该第二抛物形光学组件，其各包含光轴及焦点；及安置于第一抛物形光学组件的内部体积中的该圆锥形光学组件。圆锥形光学组件将来自照射源的电磁能反射至第一抛物形光学组件，第一抛物形光学组件将该电磁能反射至第二抛物形光学组件，且第二抛物形光学组件将电磁能聚焦于询问区域上。方法也包括用椭球形收集器组件收集可侦测信号，其中椭球形收集器组件将该可侦测信号反射至侦测器；及用该侦测器侦测可侦测信号。
【专利附图】

【附图说明】
[0031]图1A-1F为使用流动式细胞量测术分选样品的先前技术方法的示意图；
[0032]图2为说明根据本发明的具体实例侦测分析物的方法的流程图；
[0033]图3为根据本发明的具体实例侦测分析物的方法及仪器的示意图；
[0034]图4A及4B为根据本发明的具体实例的样品流动方向的具体实例的示意图；
[0035]图5A为根据本发明的具体实例的流体动力学聚焦组件的示意图；
[0036]图5B为经由线A-A'得到的图5A的流体动力学聚焦组件的横截面的示意图；
[0037]图6为根据本发明的另一具体实例的先前技术流体动力学聚焦组件的示意图；
[0038]图7A为根据本发明的一具体实例形成芯鞘流的方法的示意图；
[0039]图7B为图7A的方法在加速区域前形成流的示意图。
[0040]图7C为自图7A的方法在加速区域后获得芯銷流的不意图；
[0041]图8为声学聚焦样品流以增强分析物的中心对准的习知方法的示意图；
[0042]图9为使用以与流轴正交的角度照射的单一照射源对询问区域处的样品进行照射的不意图；
[0043]图10为使用在与流轴正交的平面内以各种角度照射的多个照射源对询问区域处的样品进行照射的示意图；
[0044]图11为使用流槽作为波导将照射导引至询问区域上来对询问区域处的样品进行照射的不意图；
[0045]图12为使用略微离轴照射对询问区域处的样品进行照射的示意图；
[0046]图13为本发明的一具体实例的示意图，其中收集器组件的功能也在于将电磁能聚焦于询问区域上；[0047]图14为根据本发明的一具体实例使用圆锥形光学组件及凹形光学组件对询问区域处的样品进行照射的示意图；
[0048]图15为根据本发明的一具体实例使用两个凹形光学组件及圆锥形光学组件对询问区域处的样品进行照射的示意图；
[0049]图16为根据本发明的一具体实例使用物镜作为收集器组件收集来自询问区域处的分析物的可侦测信号的示意图；
[0050]图17为根据本发明的一具体实例使用物镜作为收集器组件收集来自询问区域处的分析物的可侦测信号的示意图，该物镜经改良以允许至少一部分样品流穿过物镜；
[0051]图18为根据本发明的一具体实例收集来自询问区域处的分析物的可侦测信号的抛物形收集器组件的示意图；
[0052]图19为根据本发明的一具体实例收集来自询问区域处的分析物的可侦测信号的椭圆形收集器组件的示意图；
[0053]图20A为根据本发明的一具体实例收集经由流槽上的球形模制物所发射的可侦测信号的示意图；
[0054]图20B为图20A的放大示意图，其说明经由球形模制物发射的可侦测信号；
[0055]图21A-21C为根据本发明的具体实例在侦测后收集流槽出口处的样品的示意图；
[0056]图22为根据本发明的一具体实例的仪器及方法的控制系统的示意图；
[0057]图23为根据本发明的一具体实例侦测及分选分析物的例示性方法的示意图；
[0058]图24为根据本发明的一具体实例侦测分析物的例示性系统的示意图；
[0059]图25为根据本发明的另一具体实例侦测分析物的例示性系统的示意图；及
[0060]图26为根据本发明的另一具体实例侦测分析物的例示性系统的示意图。
【具体实施方式】
[0061]所述方法及仪器允许通过侦测许多特征(例如所需性质)的存在或不存在或可在与流动式细胞量测技术兼容的量测中测定、估计或反映的参数来鉴别所关注分析物。虽然本文大致关于分析物且有时尤其关于细胞进行描述，但应了解，本文所述的方法及仪器一般适用于分析物且在特定实例中关于细胞或更具体关于精子描述流动式细胞量测仪的情况。在任何情况下，在描述中提及「细胞」或「细胞群体」应理解为并非限制，而是仅适用于所述原理的特定情况。
[0062]在各种态样中，用于定义所关注分析物或分析物群体的细胞量测术量测包括本文所论述的量测及另外此项技术中已知的量测，以及可引入或使得适用于流动式细胞量测分析的新颖量测方法、机制及/或仪器。经由实施本发明所述的方法及仪器进行细胞量测分析的分析物可经标记或未经标记，或另外使用此项技术中已知的技术及试剂修饰或未经修饰。
[0063]如本文中所使用，术语「标记(label)」是指可通过光测定、影像分析、光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法侦测的组成物。举例而言，适用标记包括荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素-抗生蛋白链菌素、长叶毛地黄配质(dioxigenin)、半抗原、可使用抗血清或单株抗体的蛋白质或核酸特异性染料。因此，在本发明所述的方法及仪器中，关于以任何方式直接或间接量测的任何物质或参数的分析物的组成、性质及/或特征为用于鉴别分析物及分析物群体以进行选择或排除的根据。
[0064]分析物的可侦测组成、性质及/或特征的实例包括(但不限于)⑴量测与分析物相互作用或由分析物发射的光的性质，诸如吸光度、光散射、发光、荧光、磷光、光偏振或去偏振或其它性质；(2)电学性质，包括(但不限于)分析物或周围介质的电感、电容、电位、电流或电阻；(3)电磁性质，包括磁性、顺磁性、磁共振及/或分析物与电磁力及/或电磁波的相互作用或电磁力及/或电磁波的发射 '及(4)对分析物的影像或类似影像性质进行收集及/或分析而得到的成像、影像性质、形态性质或相关性质。在某些态样中，量测为分析物的固有数量或质量，或在替代性态样中，量测为间接反映、表示或估计分析物的数量或质量的值。在其它态样中，量测为分析物的固有数量或质量与分析物的数量或质量的间接反映、表示或估计。举例而言(但不限于)，侦测或量测分析物产生的荧光可表示分析物的固有荧光或结合于分析物或以其它方式与分析物缔合的荧光染料或荧光粒子的存在及/或数量，其可直接及/或间接指示分析物的一些性质。
[0065]在所述方法及仪器的一些态样中，分析物为细胞(例如哺乳动物精子)且分选细胞量测仪使用可在实体或空间上分离细胞及细胞群体的技术。在所述方法及仪器的其它态样中，分选细胞量测仪利用实体上及/或功能上修饰群体中的所选细胞以允许其功能及/或实体分离及/或区分、视情况供后续使用的技术。在所述方法及仪器的一些态样中，分选细胞量测仪不依靠通过位置、定位、容器或时间立即分离细胞，而改为提供就某种所需性质而言不活化、丧失能力、破裂、断裂、破碎或以其它方式改变(也即「修饰」)的细胞，从而视情况允许分离或区分制备物中的子群。修饰的性质全部或部分视所鉴别细胞的所欲应用或用途而定及从而视所鉴别细胞的与应用相关的特征而定。举例而言且仅出于解释或阐明的目的，在制备正常体细胞的情形下，若细胞繁殖的能力受到不利影响或若细胞被杀死，则恶性或另外永生或快速生长细胞可视为功能上不活化。在另一实施例中，再次仅出于解释或阐明的目的，当应用需要自群体移除细胞子群(例如产生不合需要的蛋白质或其它物质的子群)时，分选细胞量测仪可通过消除此等细胞中该物质的产生，通过杀死该等细胞，及/或通过修饰该等细胞以允许其自群体实体移除来达成此结果。
[0066]在一些具体实例中，本发明所述的方法及仪器利用分选能源修饰细胞或诱导或起始可修饰细胞的过程，诸如化学活化。在各种态样中由分选能源诱导的修饰包括对分析物的直接作用。举例而言，当分析物为细胞时，对该等细胞的直接作用包括(但不限于)(I)修饰细胞组分或化学物质，包括蛋白质、DNA及与细胞代谢有关的物质；(2)在细胞内或细胞附近发生的破裂、加热、空蚀或爆裂；细胞的通透或穿孔；及(3)细胞(包括细胞、病毒、物体或粒子)的破坏、碎裂或形态变化。
[0067]在其它具体实例中，修饰也可或者包括分选能源的间接作用，其由分选能源或由其它因素介导，包括例如(I)细胞或一或多种细胞组分的化学活化及/或失活、化学交联或化学衍生；(2)在细胞内或细胞附近一或多种化学药剂的活化及/或失活，此可引起该等药剂或其衍生物结合或缔合于细胞或其组分；或(3)诱导细胞功能改变。在某些具体实例中，照射时与细胞反应的化学药剂通常可存在于细胞中或应用中，或可将化学药剂添加至样品流体中作为方法的一部分。
[0068]在一些具体实例中，所述方法及仪器结合使用光可活化化合物，用适当强度及能量的光照射时，其经诱导而与细胞或细胞组分结合或以其它方式缔合。在一些具体实例中，光可活化化合物可诱导一或多种细胞组分发生足以影响所关注细胞的细胞过程或代谢的交联或变性。或者，光可活化化合物可诱导一或多种细胞组分发生足以杀死所关注细胞的交联或变性。在另一替代方案中，光可活化化合物可与所选细胞结合或以其它方式缔合且以使得所关注细胞在后续过程中易鉴别及/或富集及/或耗竭的方式改变所关注细胞的一或多种性质。
[0069]在某些态样中，在随后步骤中，通过利用该物质的性质或相互作用的方法移除、浓缩或纯化已通过化学衍生(诸如通过添加化学物质)改变的所关注细胞。举例而言，且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，所关注细胞通过添加随后由抗体结合的物质来衍生，该抗体允许通过各种方法捕捉或滞留所关注的衍生细胞。涵盖许多该等物质，且在一个态样中，该等物质包括一类含有2，4-二硝基苯基(DNP)或与其有关的化合物，在一个态样中该化合物由识别DNP的抗体识别并特异性结合。因此，在一个态样中，使用DNP或相关化合物的光可活化衍生物来衍生此类型的应用中所关注的细胞。
[0070]或者，所关注的衍生细胞可使用引起所关注的衍生细胞优先结合于某些受质的策略捕捉或移除。举例而言且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，使用含有生物素或与生物素有关的化合物衍生的所关注细胞捕捉或滞留于结合生物素或已修饰而结合生物素的受质、表面、物质、介质、化合物或粒子上，例如通过存在抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素结合抗体或其它生物素结合分子。在与此态样有关的另一替代方案中，使用生物素或相关化合物的光可活化衍生物来衍生该应用中所关注的细胞。或者，在其它态样中，所关注细胞通过添加或缔合化学物质或化合物，随后经受选择及修饰来改变。因此，在该情况下，本文所述的方法及仪器的具体实例利用改变所选细胞上的所添加物质以允许区分该等细胞与群体中的其它细胞。举例而言，且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，群体中的所有细胞均通过在分析之前添加光不稳定化合物来衍生，且在一个态样中，使用仪器的能源修饰系以特定细胞为目标以修饰彼等细胞上的光不稳定化合物。
[0071]参看图2，在本发明的一具体实例中，用于侦测及视情况高速分选分析物的方法100—般可依序包括例如经由样品入口将含有或怀疑含有分析物的样品引入流槽的射流流径中(步骤110)，使该样品穿过流体动力学聚焦区域(步骤112)，照射询问区域处的样品，该分析物响应于照射而产生可侦测信号(步骤114)，收集可侦测信号并侦测分析物或分析物的所需特点(步骤116)，视情况使用导引至位于该询问区域下游的分选区域中的分析物的分选能量分选该分析物或所关注分析物，该分选能量可有效改变、损坏或破坏分析物(步骤118)，视情况实体分选样品出口或位于分选区域下游的其它区域处的样品(步骤119)，及使样品经由该流槽的样品出口离开(步骤120)。
[0072]虽然上文各别地及下文详细地描述该等方法的各种步骤，但应了解，方法的步骤可同时或实质上同时进行。举例而言，将样品引入射流流径中与流体动力学聚焦可同时进行，例如在流槽由毛细管形成的具体实例中。毛细管可实现样品的近似立即聚焦。在另一具体实例中，流体动力学聚焦组件可设置于样品入口处，以使得该样品入口为流体动力学聚焦区域及/或包括流体动力学聚焦仪器且样品在进入流槽的射流流径中时变得聚焦。或者，流体动力学聚焦组件或区域可设置于样品入口下游且样品可在入口引入后聚焦。
[0073]可同时或实质上同时进行的步骤的另一实例包括视情况实体分选位于分选区域下游的样品及使样品离开样品出口。如下文详细描述，实体分选可在样品离开样品外线的同时进行。在其它具体实例中，也可提供位于样品外线上游但位于分选区域下游的实体分选区域以使得实体分选在样品离开之前进行。
[0074]举例而言，照射样品、收集可侦测信号及侦测分析物也均可实质上同时进行。应了解，实质上同时意谓照射、收集及侦测步骤是以样品可照射、产生可侦测信号及可收集可侦测信号并传输至侦测器的速度进行。举例而言，该作用可以大约电磁能的速度进行，且因此可视为实质上同时。
[0075]与习知流动式细胞量测术系统相比，根据本发明的具体实例侦测分析物的方法及仪器具有改良的准确性及输送量。该等方法及仪器具有多种应用，包括例如基于其所含的DNA量、其所含的特定蛋白质或其它生物分子标记物及/或其所含的特定基因标记物(天然存在或不存在)区分细胞。方法及仪器也应用于区分分析物(例如细胞)，其通过使用荧光抗体或基因探针或染料，从而在有或无标记物的细胞之间产生可侦测差异，或使得能够量测标记物的表现或数量的差异。本发明方法及仪器特定用于鉴别精细胞的性别。
[0076]仪器的具体实例有利地提供流动式细胞量测术系统，其中光学配置(也即收集器组件及视情况存在的光学组件)不会形成障壁或另外需要样品流在询问区域与分选区域之间关于光学配置转向或重导引，同时允许样品以任何所需方向流动。
[0077]下文参考图3描述通用方法及仪器仅用于说明性目的且不以任何方式限制照射方法、光学配置、分选方法或本发明的方法及仪器的任何其它组件，如下文详细描述。参看图3，根据本发明的具体实例的仪器一般包括封闭流槽132，其具有样品入口 134、样品出口136及在样品入口 134与样品出口 136之间延伸的流径138。流槽132可视情况包括鞘流体入口及鞘流体供应容器(图中未示)用于将鞘流体引入流槽区域中以稍后形成芯鞘流。该仪器也包括照射询问区域148的照射源(图中未示)及收集分析物142回应于照射而产生的可侦测信号的凹形收集器组件146。照射时，分析物可反射、发射、传输或以其它方式产生可侦测信号。凹形收集器组件146具有相关顶点159、光轴161及焦点163。如本文中所使用，「顶点(vertex)」应理解为包括收集器组件146中对应于顶点的彼等区域或与收集器组件146有关的彼等区域，不论收集器组件146是否包括实际顶点，经截顶，或包括开口或间隙(否则实际顶点会位于此处)。如本文中所使用，「光轴(optical axis)」是指收集器组件的穿过焦点的轴且凹形收集器组件关于该轴呈旋转对称。如本文中所使用，「焦点(focal point) J以其在此项技术中的一般含义使用，且为了更清楚，是指由收集器组件接收的电磁能聚焦所在的虚拟点。当样品穿过询问区域时，其流轴145与收集器组件146的光轴161重合。该仪器也包括侦测所收集的可侦测信号的侦测器150。
[0078]包含或怀疑包含分析物142的样品经由样品入口 134供应至封闭射流流槽132。参看图4A，在一些具体实例中，样品在流径138中自询问区域148流向收集器组件146的顶点159。参看图4B，在其它具体实例中，样品在流径138中自收集器组件146的顶点159流向询问区域148。在两种流动具体实例中，流径138的一部分穿过收集器组件146的内部体积167。图3也说明样品自收集器组件146的顶点159流向询问区域148的一具体实例。
[0079]在各种具体实例中，流槽132的一部分穿过收集器组件146或收集器组件146的壁中的区域或空间。举例而言，如图3、4A及4B中所示，收集器组件146经截顶且流槽132的一部分穿过对应于收集器组件146的顶点159的区域中的开口。预期流槽132可穿过凹形收集器组件的一部分或开口，包括顶点、顶点中的钻孔及/或一或多个侧壁中的开口或孔。
[0080]询问区域148与收集器组件146的焦点145重合。在一些具体实例中，询问区域148可为与收集器组件146的焦点163重合的单个点。在其它具体实例中，举例而言，如图4A中所示，询问区域148可具有位于收集器组件146的焦点FP上游及/或下游O μ m至约150 μ m范围内的最大外边界。其它适合的边界(位于收集器组件146的焦点163的上游、下游或上游与下游)包括例如Oym至约100 μ m、约I μ m至约80 μ m、约5 μ m至约70 μ m、约10 μ m至约60 μ m、约15 μ m至约50 μ m、约20 μ m至约40 μ m、约15 μ m至约30 μ m、约
100μ m至约150 μ m、约50 μ m至约150 μ m及约30至约100 μ m。适合的边界距离也可包手舌 ?列如会勺 O μ m、I μ m、2 μ m、3 μ m、4 μ m、5 μ m、6 μ m、7 μ m、8 μ m、9 μ m、10 μ m、15 μ m、20 μ m、25μηι>30μηι>35μηι>40μηι>45μηι>50μηι>55μηι>60μηι>65μηι>70μηι>75μηι>80μηι>85ym、90ym、95ym、100ym、105ym、110ym、115ym、120ym、125ym、130ym、135ym、140 μ m、145 μ m 及 150 μ m。
[0081]流径138中穿过询问区域148的部分与收集器组件146的光轴161同轴对准。
[0082]如本发明中所使用，「同轴(coaxially)」是指组件关于其各别轴在约0°至约15°的容限内对准。举例而言，适合的容限包括约0°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、
8。、9。 、10。 、11。 、12。 、13。 、14。及 15° 。
[0083]通过照射源(图3中未示)或经由使用光学配置(其例示性具体实例在下文详细描述)将照射源发射的电磁能聚焦于询问区域148上来照射询问区域148的样品。分析物142响应于照射而产生可侦测信号。收集器组件146收集该可侦测信号且将可侦测信号反射或传输至侦测分析物142的侦测器150。仪器及方法可视情况包括用于分选位于询问区域148下游的分选区域152的分析物142的分选能源。
[0084]流槽132为封闭流槽，其具有样品入口 134、样品出口 136及设定于样品入口 134与样品出口 136之间的流径138。流槽可具有任何适合的横截面形状，包括(但不限于)圆形、椭圆形、矩形、正方形或任何其它多边形。在各种具体实例中，流槽为具有圆形横截面形状的圆筒形。在本文所述的任一具体实例中，流槽132可视情况包括包围询问区域148的球形模制物154 (如图3中所示)。球形模制物154可由折射率在询问区域处的流槽132的壁的折射率的适合容限内的材料形成。如下文详细论述，球形模制物可减轻或消除由流槽壁-空气界面所导致的可侦测信号的折射失真。该容限可例如在O至0.1的范围内。
[0085]如本文中所使用，「封闭流槽(closed flow cell)」是指流槽132,其中流径138中穿过询问区域148及穿过分选区域152的至少一部分为封闭流径。如本文中所使用，「封闭流径(closed flow path)」是指具有以流槽壁为边界且无分裂或分叉的整体流径的流径。如本文中所使用，「分裂(division)」及「分叉(bifurcation)」是指流径变成两个或两个以上各别路径的任何分离。因此，本发明的封闭流槽132包括位于询问区域148与分选区域152之间并穿过询问区域148及分选区域152的流径138，其具有完整边界且未分裂。因此，在本发明的流槽132中，分选区域152处的分选是通过聚焦于分选区域152上的分选能量而不通过将样品实体分选至分裂的流径中来实现。封闭流槽有利地消除由习知未封闭流槽中样品液滴与空气之间的界面引起的对电磁能的不当折射作用。如下文详细论述，然而，本发明的具体实例可进一步包括位于分选区域152下游(例如在样品出口 136处)的实体分选区域，其用于在施加分选能量后实体分选样品，及/或用于将流动流体分裂为各别组分，例如(但不限于)用于自含有分析物的样品分离一些鞘流体。
[0086]本发明的方法的阶段及执行该方法的仪器将在下文详细描述。下文个别所述的流体动力学聚焦组件、照射方法、光学配置及分选方法可在根据本发明的具体实例的方法及仪器中任意组合使用。
[0087]流体流及流体动力学聚焦
[0088]将鞘流体及分析物流体注入射流流径138中。举例而言，流体动力学聚焦组件可在流槽中形成分析物于鞘流体或层流中的芯鞘流。芯鞘流或层流可在穿过询问区域148之前为实质上稳定的。芯鞘流的流速可为约Im / s至约60m / S。芯鞘流中的分析物142可隔开以使得每秒约10，000至约300，000个细胞穿过询问点148。分析物142之间的间距可通过例如调整芯流及鞘流的相对速度及/或流速来调整，而其又可通过流动控制系统来完成，该系统调节各别信号传至连接于鞘流体及样品流体的各别供应器的泵。
[0089]一些射流系统(诸如(但不限于)芯鞘流)具有使非对称细胞、粒子或分析物定向以使得细胞、粒子或分析物的长轴与流体流的方向同轴对准的性质。熟习此项技术者充分了解某些精子(包括许多类型的哺乳动物精子)的情况确实如此，且已证明精细胞可在芯鞘流中对准以使得细胞的长轴与该流实质上同轴。因此，在一些具体实例中，芯鞘流或其它流动方法可提供其中所载运的粒子(例如哺乳动物精细胞)的纵向对准。
[0090]粒子在流中的纵向对准具有实际益处，例如(但不限于)用于分析精子的脱氧核糖核酸(DNA)含量。精子带有DNA，且可在流动式细胞量测仪中，使用可用于处理细胞的荧光染料(诸如4'，6_二甲脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐或双苯甲亚胺(Hoechst33312))得到与个别细胞中的DNA量有关的荧光量测来直接或间接量测精细胞中的DNA相对量。因为在包括(但不限于)许多哺乳动物的一些物种中，精细胞可含有X或Y染色体，其预示精细胞与卵母细胞结合的后代的雌性或雄性(分别)性别，且因为X及Y染色体可具有不同大小，并进一步因为精细胞中的其它染色体及DNA的总量可相对不变，所以经适当荧光染色的精细胞的荧光可用于判定其是否含有X或Y染色体。然而，精细胞可关于主纵轴呈非圆柱形对称。例如(但不限于)人类及牛精细胞确实如此。该等细胞具有扁平细胞主体，也称为头部，且熟习此项技术者充分了解该等不对称主体各向异性地发射荧光，以使得一个方向上的突光可显著不同于关于精细胞长轴的另一个方向上的突光。因此之故，在未首先测定相对于侦测器的旋转角度的情况下难以精确量测精细胞在关于精细胞长轴的各方向上发出的荧光。定向及/或判定精细胞在流中的位向的方法已为熟习此项技术者所知，且区别带有X及Y染色体的精细胞已达成必要的精确度，例如Johnson的美国专利第5，135，759号，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中。然而，在长轴方向上精细胞的荧光相对不变，此与细胞关于长轴的旋转有关。Meistrich及G6hde等人(1978:Resolution of X and Yspermatids by pulse cytophotometry.Nature274(5673):821-823)及其它文献已证明当使精细胞在流体流(例如芯鞘流)中纵向定向时，且当使荧光侦测光学组件与该流同轴定向时，实际上可达成带有X及Y染色体的精细胞的区别。
[0091]已有利地确定，在流体动力学聚焦期间施加于细胞上的应力可根据最大局部能量耗散速率来量测且与基于剪切应力的预测相比，该量测可更好地预测因流体动力学聚焦而引起的样品中细胞死亡率。能量耗散速率(energy dissipation rate,EDR)可使用下式计算:[0092]ε = μ^7υ+ νυτ\.νυ
[0093]其中ε为EDR，μ为黏度，(Vt/+ 为应力张量，vt；为速度梯度张量，且ViZr为Vt；的转置。EDR说明作用于悬浮液中的细胞的剪切力与拉伸力。
[0094]在一些具体实例中，流体动力学聚焦组件可并入流槽132的一部分中以形成芯鞘流。流体动力学聚焦组件可有利地提供以下一或多个优点:在芯鞘流中形成分析物粒子的层流，消除或最小化芯流注入鞘流的注入点155处的回流，使得芯流相对于鞘流的稀释因子小于20: 1，维持稳定的芯流大于0.200mm及多至数公分，最小化分析物粒子所经历的剪切应力，最小化分析物粒子所经历的最大局部能量耗散，及/或以每秒大于10，000个粒子及每秒至多300，000个粒子的速率形成分析物的单行流。流体动力学聚焦的其它已知优点也涵盖于本文中。
[0095]流体动力学聚焦组件可置于流径138中的任何适合位置，只要在样品穿过询问区域148前形成稳定的层流或芯鞘流即可。
[0096]图5A说明可用于本发明的方法及仪器中的流体动力学聚焦组件157的一具体实例。图5B为经由图5A上所示的线A-A'所得的图5A的流体动力学聚焦组件157的横截面影像。参看图5A及5B，例 示性流体动力学聚焦组件157具有外流径156及安置于外流径156内部的内流径158。内流径158及外流径156可各具有各别流轴160、162，且流轴160、162可同轴对准。外流径可设定例如鞘流体164的流径，且内流径可设定例如含有或怀疑含有分析物142的样品141的流径。
[0097]外流径156可具有最大半径166，例如其范围为约0.4mm至约20mm、约0.6mm至约15mm、约0.8mm至约10mm、约Imm至约8mm、约IOmm至约20mm、约Imm至约20mm、约2mm至约18_、约4_至约16_、约6_至约14_、约8_至约12_、约0.4mm至约1_、约0.6mm至约0.7mm、约0.5mm至约0.7mm、约0.5mm至约1mm、及约0.4mm至约0.8mm。其它适合的最大半径 166 包括例如约 0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55.0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、
0.85mm、0.9mm、0.95mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm及 20mm。在一些具体实例中，最大半径 166 为约 0.628mm。
[0098]内流径158可具有最大半径168，例如其范围为约20 μ m至约IOOOumJS 30 μ m至约40 μ m、约35 μ m至约40 μ m、约35 μ m至约45 μ m、约30 μ m至约45 μ m、约20 μ m至约80 μ m、约 20 μ m 至约 100 μ m、约 20 μ m 至约 500 μ μ m、约 10 μ m 至约 500 μ m、约 10 μ m 至约40 μ m、约10 μ m至约80 μ m、约10 μ m至约100 μ m。其它适合的半径168包括例如约20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、200 μ m、300 μ m、400 μ m、500 μ m、600 μ m、700 μ m、800 μ m、900 μ m及1000 μ m。在一些具体实例中，内流径的最大半径168为约 38 μ m。
[0099]流体动力学聚焦组件157可包括包围内流径158的壁170。壁170可具有外直径172，例如其范围为约50 μ m至约300 μ m、约100 μ m至约200 μ m、约150 μ m至约200 μ m、约50 μ m至约250 μ m及约100 μ m至约300 μ m。其它适合的直径172包括例如约50 μ m、60 μ m、70um、80um、90um、100um、125um、150um、175u m、200 μ m、225 μ m、250 um、275um 及300 um0在一些具体实例中，外直径172为约191μπι。
[0100]包围内流径158的壁170的外表面174可在向着内流径158及外流径156的会聚点178安置的末端176处呈锥形。举例而言，自锥体182的开头部分181至流径156、158的会聚点178的距离180可在约200 μ m至约1000 μ m、约500 μ m及约600 μ m、约550 μ m至约 560 μ m、约 550 μ m 至约 600 μ m、约 400 μ m 至约 700 μ m、约 400 μ m 至约 1mm、约 200 μ m至700 μ m或约300 μ m至约600 μ m的范围内。其它适合的距离180包括例如约200 μ m、250 μ m、300 μ m、350 μ m、400 μ m、450 μ m、500 μ m、550 μ m、600 μ m、650 μ m、700 μ m、750 μ m、800μπι、850μπι、900μπι、950μπι 及 1000 μ m。在一些具体实例中，距离 180 为约 555 μ m。
[0101]同轴流轴160、162与包围内流径158的壁170的锥形外表面182之间的角度184可介于约0.1°与约15°之间；或者介于约0.1°与约10°之间；或者介于约5°与约10°之间；或者介于约5°与约10°之间；或者介于约8°与约12°之间；或者介于约5°与约15°之间；或者介于约9°与约11°之间；或者介于约9.5°与约10.5°之间。其它适合的角度 184 包括例如约 0.1° ,0,2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、1.5。、2°、2.5°、3°、3.5°、4°、4.5。、5°、5.5°、6°、6.5。、7°、7.5°、8°、8.5。、9°、9.5°、10。、10.5°、11。,11.5°、12。、12.5°、13。,13.5°、14。、14.5° 及 15°。在一些具体实例中，角度184为约10°。
[0102]外流径156的外表面186自第一点188至第二点190可呈锥形。第二点190可为对应于形成稳定芯鞘流192的点，而在一些具体实例中，第一点188可与包围内流径158的壁170的外表面174的锥体182的开头部分共平面，位于与内流径158及外流径156均正交的平面上。沿流径138的轴160、162自第一点188至第二点190的距离可在约Imm至约 1.1_、约 0.8mm 至约 1.1_、约 0.8mm 至约 1.2_、约 0.5mm 至约 1.2_、约 0.56mm 至约
1.1mm、约0.56mm至约1.2mm的范围内。其它适合的距离194包括例如约0.5,0.52,0.54、0.56、0.58、0.6、0.62、0.64、0.66、0.68、0.7、0.72、0.74、0.76、0.78、0.8、0.82、0.84、0.88、0.9、0.92、0.94、0.96、0.98、1、1.02、1.04、1.06、1.08、1.1、1.12、1.14、1.16、1.18 及 1.2。在一些具体实例中，距离194为约1.062mm。
[0103]同轴流轴160、162与外流径156的锥形外表面186之间的角度196可在约15°至约45°、约15°至约35°、约25°至约45°、约25°至约35°、约27°至约33°或约29°至约31°的范围内。其它适合的角度196包括例如约15°、16°、17°、18°、19°、20°、
21。、22。、23。、24。、25。、26。、27。、28。、29。、30。、31。、32。、33。、34。、35。、36°、37°、38°、39°、40°、41°、42°、43°、44 及 45°。在一些具体实例中，角度 196 为约 30。。
[0104]流过外流径156的鞘流体164的流动速率可介于每秒约20mm3与每秒约600mm3之间；或者每秒约20mm3至每秒约400mm3 ;或者介于每秒约20mm3与每秒约200mm3之间；或者介于每秒约20mm3与每秒约IOOmm3之间；或者介于每秒约20mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约25mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约35mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约40mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约50mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约75mm3与每秒约85mm3之间；或者介于每秒约80mm3与每秒约81mm3之间；或者每秒约500mm3至每秒约600mm3 ;或者每秒约IOOmm3至每秒约600mm3 ;或者每秒约200mm3至每秒约400mm3 ;或者每秒约300mm3至每秒约500mm3 ;或者每秒约400mm3至每秒约500mm3 ；或者每秒约300mm3至每秒约400mm3 ;且尤其为每秒80.3mm3。举例而言,适合的速率包括每秒约 2Omm3、2 5mm3、3Omm3、3 5mm3、40mm3、45mm3、5Omm3、5 5mm3、6Omm3、6 5mm3、7Omm3、7 5mm3、8Omm3、8 5mm3、9 0mm3、9 5mm3、100mm3、120mm3、140mm3、160mm3、180mm3、200mm3、220mm3、240mm3、260mm3、280mm3、300mm3、3 20mm3、340mm3、360mm3、380mm3、400mm3、420mm3、440mm3、460mm3、480mm3、500mm3、520mm3、540mm3、560mm3、580mm3 及 600mm3。
[0105]芯流体(也即样品141)流过内流径158的速率可为每秒约0.1mm3至每秒约30mm3 ；每秒约IOmm3至每秒约30mm3 ;每秒约15mm3至每秒约20mm3 ;每秒约Imm3至每秒约30mm3 ;每秒约2mm3至每秒约20mm3 ;每秒约4mm3至每秒约18mm3 ;每秒约6mm3至每秒约16mm3 ;每秒约8mm3至每秒约IOmm3 ;每秒约20mm3至每秒约30mm3 ;每秒约0.1mm3与每秒约IOmm3 ;或者介于每秒约2mm3与每秒约IOmm3之间；或者介于每秒约3mm3与每秒约IOmm3之间；或者介于每秒约3mm3与每秒约8mm3之间；或者介于每秒约3mm3与每秒约6mm3之间；或者介于每秒约3.5mm3与每秒约4.5mm3之间；且尤其为每秒约4mm3或每秒约3.93mm3。其它适合的速率包括例如每秒约 0.lmm3>0.2mm3>0.3mm3>0.4mm3>0.5mm3>0.6mm3>0.7mm3>0.8mm3>0.9mm3、1mm3、2mm3、3mm3、4mm3、5mm3、6mm3、7mm3、8mm3、9mm3、10mm3、11mm3、12mm3、13mm3、14mm3、15mm3、16mm3、17mm3、18mm3、19mm3、20mm3、21mm3、22mm3、23mm3、24mm3、25mm3、26mm3、27mm3、28mm3、29mm3及 30mm3。
[0106]在各种具体实例中，流体动力学聚焦组件157可产生鞘直径在以下范围内的稳定芯鞘流192:介于约10 μ m与约50 μ m之间；或者介于约10 μ m与约40 μ m之间；或者介于约10 μ m与约30 μ m之间；或者介于约10 μ m与约20 μ m之间；或者介于约20 μ m与约30 μ m之间；或者介于约20 μ m与约40 μ m之间；或者介于20 μ m与约50 μ m之间；或者介于约30 μ m与约40 μ m之间；或者介于约30 μ m与约50 μ m之间；或者介于约25 μ m与约35 μ m之间；且尤其为约30μπι。在各种具体实例中，流体动力学聚焦组件157可产生芯直径在以下范围内的稳定芯鞘流192:介于约I μ m与约10 μ m之间；或者介于约2 μ m与约9 μ m之间；或者介于约3μηι与约10 μ m之间；或者介于约5μηι与约10 μ m之间；或者介于约5μηι与约7 μ m之间；或者介于约5 μ m与约15 μ m之间；且尤其为约6 μ m。
[0107]在其它具体实例中，芯鞘流可例如如美国专利第5，007，732号中所述来形成，该专利以引用的方式并入本文中。参看图6，芯鞘流可例如使用具有安置于鞘流体流200中心的样品试管的流体动力学聚焦组件198来形成，含有或怀疑含有分析物142的样品经该样品试管流动。流体动力学聚焦组件198包括具有一个具有光滑表面的侧壁202A及另一个具有粗糙表面的侧壁202B的毛细管流动通道202。层流在毛细通道中形成且借助于配置样品及鞘流体流而形成芯鞘流。在一些具体实例中，图6中所示的流体动力学聚焦组件198可经改良用于仅注射样品流体而不注射鞘流体200以在毛细管区域中诱导层流而不一定形成芯鞘流。
[0108]参看图7A，芯鞘流可例如通过在与收集器组件(图中未示)的光轴正交的平面内引入鞘流体200及含有分析物142的样品141并将流导引穿过加速区域204用于产生芯鞘型流来形成。样品141经由安置于鞘流体流径中的孔或腔室引入鞘流200的中心。两个流皆进入加速区域204且形成稳定芯鞘流。如图7B中所示，鞘流200可在加速区域204上方具有旋转流动，其可有助于样品141的芯形成。参看图7C，该流在加速区域204后稳定以形成稳定芯鞘流。
[0109]在其它具体实例中，层流可通过形成毛细管的流槽的至少一部分且使样品流穿过该毛细管，导致分析物的排序来达成。[0110]如美国专利第7，340, 957号及美国专利公开案第2010 / 0009333号及第2009 /0162887号中所述，该等专利的揭示内容各以全文引用的方式并入本文中，流槽及/或任一上述流体动力学聚焦组件可用于声学聚焦装置以进一步提纯样品流。举例而言，如图8中所说明，样品的分析物142可使用声学聚焦在样品流中更加中心对准。样品流过流槽，经过转换器206，其发射在样品流体中诱导驻波的机械波长。分析物被吸引至样品流的中心，因为此中心为驻波中最稳定的区域。声学聚焦可用于任何上述流体动力学聚焦方法以进一步增强样品流动以用于照射及侦测。
[0111]照射
[0112]样品可用足以在照射时激发或以其它方式引发来自分析物的可侦测信号的任何来源的电磁能及任何类型的电磁能进行照射。举例而言，来自照射源(或通过光学配置自其聚焦)的电磁能可入射于分析物上，且可使得光反射离开或透射穿过分析物中的一或多个要素或反射于分析物表面上。或者或另外，电磁能可入射于分析物上或分析物中的要素上且可由分析物中的一或多个要素吸附或吸附于分析物表面上并可使得一或多个要素发射可侦测信号，诸如光或其它电磁能。在一些具体实例中，要素内部或表面上可为添加至分析物(例如细胞)中的标记物(天然存在或不存在)。举例而言，该标记物可响应于照射而发射荧光信号。在一具体实例中，标记物为荧光染料，诸如4'，6-二甲脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐或双苯甲亚胺(Hoechst33312)。
[0113]如本文中所使用，「照射(illumination)」是指照射、激发或其它高能刺激分析物或要素或标记物以产生可侦测反应。举例而言，电磁能可为可见光谱中的光、红外光谱中的光及/或紫外光谱中的光。其它类型及波长的适合电磁能也可用于本发明的任一所述具体实例中。
[0114]照射源可为任何适合来源的电磁能。举例而言，照射源可为雷射或非相干光源，诸如汞弧灯、钨丝灯、金属卤化物灯、氙气灯或发光二极管。在一些具体实例中，电磁能可例如通过使用四分之一波片来加以圆偏振。圆偏振可有利地降低可侦测信号的偏振依赖性。在一些具体实例中，侦测器或与侦测器组件对准的一或多个平面镜(如下文详细描述)可包括可减轻所侦测或量测的信号对照射源偏振的依赖性的偏振组件。
[0115]在一些具体实例中，照射源151直接照射询问区域148处的样品。举例而言，一或多个照射源可以相对于流轴的任何所需角度照射询问区域处的样品。举例而言，照射源可在与流轴正交的平面内照射询问区域处的样品。其它照射角度也可为适合的。举例而言，在各种具体实例中，照射源可与流轴同轴照射询问区域处的样品。
[0116]可自一或多个方向以点状、角状、立体角状或任意区域形状照射询问区域。诸如平面镜的平坦光学组件可并入下文详细描述的任一照射方法及组态以将电磁能的路径转向至仪器的所需区域(例如另一光学组件或询问区域)，以达成仪器的光学配置的通用性。举例而言，该等平坦光学组件可用于使收集器组件、侦测器、光学组件(若存在)及分选能量(若存在)以除同轴外的方式对准。在一些具体实例中，电磁能的该重导引可使收集器组件、侦测器、光学组件(若存在)及分选能量(若存在)中的一或多者达成更紧凑配置。
[0117]在一些具体实例中，以旋转对称照射询问区域。如本文中所使用，「旋转对称(rotational symmetry) J是指关于任何指定轴呈旋转对称来照射询问区域。在其它具体实例中，呈轴对称来照射询问区域。如本文中所使用，「轴对称(axisymmetrically)」是指关于收集器组件是光轴呈旋转对称来照射询问区域。尽管由于例如仪器的组件引起电磁能路径中断或受阻，但照射仍被视为旋转对称或轴对称，只要照射呈旋转对称或轴对称而未中断或受阻即可。举例而言，自任何所选方向入射于询问区域上的相干光源可经选择以使入射角相对于彼此或相对于收集组件的轴为约54.7°，其中54.7°为此项技术中已知在一些情况下有利于降低与偏振有关的量测难度的角度(Asbury等人Cytometry40:88—
101(2000))。该照射呈旋转对称。
[0118]在其它具体实例中，自单一方向或自不由旋转对称定义的许多方向照射询问区域。仅举例而言(但不限于)，该非对称照射方案可包括使用自垂直于询问区域处的流轴的平面会聚于询问点的若干雷射束，以使得照射源的入射角无规律地间隔且与旋转对称无关。
[0119]在各种具体实例中，可使用一或多个照射源以关于询问区域处的流轴分布的各种角度直接照射询问区域的样品。在该等具体实例中，来自照射源的光可以所需照射角度直接聚焦于询问区域上或可使用一或多个平坦光学组件以所关注角度将电磁能导引至询问区域。
[0120]图9说明以与询问区域148处的流轴正交的角度照射询问区域148处的分析物142的一具体实例，该角度也与收集器组件的光轴正交(与询问区域148附近的流轴同轴对准)。在图9中所描绘的具体实例中，照射源151直接照射询问区域148。图9说明位于询问区域处的流槽132，其中收集器组件的光轴延伸至页面中及自页面延伸出。也预期一或多个光学组件可插入照射源151与询问区域148之间以按与询问区域148附近的流轴正交的角度导引照射。举例而言，当电磁能自时，呈45°角的平面镜可与照射源151发射电磁能的路径呈90°导引电磁能。可使用其它角度及多个镜转向来自照射源151的电磁能以使照射源151达成更方便及/或紧凑的置放。
[0121]图10说明使用多个照射源151a、151b、151c (通过电磁能149的射束)在与收集器组件的光轴(及因此询问区域148附近的流轴)正交的平面上照射询问区域148处的分析物142的实例。图10说明询问区域处的流槽132，其中收集器组件的光轴延伸至页面中及自页面延伸出。一或多个照射源可自一或多个方向、以大于0°至小于360°的弧形角度在与询问区域处的流轴实质上正交的平面上照射样品。举例而言，轴对称照射询问区域148处的样品可使用多个照射源以关于询问区域处的流轴分布的角度达成。举例而言(但不限于)，三个照射源可与询问区域148处的流轴呈90° (与其正交)配置，彼此呈100°、140°及120°配置。如本文中所使用，因为关于收集器组件的光轴存在旋转对称照射，所以该照射被视为轴对称。在一些具体实例中，可使用四个照射源自偏移90°的方向直接照射询问区域。可使用任何适合数目个照射源。
[0122]在其它具体实例中，一或多个照射源可自一或多个方向、以大于O°至小于360°的弧形角度照射相对于询问区域148处的流轴呈任何角度的平面上的样品。举例而言，可以倾斜于流轴(与收集器组件的光轴同轴对准)的角度照射询问区域148。
[0123]举例而言，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上照射源。使用多个照射源的具体实例可展现高信号强度及中等特异性，同时最低限度地影响收集器组件对发射、传输或反射的电磁能的收集。一或多个孔、间隙或开口可设置于收集器组件中以允许多个照射源以多个方向进行照射。[0124]参看图11，在一些具体实例中，流槽132可用作波导以便沿流槽132的至少一部分(例如穿过询问区域148的部分)进行照射。照射源151 (图11中未示)聚焦于流槽132的开口或半透明部分上，或来自照射源151的电磁能使用一或多个可聚焦的光学组件导引至其上。举例而言，可使用弧光灯作为照射源151。流槽132将电磁能149经由流槽132中继至询问区域148，从而照射询问区域148中的分析物142。毛细管型流槽尤其适用于该等具体实例。经由毛细管照射有利地不易失准，相对易于对准，且提供询问区域148处的分析物的均匀照射，因为波导中的强度变化极小。
[0125]图12说明电磁能149相对于询问区域148附近的样品流轴略微离轴地照射样品的一具体实例，该流轴与收集器组件146的光轴同轴对准。
[0126]在其它具体实例中，可使用一或多个照射光学组件及/或收集器组件146将来自照射源151的电磁能导引并聚焦于询问区域148上。参看图13，在一些具体实例中，凹形收集器组件146可充当用于照射的光学组件与收集组件。在该等具体实例中，收集器组件146接收来自照射源151或来自另一光学组件的电磁能149且将电磁能149聚焦于询问区域148上。在各种具体实例中，凹形收集器组件146可为使来自照射源151的电磁能聚焦的唯一光学组件。在其它具体实例中，收集器组件146可为光学配置的一部分且可充当用于将电磁能149聚焦于询问区域148上的最后光学组件。
[0127]参看图14，在各种具体实例中，照射源151可聚焦于圆锥形光学组件208上，该圆锥形光学组件将光传输至凹形光学组件210或传输至充当光学组件的凹形收集器组件146。凹形光学组件210使环形、锥形或其它任意形状的电磁能关于询问区域148聚焦。在一些情况下，电磁能关于询问区域148呈旋转对称聚焦。在其它实例中，电磁能关于询问区域148呈轴对称聚焦。需要或适宜时，此光学配置可进一步包括平坦光学组件(图中未示)用于进一步自凹形光学组件210聚焦电磁能。
[0128]在一些具体实例中，凹形光学组件210可为具有一般凹形形状的环形光学组件。任何其它适合形状(诸如抛物线体、圆锥形组件、双曲线体、椭球体及类球体)可用作此光学配置或以下任一光学配置中的凹形光学组件。其它形状也可用作凹形光学组件，包括(但不限于)三维二次方程式的一般数学形式的一些表面或与其有关的一些表面，例如f (X, Y，z) =ax2+by2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0o 除非另外规定，否则术语「凹形光学组件(concave optical element)」、「第一凹形光学组件(first concave opticalelement)」及「第二凹形光学组件(second concave optical element)」在本发明中应理解为一般指凹形光学组件的所有可能具体实例。本文中应了解，尽管光学组件壁中存在中断或间隙，但凹形光学组件可例如视为大致椭球形或其它形状。举例而言，在一些具体实例中，凹形光学组件可在顶点处及/或在光学组件侧壁处包括开口。举例而言，若提供缺失的壁，则基于环形的大致形状，环形光学组件一般可视为椭球体、抛物线体、双曲线体或类球体。在一些具体实例中，凹形光学组件为用于将电磁辐射反射至所需位置的镜面。
[0129]在使用圆锥形光学组件208的上述或以下任一具体实例中，圆锥形光学组件208可具有任何适合的基础形状且可为直圆锥或斜圆锥。圆锥形光学组件208相对于凹形光学组件210的配置视凹形光学组件210的形状及圆锥形光学组件208的形状(直或斜)而定。配置圆锥形光学组件208及凹形光学组件210而使得光以平面、环形或任何任意形状传输可如此项技术中所知通过相对于凹形光学组件210的内部体积中的一点置放圆锥形光学组件208来达成。圆锥形光学组件208可沿凹形光学组件210的光轴对准。举例而言，在一些具体实例中，圆锥形光学组件208与凹形光学组件210的焦点重合。在其它具体实例中，圆锥形光学组件208可相对于凹形光学组件210的焦点向着或远离凹形光学组件210的顶点位移。在一些具体实例中，可使用平面镜将来自圆锥形光学组件208的照射转向凹形光学组件210以使得圆锥形光学组件208不必与凹形光学组件210同轴对准。照射源可与圆锥形光学组件208同轴对准。在凹形光学组件210、圆锥形光学组件208及照射源151同轴对准的具体实例中，凹形光学组件210可在顶点处包括间隙或开口以允许来自照射源151的电磁能通畅地传至圆锥形光学组件208。或者，照射源151可相对于圆锥形光学组件208的光轴失准且可使用一或多个平坦光学组件使电磁能偏转至圆锥形光学组件208。在该等具体实例中，凹形光学组件210也可在顶点处包括间隙或开口以允许电磁能通畅地传递。
[0130]图15说明使用多个凹形光学组件照射样品的一具体实例。如图15中所说明，光学配置可如上文参照图14所述，但可进一步包括第二凹形光学组件212。由第一凹形光学组件210传输或反射的电磁能149导引至第二凹形光学组件212而非直接聚焦于询问区域148上。举例而言，圆锥形光学组件208可相对于第一凹形光学组件210配置，以使得凹形光学组件210将环形电磁能149传输或反射至第二光学组件212。接着第二凹形光学组件212将环形电磁能149呈圆锥形式聚焦于询问区域148上。第二凹形光学组件212使电磁能149关于询问区域聚焦。在一些情况下，电磁能旋转对称聚焦，在其它实例中，电磁能关于收集器组件的光轴旋转对称(也即轴对称，其中相关轴为收集器组件的光轴)。在一些具体实例中，如图15中所说明，第一光学组件210及第二光学组件212及圆锥形组件208彼此同轴对准且与凹形收集器组件146同轴对准。在其它具体实例中，光学组件中的一或多者可与光学组件中的另一或多者失准及/或可使用收集器组件146及平坦光学组件将电磁能149导引至所需区域或光学组件。
[0131]在一些具体实例中，第一凹形光学组件210及第二凹形光学组件212为抛物线体且收集器组件146为椭球体。在该等具体实例中，第一抛物形光学组件210接收来自圆锥形光学组件208的电磁能149且将电磁能149以环形反射或传输至第二抛物形光学组件212。第二抛物形光学组件212将所接收的电磁能149聚焦于询问区域148上。
[0132]第一凹形光学组件210及第二凹形光学组件212可具有任何适合的形状。举例而言，第一凹形光学组件210及第二凹形光学组件212中的一者或两者可为椭球体、抛物线体、双曲线体或类球体，只要该等组件经配置以使得第二凹形光学组件212接收来自第一凹形光学组件210的电磁能149且将电磁能149聚焦于询问区域148或收集器组件146上即可。如上文所述，在一些具体实例中，收集器组件146也可用作光学组件以将电磁能149聚焦于询问区域148上。在使用第一凹形光学组件210及第二凹形光学组件212的具体实例中，也预期电磁能149自第二凹形光学组件212传输或反射于凹形收集器组件146上，其接着将电磁能149聚焦于询问区域148上。若照射询问区域148中的分析物，则凹形收集器组件146也将用以接收并收集可侦测信号。
[0133]在图15中所描绘的具体实例中，流槽132进入第一凹形光学组件210与凹形收集器组件146之间的光学配置，接着穿过收集器组件146的顶点处的开口。然而，也涵盖其它流槽配置。举例而言，流槽132可经由收集器组件146的侧壁或侧壁区域中的间隙(图中未示)进入收集器组件146的内部体积，接着转而穿过询问区域148以使得流槽132中穿过询问区域148的部分与收集器组件146的光轴同轴对准。可使用流槽132相对于收集器组件146及光学组件的任何其它配置，只要询问区域148附近的流轴与收集器组件146的光轴同轴对准且在询问区域148上游形成稳定的层流或芯鞘型流即可。
[0134]在各种具体实例中，可使用物镜作为将来自照射源151的电磁照射聚焦于询问区域148上的光学组件。该物镜可与询问区域148附近的流槽132的流径138同轴对准。在一些具体实例中，样品可经导引以自物镜流走。图16说明使用物镜217作为收集器组件且样品自物镜217流走的一例示性具体实例。在图16中所示的具体实例中，自平面样品源达成流体动力学聚焦。然而，可如上文所述使用其它流体动力学聚焦方法及仪器。在图16中所描绘的实施例中，鞘流体200及样品流体141流过加速区域204以在询问区域148上游产生稳定芯鞘流。现参看图17，物镜317可经改良以允许流体动力学聚焦仪器及/或样品流穿过物镜317。在图17中所描绘的具体实例中，用于引入样品141的流径穿过经改良的物镜317。
[0135]来自照射源(图中未示)的电磁能由物镜217或317或由另一光学组件聚焦于询问区域148上。物镜217或317也充当收集器组件，其具有与询问区域148重合的焦点且与一或多个其它光学组件合作以将自询问区域148中的分析物发射的能量导引至侦测器。该配置有利地允许使用物镜217或317而无需将流转向绕过物镜。与流必须在物镜217或317周围转向的习知系统相比，此可有利地将分选区域152置于询问区域148下游较远处。
[0136]应了解任一上述光学配置中所说明的具体实例可包括其它组件。在许多具体实例中，侦测器、分选能源及使电磁能转向的平面镜可能未展示，但应理解为包括于适合配置中。其它组件也可包括:光学组件，诸如可有效调节及/或削弱光学或其它电磁信号、基于所侦测的电磁(例如光学)信号进行量测、特性化信号及/或信号强度的组件；及射流组件，诸如可有效引起鞘流体或分析物流动、量测流速或流量或调节流速或流量的组件。
[0137]收集及侦测
[0138]收集器组件146收集由分析物142及/或自分析物142、自分析物142中或表面上的要素或自分析物142中或表面上的标记物发射或传输的能量(可侦测信号)。为收集自询问区域148处的分析物142接收的可侦测信号及/或将其聚焦于侦测器150上，收集器组件146可使用任何数目个凹形反射表面几何形状，包括抛物线体几何形状、椭球形几何形状及/或其它形状，包括(但不限于)三维二次方程式的一般数学形式的一些表面或与其有关的一些表面，例如 f(x，Y，z) =ax2+by2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0? 除非另外规定，否则术语「收集器组件(collector element)」在本发明中应理解为一般是指收集器组件146的所有可能具体实例。当涵盖特定形状的收集器组件146 (例如椭球形、抛物线体等)时，「收集器组件」一词前将冠以适当描述词，诸如「抛物线体」或「椭球形」。本文中应了解，尽管收集器组件146的壁中存在中断或间隙，但凹形收集器组件146可视为例如大致椭球形或其它形状。举例而言，在一些具体实例中，收集器组件146可包括位于顶点处及/或收集器组件146的侧壁中的开口。举例而言，若提供缺失的部分，则基于环形的大致形状，环形收集器组件一般可视为椭球体、抛物线体、双曲线体或类球体。
[0139]返回参看图3，仅举例而言，收集器组件146 —般呈具有内部体积167的凹形。收集器组件146也具有光轴161及焦点163。收集器组件146进一步包括顶点159。在一些具体实例中，收集器组件146可具有环形或另外不完整外壁(例如一般形成的抛物线体、椭球体或球体)。如本文中所使用，「顶点」应理解为包括收集器组件146中对应于顶点的彼等区域，而不考虑收集器组件146是否包括壁或顶点处的开口。举例而言，如图3中所示，具有截顶形状的收集器组件146被视为具有顶点159，若未截顶，则实际顶点位于此处。
[0140]收集器组件146的光轴161与流径138中穿过询问区域148的部分同轴对准。另夕卜，收集器组件146的焦点FA与询问区域148重合。
[0141]在一些具体实例中，收集器组件146与一或多个凹形光学组件(诸如凹形光学组件210、212)同轴对准。在其它具体实例中，光学组态的凹形光学组件210、212中的一或多者可关于收集器组件146的光轴161离轴对准且可使用一或多个镜面将反射或传输的电磁能149导引至所关注区域，例如聚焦于询问区域148上。
[0142]在一些具体实例中，收集器组件146可与侦测器150同轴对准。在其它具体实例中，可使用光学组件将自收集器组件146收集的可侦测信号导引至侦测器150。举例而言，一或多个平面镜可将所收集的可侦测信号反射、重导引及/或聚焦至侦测器150或其上。
[0143]现参看图18，使用例如抛物线体收集器组件346可有利地以极高数值孔径轴对称地收集来自分析物142的可侦测信号。另外，抛物线体收集器组件346展现高选择性，对所检查的分析物敏感且对其他分析物及抛物线体收集器组件346的焦点外的其它来源的噪声不敏感。
[0144]仍参看图18，在一些具体实例中，抛物线体收集器组件346的体积可具有内部抛物形反射表面348，其对应于截顶圆形抛物线体的表面及尤其对应于经垂直于抛物线体的轴354的第一平面350及/或第二平面352截顶的圆形抛物线体的表面。在一些具体实例中，来自照射源151的电磁能可进入抛物线体收集器组件346的体积，在冲击询问点148处(也即抛物线体收集器组件346的焦点358处)的分析物前穿过第一平面350，但在冲击询问点148处的分析物前不入射于抛物线体收集器组件346的反射表面348上。在其它及/或另外具体实例中，由抛物线体收集器组件346收集的可侦测信号153通过穿过第一平面350而离开抛物线体收集器组件346。在图18中所描绘的具体实例中，可侦测信号153穿过近轴透镜251及针孔216，随后到达侦测器150。近轴透镜251及针孔216视情况存在且当在侦测之前使用任何类型的收集器组件进一步聚焦可侦测信号153时可包括两者。当使用抛物形收集器组件346时，因为所收集的可侦测信号一般以平行射束形式自抛物形收集器组件反射，所以可能尤其需要一或多个该等聚焦组件。
[0145]图18中所描绘的具体实例说明填有介质以减少对可侦测信号153的绕射作用的抛物线体收集器组件346。该介质由框147表示。下文详细论述用介质填充收集器组件146。已观察到，经填充的抛物形收集器组件346在焦点358处具有约68%的收集效率，而在焦点358上游100 μ m处展现仅约0.4%的收集效率。因此，抛物形收集器组件346显示高特异性以及高收集效率。穿过询问区域148的流轴相对于收集器组件346的光轴的失准也会降低收集器组件346的收集效率。该配置虽然不理想但可适合于各种具体实例。已观察到，穿过询问区域148的流轴相对于光轴50 μ m的失准导致抛物形收集器组件346的收集效率为34%且导致询问区域/点148上游的收集效率增加。
[0146]参看图19，在一些具体实例中，使用椭球形收集器组件446收集来自询问点148的光。椭球形收集器组件446可具有任何外表面形状，且由单一内部同轴椭球形反射器表面设定，该表面对应于可通过椭圆关于其长轴旋转所形成的截顶椭球体的表面。椭球体可在第一点处由平面450截顶，该平面由椭球体的短轴设定或者由与长轴正交且安置于椭球体的中心点与由椭球形收集器组件446设定的体积中的第一焦点之间的平面设定。在又一替代方案中，椭球体可在该第一点处由穿过椭球体的长轴且与由椭球体的短轴设定的平面形成锐角的平面截顶。在一些具体实例中，椭球体可另外在位于第一焦点454与设定椭球形收集器组件446的椭球体边界之间的第二点452处截顶。
[0147]类似于抛物线体收集器组件346，椭球形收集器组件446以极高数值孔径轴对称地收集来自分析物142的可侦测信号153且展现高选择性。另外，如上文所述的椭球形收集器组件446有利地向第二焦点456反射起源于第一焦点454的电磁能,该第二焦点可对应于针孔216位置，针孔216过滤不需要的电磁能(例如反射的照射电磁能)以免其到达侦测器150，第一焦点454与针孔254之间无需另一透镜或镜面。在一些具体实例中，流槽132可穿过椭球形收集器组件446的表面，且详言之可沿其长轴在第一焦点454与设定椭球形收集器组件446的椭球体边界之间穿过椭球形收集器组件446，流槽132可为含有芯鞘流(诸如通过流体动力学聚焦组件(诸如上述组件)所形成的芯鞘流)的试管。
[0148]如同图18中所描绘的具体实例，椭圆形收集器组件446说明为填充有介质(由框147表示)以减轻流槽壁/空气界面的折射作用。已观察到，经填充的椭圆形收集器组件446在第一焦点454 (与询问区域148重合)处具有约68%的收集效率，而在焦点454上游100 μ m处展现仅约0.003%的收集效率。因此，椭圆形收集器组件346显示高特异性以及高收集效率。
[0149]为减少或消除由流槽壁产生的对可侦测信号的干扰作用，收集器组件146(例如分别为抛物线体收集器组件346及椭球形收集器组件446)的内部体积可填充有折射率在询问区域148处的流槽132的壁的折射率的适合容限内的介质，以便最小化或消除沿能量路径的折射率变化所引起的可侦测信号153的能量绕射。该容限可例如在O至0.1的范围内。适合的介质包括例如此项技术中熟知为「折射率匹配流体」或「折射率匹配油」的材料。经填充的收集器组件146可与上述流体动力学聚焦方法及仪器及光学配置中的任一者组合使用。此外，收集器组件146可填充有与流槽折射率匹配的固体聚合物，以便最小化或消除沿能量路径的折射率变化所引起的可侦测信号的能量绕射。此外，流槽可部分在固体材料中制造，例如穿过固体材料的信道，且收集器组件可与固体材料的表面部分整体构建，例如构建于固体材料外表面上的凹形(相对于询问区域)光学组件。
[0150]在其它具体实例中，流槽132在询问区域148处包括整体形成的球形模制物154。球形模制物154也减少或消除光经由流槽132壁传输所产生的对可侦测信号的干扰。自分析物发射、经由分析物传输或由分析物反射的可侦测信号153 —般以与球形模制物154的表面正交的角度冲击球形模制物154，由此减轻或消除光穿过材料-空气(球形模制物表面-空气)界面时的折射作用。
[0151]球形模制物154可由与流槽132相同的材料形成，或在一替代性具体实例中，可由折射率在询问区域148处的流槽132的壁的折射率的适合容限内的材料形成，以便减少或消除沿能量路径的折射率变化所引起的可侦测信号153的能量绕射。该容限可例如在O至0.1的范围内。球形模制物的曲率可在约0%至约5%、约I %至约5%、约2%至约4%及约1%至约3%的容限内。其它适合的容限包括例如约1%、2%、3%、4%及5%。另外，球形模制物关于收集器组件146的焦点的对中可在约Omm至约5mm、约Imm至约4mm、约2mm至约3mm及约Imm至约3mm的容限内。其它适合的容限包括例如约0mm、1mm、2mm、3mm、4mm及5mm ο
[0152]球形模制物154在收集器组件146的焦点处有利地产生约75%的收集效率且在焦点上游或下游50 μ m的距离处产生相当于约0.00002%的收集效率的高选择性。在该等具体实例中，询问区域148宜极小且倾向于单个收集。
[0153]图20A说明球形模制物154及经球形模制物154向收集器组件146发射可侦测信号153及可侦测信号153传输至侦测器150或置于侦测器150之前的平坦光学组件或针孔216。图20B为经由球形模制物154发射可侦测信号153的特写示意图，其显示可侦测信号153不受模制物壁干扰。
[0154]在其它具体实例中，流槽壁-空气界面的折射作用可通过使询问区域148处的流槽壁薄化来减轻。举例而言，询问区域148处的流槽壁厚度可为约20 μ m至约2000 μ m、约40 μ m 至约 1500 μ m、约 60 μ m 至约 1000 μ m、约 80 μ m 至约 800 μ m、约 100 μ m 至约 600 μ m、约 200 μ m 至约 400 μ m、约 1000 μ m 至约 2000 μ m、约 20 μ m 至约 50 μ m、约 20 μ m 至约 80 μ m、约20 μ m至约200 μ m、约400 μ m至约1000 μ m或约1500 μ m至约2000 μ m。举例而言，适合的壁厚度可包括约 20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、150200μηι>250μηι>300μηι>350μ m、400 μ m>450 μ m>500 μ m>550 μ m>600 μ m>650 μ m>700 μ m>750 μ m、800 ym、850ym、900 ym、950ym、1000ym、1100ym、1200 ym、1300 ym、1400 μ m、1500 μ m、1600 μ m、1700 μ m、1800 μ m、1900 μ m 及 2000 μ m。在询问区域 148 处具有薄流槽壁而无其它减轻组件(诸如经填充的收集器或球形模制物154)的具体实例的收集效率可在收集器组件146的焦点处显示至多约50%的收集效率及在收集器组件146的焦点上游约100 μ m处显示约3%的收集效率。
[0155]参看图26，收集器组件可为例如物镜517，其中该物镜的焦点与询问区域148重合。可侦测信号由物镜收集且以环形传输至另一透镜517或将可侦测信号153聚焦于侦测器150上的其它聚焦组件。如上文关于图16及17所述,在一些具体实例中，物镜也可用于照射样品。在其它具体实例中，物镜可用于收集且照射可使用任一上述方法达成，包括例如自与询问区域148正交的照射源进行照射，如图26中所说明。
[0156]在各种具体实例中，仪器可进一步包括针孔216或平坦光学组件(例如二向色镜)，其与侦测器150对准以在侦测器150侦测之前聚焦所收集的可侦测信号153。
[0157]分选
[0158]在所述方法及仪器的一些态样中，分选细胞量测仪利用实体上及/或功能上修饰群体中的所选细胞以允许其区分的技术。也即，替代依靠通过位置、定位、容器或时间立即分离细胞，所述具体实例改为提供关于某种所需性质不活化、丧失能力、破裂、断裂、破碎或以其它方式改变(也即「修饰」)的细胞，该性质视情况允许分离或区分制备物中的子群。修饰的性质全部或部分视所鉴别细胞的所欲应用或用途而定及从而视所鉴别细胞与应用相关的特征而定。举例而言且仅出于解释或阐明的目的，在制备正常体细胞的情形下，若细胞繁殖能力受到不利影响或若细胞被杀死，则恶性或以其它方式永生或快速生长的细胞可视为功能上不活化。在另一实施例中，再次仅出于解释或阐明的目的，当应用需要自群体移除细胞子群(例如产生不合需要的蛋白质或其它物质的子群)时，分选细胞量测仪可通过消除此等细胞中该物质的产生，通过杀死该等细胞，及/或通过修饰该等细胞以允许其自群体实体移除来达成此结果。
[0159]在一些具体实例中，本发明所述的方法及仪器利用能源修饰细胞或诱导或起始可修饰细胞的过程，诸如化学活化。在各种态样中，由能源诱导的修饰包括对细胞的直接作用，包括(但不限于)修饰细胞组分或化学物质，包括蛋白质、DNA及与细胞代谢有关的物质；在细胞内或细胞附近发生的破裂、加热、空蚀或爆裂；细胞通透或穿孔；及细胞(包括细胞、病毒、物体或粒子)的破坏、碎裂或形态变化。在其它具体实例中，修饰也包括或者包括能源的间接作用，其由能源或由其它因素介导，包括细胞或一或多种细胞组分的化学活化及/或失活、化学交联或化学衍生；在细胞内或细胞附近一或多种化学药剂的活化及/或失活，此可引起该等药剂或其衍生物结合或缔合于细胞或其组分；或诱导细胞功能改变。在某些具体实例中，照射时与细胞反应的化学药剂通常存在于细胞中或应用中，或添加其作为方法的一部分。
[0160]在一些具体实例中，所述方法及仪器结合使用光可活化化合物，在用适当强度及能量的光照射时，其经诱导而与细胞或细胞组分结合或缔合。在某些态样中，该等化合物诱导一或多种细胞组分发生足以影响所关注细胞的细胞过程或代谢的交联或变性。或者，在某些态样中，该等化合物诱导一或多种细胞组分发生足以杀死所关注细胞的交联或变性。在另一替代方案中，所述方法及仪器中所使用的光可活化化合物结合于所选细胞且以使得所关注细胞在后续过程中易鉴别及/或富集及/或耗竭的方式改变所关注细胞的一或多种性质。在某些态样中，在随后步骤中，通过利用该物质的性质或相互作用的方法移除、浓缩或纯化已通过化学衍生(诸如通过添加化学物质)改变的所关注细胞。举例而言，且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，所关注的细胞通过添加随后由抗体结合的物质来衍生，该抗体允许通过各种方法捕捉或滞留所关注的衍生细胞。涵盖许多该等物质，且在一个态样中，该等物质包括一类含有2，4-二硝基苯基(DNP)或与其有关的化合物，在一个态样中该化合物由识别DNP的抗体识别并特异性结合。因此，在一个态样中，使用DNP或相关化合物的光可活化衍生物来衍生此类型的应用中所关注的细胞。或者，所关注的衍生细胞可使用引起所关注的衍生细胞优先结合于某些受质的策略捕捉或移除。举例而言且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，使用含有生物素或与生物素有关的化合物衍生的所关注细胞捕捉或滞留于结合生物素或已修饰以结合生物素的受质、表面、物质、介质、化合物或粒子上，例如通过存在抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素结合抗体或其它生物素结合分子。在与此态样有关的另一替代方案中，使用生物素或相关化合物的光可活化衍生物来衍生该应用中所关注的细胞。或者，在其它态样中，所关注细胞通过添加或缔合化学物质或化合物，随后经受选择及修饰来改变。因此，在该情况下，本文所述的方法及仪器的一具体实例利用改变所选细胞上的所添加物质以允许区分该等细胞与群体中的其它细胞。举例而言，且仅出于解释及阐明的目的，在一个态样中，群体中的所有细胞均通过在分析之前添加光不稳定化合物来衍生，且在一个态样中，使用仪器的能源修饰是以特定细胞为目标以修饰彼等细胞上的光不稳定化合物。
[0161]照射后，分析物(若存在)自询问区域148流动至分选区域152。由于芯鞘流或层流可预测且稳定，因此对于各分析物而言，可获知分析物离开询问区域148且流向分选区域152后一定距离处的位置。在一些具体实例中，分选能源350(图22中描绘)可经控制以照射分选区域处的样品中的分析物或分析物的一部分以使分析物失能、修饰或破坏该分析物。
[0162]在其它具体实例中，样品可包括第一及第二分析物，其可使用本文所述的方法及仪器有差别地侦测。第一及第二分析物的分选可例如通过在侦测后照射第一或第二分析物来达成。举例而言，侦测器150可经组态以侦测及判定可侦测信号153是否来自第一或第二分析物。在侦测特定分析物(例如第二分析物)以用于分选时，分选能源350可经控制以照射第二分析物以使第二分析物失能、修饰或破坏该分析物。
[0163]在一些具体实例中，分选能源350可经对准以与流径138正交照射分选区域152处的样品。在其它具体实例中，分选能源350可经对准以以相对于分选能量呈斜角照射样
品O
[0164]在一些具体实例中，分选能源350为发射电磁能的雷射,例如紫外光、可见光及红外光。
[0165]举例而言，分选能源350可为UV雷射。小于约350nm的UV波长可由核酸、蛋白质及/或用于吸收光的染料吸收且可将能量转移至分析物(例如细胞)的区域，从而修饰、损坏或杀死细胞。
[0166]分选能源350可为例如可见/红外雷射。约775nm及约775nm以上的可见/红外波长可由细胞组分及/或用于吸收光的染料及/或水吸收且可将能量转移至分析物(例如细胞)的区域，从而修饰、损坏或杀死细胞。
[0167]分选能源350可为例如可见雷射。350nm及至约775nm的可见波长可由细胞色素及/或用于吸收光的染料及/或水吸收且可将能量转移至分析物(例如细胞)的区域，从而修饰、损坏或杀死细胞。
[0168]在分析物为细胞且分选将依据细胞死亡达成的具体实例中，分选能量可经选择以将细胞的内部温度加热至约70°C。该加热可例如以约50W的瞬时功率达成。能够杀死细胞的能源包括例如雷射二极管数组、低非空因子脉冲及适当波长或功率的经调节连续或准连续能源。
[0169]任一此等或其它已知分选能源350可用于杀死、修饰或损坏分选区域152处的分析物。分选能源350可以各种方式损坏细胞，包括例如膜或其它细胞器或组分的破裂、细胞中的生物分子的变性及生物分子的交联或位移。膜或其它细胞器或组分的破裂可通过细胞内的水的空蚀及对邻近细胞组分的破坏或通过细胞中的水或生物分子的能量诱导解离来达成。生物分子的变性及生物分子的交联或位移导致生物分子及/或细胞的功能的相关变化或损失。
[0170]在侦测分析物或不合需要的分析物时，分选能源350可预定以分析物为目标或其输出经调节或重导引而以分析物为目标。使用分选能源350进行分选可通过修饰分析物、使分析物失能或破坏分析物来达成。分选能源350可以各种方式损坏、修饰样品中的分析物或使该分析物失能，包括例如促使分析物区域中(分选区域处)的样品流体空蚀，促使分析物区域中(分选区域处)的样品流体受热，促使分析物中的分子分解及/或交联，及直接或通过诱导样品流体中的化学试剂结合于分析物而对分析物进行化学修饰。
[0171]在一些具体实例中，分选能源350可为热源，诸如加热组件、微波或放电。样品在分选区域152中通过加热分选区域152处的分析物周围的流体以损坏、修饰或破坏分析物来分选。
[0172]在一些具体实例中，分选可使用电穿孔或经由向分选区域处的样品施加力来达成。该力可为例如超音波。
[0173]侦测及分选后的样品收集
[0174]样品已穿过询问区域148进行照射及侦测及穿过分选区域152视情况分选之后，样品流动至流槽132的出口 136且可在流槽出口处收集于敞开或封闭容器中。图21A说明收集于敞开容器218中的实例。
[0175]在一些具体实例中，流槽132的出口 136端可具有扩大直径以允许在减压及/或低速下收集样品141。图21B说明经由流槽132的区域220收集的实例，其具有扩大直径，从而产生减压及/或低速区域。样品141可收集于出口 136处的敞开或封闭容器(敞开容器218例示于图21B中)中。其它方法也可用于减缓输出流的速度以最小化对分析物的破坏。
[0176]在其它具体实例中，位于分选区域152下游的出口 136处的实体分选可通过流径138在出口端分裂为两个或两个以上流径来达成。举例而言，图21C说明流径138在位于分选区域152下游的流槽132的出口 136端处分裂为三个流径138a、138b、138c的一具体实例。流体流的芯中的分析物142可导引至中央流径138b，而鞘流体可转向至外流径138a及138c。各别容器140a、140b、140c可用于自流径138a、138b、138c进行收集。该等容器可敞开或封闭。流槽132可视情况包括确保粒子相对于分裂流径的位置的组件(图中未示)。视情况存在的组件可包括例如用于侦测进入中央流径138b的分析物粒子的光学仪器。在一些具体实例中，可使用实体分离的出口或区域处的可变流速将分析物及/或所关注分析物及/或经修饰分析物转向至该等流径之一，例如如美国专利第7，355，696号中所述，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
[0177]流槽132在本文中将理解为封闭流径，只要流径138在穿过询问区域148及穿过分选区域152的区域中为单一、整体且有界的流径即可。流径138在分选区域152下游分裂不会影响封闭时流槽132的特性化。
[0178]控制系统
[0179]参看图22,流动式细胞量测术系统也可包括计算机控制系统400。该计算机控制系统可包括一或多个计算机装置402，诸如工作站、膝上型计算机、平板计算机、迷你笔记型计算机、个人数字助理及其类似物。如一般已知，各计算机装置402可包括或可接取一或多个微处理器装置404、一或多个易失性内存装置(例如RAM)406及一或多个非易失性内存装置(例如硬盘驱动机、光学内存装置等)408。微处理器装置404可在运作时间操作期间将指令及数据储存于易失性内存装置406上，且类似地可将指令及数据储存于非易失性内存装置408上。举例而言，如一般已知，一或多个例程或程序的指令可储存于非易失性内存装置408中以由微处理器装置404撷取。微处理器装置404在执行例程时可自非易失性内存装置408撷取该例程且将例程的复本储存于易失性内存装置406中。在执行例程期间，微处理器装置404可另外将数据分别储存于易失性内存装置406及非易失性内存装置408的一或两者中。另外，微处理器装置404可自如下文所述的位于计算机402外部的一或多个装置接收、处理数据及/或将数据储存于内存装置406、408中。一或多个输入/输出(I /O)装置410可有助于微处理器404与外部装置之间的通信及另外有助于微处理器404与内存装置406、408之间的通信。此外，I / O装置410可与显示装置412通信,显示装置412可位于计算机装置402内部或外部，且可用于显示使用者接口以允许操作者控制细胞量测术系统。一或多个输入装置414(例如鼠标、触控屏幕、键盘等)可允许使用者将数据或命令输入细胞量测术系统。
[0180]I / O装置410可有助于微处理器404与细胞量测术硬件之间的通信，该硬件诸如分选能源、侦测器150、照射源151及射流系统。具体而言，关于射流系统，I / O装置410可有助于微处理器404与流动控制子系统416之间的通信，该流动控制子系统可有效控制鞘流体及样品流体分别自鞘流体及样品流体的供应器的流动及向收集容器的流动。举例而言，流动控制子系统416可控制与鞘流体供应器310流体连通的泵310A，可控制与样品流体供应器312流体连通的泵312A，及/或可控制与收集容器314流体连通的泵314A。此外，流动控制子系统416可包括可有效感测鞘流体、样品流体、进入收集容器140的流体及/或形成于流动式细胞量测术系统中的芯鞘流的体积或流速的传感器或与其通信。最后，I / O装置410可有助于微处理器404与光学子系统的一或多个组件420之间的通信。组件420可包括一或多个可移动光学组件(例如镜面或透镜)及/或一或多个电色装置，其可用于选择性导引、重导引及/或阻断来自分选能源及/或照射能源418的能量。另外，组件420可包括一或多个可有效校准或有助于校准以下的可移动光学组件:(I)光学组件的位置；(2)照射能量、分选能量及/或侦测能量的方向 '及/或(3)照射能量、分选能量及/或侦测能量的强度。
[0181]如应了解，计算机402可储存及执行用于实施一或多个例程的各种计算机可读指令，该等例程可包括控制例程、分析例程、分选例程等，及尤其为控制鞘流体及样品流体的相对流动，接收并分析侦测器150输出的数据，控制照射源，控制分选能源，控制光学组件的组态，分析流体流的一或多种性质等的例程。虽然例程被描述为储存于内存装置上且由微处理器装置执行，但例程也可为硬件模块。硬件模块为能够进行某些操作的有形单元且可以一定方式组态或配置。在实施例具体实例中，一或多个计算机系统(例如独立、客户端或服务器计算机系统)或计算机系统的一或多个硬件模块(例如处理器或一组处理器)可通过软件(例如应用程序或应用程序部分)组态为有效进行如上文所述的某些操作的硬件模块。
[0182]在各种具体实例中，硬件模块可以机械方式或以电子方式实施。举例而言，硬件模块可包含经永久组态以进行某些操作的专用电路或逻辑(例如作为专用处理器，诸如现场可程序化门阵列(field—programmable gate array, FPGA)或特殊应用集成电路(application-specific integrated circuit, ASIC))。硬件模块也可包含通过软件临时组态以进行某些操作的可程序化逻辑或电路(例如涵盖于通用处理器或其它可程序化处理器中)。应了解，在专用的永久组态电路中或在临时组态电路(例如通过软件组态)中以机械方式实施硬件模块的决定可由成本及时间考虑驱动。
[0183]分选精子的例示性方法
[0184]图23说明本文所述的方法的例示性具体实例，详言之，自细胞样品选择所需细胞子群体(例如自含有带有X与Y染色体的细胞混合物的样品选择带有X或Y染色体的细胞)的方法430。在一些具体实例中，方法430或其一部分以构成一或多个相关仪器的控制例程的一组机器可读指令储存于内存406、408之一中。处理器404可自内存406、408读取指令且执行该等指令以执行方法430。在另一具体实例中，方法430包括若干个例程。该等例程可个别地控制一或多个仪器，可分析由该一或多个仪器收集的数据，及/或可基于所分析的数据进行一或多个判定等。如一般已知，技术人员或仪器可标记用于分析的试样(例如精细胞的集合)(步骤432)。标记细胞可在分选流动式细胞量测仪中，或在分选流动式细胞量测仪外的各别过程或程序中完成。此外，施用于细胞的特定标记可视细胞量测应用而定。在一些具体实例中，标记过程的参数可由处理器404测定及/或标记过程或其一部分可由处理器404控制。举例而言，细胞可经标记以使得细胞及/或标记组分响应于照射而产生可侦测信号。
[0185]在任何情况下，在标记细胞后，根据本说明书的仪器，详言之，分选流动式细胞量测仪，可在流径138中产生鞘流体流(步骤434)。经由各别输入，分选流动式细胞量测仪可将试样(也即适合液体中的经标记细胞)注入流径138中(步骤436)，较佳在鞘流体流的中心或中心附近。也较佳地，该试样相对于鞘流体流缓慢地进入鞘流体流，以使得试样中的细胞(例如精细胞)与平行于鞘流体流的长轴对准，并使得细胞以一般单行模式流动。流动控制子系统416可根据由处理器404执行的例程控制鞘流体及样品流体自鞘流体及样品流体的供应器的流动，以最佳化鞘流体及样品流体的相对流动。流动控制子系统416可包括各种传感器及/或侦测器，其向处理器404上所执行的例程提供输入，以有助于相对流动的最佳化。
[0186]当细胞移动穿过流径138时，照射能源151 (诸如UV雷射)照射询问区域148中的试样(步骤438)。照射能源可连续地照射询问区域148，或处理器404上所执行的例程可控制照射能源151选择性地照射询问区域148 (例如仅当试样存在于询问区域148中时)。细胞及/或细胞的组分或标记或与细胞相关的组分或标记响应于照射而产生可侦测信号。
[0187]凹形收集器组件146有效聚焦自各细胞发射、传输或反射的能量(例如标记响应于照射而发射的荧光)(步骤440)。也即，在流径138中组合的鞘流及试样一般沿凹形收集器组件146的光轴移动，该光轴一般与流同轴且试样中的各细胞按计划穿过凹形收集器组件146的焦点(与询问区域148重合)。侦测器150接收自凹形收集器组件146聚焦的能量(步骤442)，且向处理器404发送表示所侦测能量的信号。在一些具体实例中，侦测器150可以每秒超过40，000个细胞个别地侦测聚焦能量，可以每秒超过75，000个细胞个别地侦测聚焦能量，可以每秒超过100，000个细胞个别地侦测聚焦能量，可以每秒超过200，000个细胞个别地侦测聚焦能量，或可以每秒超过300，000个细胞个别地侦测聚焦能量。
[0188]处理器404接收表示所侦测能量的信号且分析数据(步骤444)以判定(步骤446)资料是否表示细胞属于所需子群体或细胞不属于所需子群体。在一些具体实例中，处理器404也可判定数据是否表示不确定的细胞，既不判定其属于所需子群体，也不判定其不属于所需子群体。在后者情况下，处理器404可处理细胞，恰如侦测器150判定细胞不属于所需子群体一般。若处理器404判定细胞不属于所需子群体或为不确定的，则处理器404可向分选能源350 (诸如红外雷射)发送信号，一旦细胞已自询问区域148传至分选区域152，即在适合的时间照射细胞(例如改变细胞、破坏细胞、使得细胞不存活等)(步骤448);分选能源聚焦于分选区域152上。或者，若处理器404判定细胞属于所需子群体，则处理器404可向分选能源350发送信号(或避免发送信号)，以使得当细胞穿过分选区域152时，分选能源350不照射细胞(步骤450)。分选能源可经组态以使得在预期所需或非所需细胞存在于分选区域152中的期间，其将能量传递至试样或不将能量传递至试样。换言之，分选能源350可根据预设将能量传递或不将能量传递至试样，且可由处理器404传递信号以在如处理器404测定的适当时间改变其传递或不传递能量的状态。当然，应了解，替代控制发送至分选能源350的信号或除此以外，调节及/或减弱由分选能源350提供的分选能量可通过控制光学组件420来实现，该光学组件可包括衰减器、可移动光学组件及其类似物。
[0189]仪器可在过程末端收集细胞进行使用及/或进一步加工(例如分离细胞)。在可包括图15中所描绘的具体实例的一些具体实例中，处理器404向分选能源350及/或向光学组件420发送信号以留下判定为属于所需子群体的未改变(也即不照射)细胞，且经加工细胞的所得集合包含大于或等于60%的所需细胞子群体中的细胞与未改变总细胞的比率。此外，在可包括图15中所描绘的具体实例的一些具体实例中，处理器404向分选能源350及/或向光学组件420发送信号以留下判定为属于所需子群体的未改变(也即不照射)细胞，且经加工细胞的所得集合包含大于或等于50%的所需子群体中的经改变细胞与所需子群体的总细胞的比率。
[0190]当然，上述方法不经反映本发明所述方法的一或多个具体实例，而且可涵盖如本说明书关于各种具体实例所述的一或多个其它步骤或例程。此外，一些具体实例可省去参考方法430所述的一或多个步骤或例程。举例而言(但不限于)，在一些具体实例中，细胞或细胞组分可固有地发射可侦测信号，例如因磷光或化学发光，从而消除用标记标记试样来产生可侦测反应的需要。此外，在一些具体实例(如上文所述)中，方法可颠倒步骤448及450，允许判定为不属于所需子群体的细胞穿过而不用可控制能源照射，而使得可控制能源照射判定为属于所需子群体的细胞。
[0191]第一例示性系统具体实例
[0192]图24描绘执行流动式细胞量测术的系统470的第一例示性具体实例。如上文所述，计算机402控制系统470。计算机402接收来自流动控制的系统416的感测信号及其它信息，且将控制信号发送回至流动控制子系统416。流动控制子系统416根据自计算机402接收的信号操作，以控制泵310A自鞘流体供应器310抽汲鞘流体并控制泵312A自样品流体供应器312抽汲样品流体。从而沿流径138产生流。流径138包括有效产生芯鞘流的流体动力学聚焦组件157。由计算机402的处理器404执行的例程促使计算机402向流动控制子系统416提供信号，以使得流动控制子系统416维持及/或调整鞘流体及样品流体的流动以维持稳定流动并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的间距。
[0193]计算机402也与照射能源151通信耦接，提供一或多个控制信号用于选择性接通照射能源151及/或确定照射能源151的功率设定。照射能量149自照射能源151投射穿过第一抛物形光学组件210中的开口。照射能量149入射于圆锥形光学组件208上，其将照射能量149重导向第一抛物形光学组件210的表面。第一抛物形光学组件210将照射能量149以环形反射至第二抛物形光学组件212。当环形照射能量149入射于第二抛物形光学组件212上时，照射能量149向第二抛物形光学组件212的焦点反射(具有一般圆锥形形状)，该焦点与流径138中的询问区域148重合。整体形成于询问区域148处的流槽中的球形模制物154确保照射能量149在其入射于分析物上时保持聚焦。
[0194]当照射能量149入射于分析物上时，其促使分析物发射呈荧光形式的可侦测信号153。整体形成于询问区域148处的流槽中的球形模制物154最小化可侦测信号153在其离开流槽时的折射。可侦测信号153入射于椭球形收集器组件146上，其具有与流径138中的询问区域148重合的第一焦点。椭球形收集器组件146向椭球形收集器组件146的第二焦点反射可侦测信号153，该第二焦点对应于针孔216的位置。可侦测信号153穿过该针孔且入射于侦测器150上。
[0195]与计算机402通信耦接的侦测器150向计算机402发送对应于可侦测信号153的信号。计算机402执行有效接收来自侦测器150的信号并利用该侦测器判定发射可侦测信号153的分析物是否属于所需子群体或不属于所需子群体的例程。
[0196]计算机402另外与分选能源350通信耦接。计算机402向分选能源350发送信号以在发射可侦测信号153的分析物处于分选区域152中时选择性接通分选能源350，该分选区域安置于由分选能源350发射的电磁辐射476的路径中。当分析物不属于所需子群体时，计算机402促使分选能源350发射电磁辐射476，且当分析物属于所需子群体时，促使分选能源350不发射电磁辐射476。在计算机402上执行的例程可根据已知流动参数判定分析物何时将在分选区域152中，该等参数在任何情况下也经由流动控制子系统416受计算机402控制。射束挡板478防止电磁辐射476入射于系统470的其它部分上。
[0197]收集容器314在流径138的末端收集含有经分选样品的流体。
[0198]如图24描绘，流槽132保持封闭(也即芯鞘流不曝露于氛围中)且至少自其穿过询问区域148之前至其穿过分选区域152之后不间断(也即芯鞘流不分叉)。另外，流径138在穿过询问区域148时，其流轴与椭球形收集器组件146的光轴同轴，与第二抛物形光学组件212的光轴同轴，且与第一抛物形光学组件210的光轴同轴。
[0199]第二例示性系统具体实例
[0200]图25描绘执行流动式细胞量测术的系统480的第二例示性具体实例。如上文所述，计算机402控制系统480。计算机402接收来自流动控制子系统416的感测信号及其它信息，且将控制信号发送回至流动控制子系统416。流动控制子系统416根据自计算机402接收的信号操作，以控制泵310A自鞘流体供应器310抽汲鞘流体并控制泵312A自样品流体供应器312抽汲样品流体。从而沿流径138产生流。流径138包括有效产生芯鞘流的流体动力学聚焦组件157。由计算机402的处理器404执行的例程促使计算机402向流动控制子系统416提供信号，以使得流动控制子系统416维持及/或调整鞘流体及样品流体的流动以维持稳定流动并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的间距。
[0201]计算机402也与照射能源151A及151B通信耦接，向各照射能源提供一或多个控制信号用于选择性接通照射能源151AU51B及/或确定照射能源151A、151B的功率设定。照射能量149自照射能源151AU51B的每一者投射穿过椭球形收集器组件146中的各别开口 482A、482B。照射能量149导向流径138中的询问区域148。整体形成于询问区域148处的流槽中的球形模制物154确保照射能量149在其入射于分析物上时不折射。
[0202]当照射能量149入射于询问区域148中的分析物上时，其促使分析物发射呈荧光形式的可侦测信号153。整体形成于询问区域148处的流槽中的球形模制物154最小化可侦测信号153离开流槽时的折射。可侦测信号153入射于椭球形收集器组件146上，其具有与流径138中的询问区域148重合的第一焦点。椭球形收集器组件146向椭球形收集器组件146的第二焦点反射可侦测信号153，该第二焦点对应于针孔216的位置。可侦测信号153穿过针孔216，接着入射于侦测器150上。[0203]与计算机402通信耦接的侦测器150向计算机402发送对应于可侦测信号153的信号。计算机402执行有效接收来自侦测器150的信号并利用该侦测器判定发射可侦测信号153的分析物是否属于所需子群体或不属于所需子群体的例程。
[0204]计算机402另外与分选能源350通信耦接。计算机402向分选能源350发送信号以在发射可侦测信号153的分析物处于分选区域152中时选择性接通分选能源350，该分选区域安置于由分选能源350发射的电磁辐射476的路径中。当分析物不属于所需子群体时，计算机402促使分选能源350发射电磁辐射476，且当分析物属于所需子群体时，促使分选能源350不发射电磁辐射476。在计算机402上执行的例程可根据已知流动参数判定分析物何时将在分选区域152中，该等参数在任何情况下也经由流动控制子系统416受计算机402控制。射束挡板478防止电磁辐射476入射于系统470的其它部分上。
[0205]收集容器314在流径138的末端收集含有经分选样品的流体。
[0206]如图25描绘，流槽132保持封闭(也即芯鞘流不曝露于氛围中)且至少自其穿过询问区域148之前至其穿过分选区域152之后不间断(也即芯鞘流不分叉)。另外，流径138的流轴在其穿过询问区域148时与椭球形收集器组件146的光轴同轴。
[0207]第三例示性具体实例
[0208]图26描绘执行流动式细胞量测术的系统580的第三例示性具体实例。如上文所述，计算机502控制系统580。计算机502接收来自流动控制子系统516的感测信号及其它信息，且将控制信号发送回至流动控制子系统516。流动控制子系统516根据自计算机502接收的信号操作，以控制泵310A自鞘流体供应器310抽汲鞘流体并控制泵312A自样品流体供应器312抽汲样品流体。如图26中所示，流动式细胞量测仪的物镜517可经改良以允许样品流体141穿过透镜517并以芯流体形式抽入鞘流体中。详言之，样品141经导引而经由安置于鞘流体流径中的孔或腔室进入鞘流200的中心。两个流皆进入加速区域204且形成稳定芯鞘流。由计算机502的处理器504执行的例程促使计算机502向流动控制子系统516提供信号，以使得流动控制子系统516维持及/或调整鞘流体及样品流体的流动以维持稳定流动并最佳化芯鞘流中的分析物粒子的间距。
[0209]计算机502也与照射能源151通信耦接，提供一或多个控制信号用于选择性接通照射能源151及/或确定照射能源151的功率设定。照射能量149导向流径138中的询问区域148。
[0210]当照射能量149入射于询问区域148中的分析物上时，其促使分析物发射呈荧光形式的可侦测信号153。可侦测信号153入射于物镜517上，其具有与流径138中的询问区域148重合的第一焦点。物镜517向第二透镜519反射可侦测信号153，该第二透镜将可侦测信号153聚焦于位于第二透镜519的焦点处的侦测器上。
[0211]与计算机502通信耦接的侦测器150向计算机502发送对应于可侦测信号153的信号。计算机502执行有效接收来自侦测器150的信号并利用该侦测器判定发射可侦测信号153的分析物是否属于所需子群体或不属于所需子群体的例程。
[0212]计算机502另外与分选能源350通信耦接。计算机402向分选能源350发送信号以在发射可侦测信号153的分析物处于分选区域152中时选择性接通分选能源350，该分选区域安置于由分选能源350发射的电磁辐射576的路径中。当分析物不属于所需子群体时，计算机502促使分选能源350发射电磁辐射576，且当分析物属于所需子群体时，促使分选能源350不发射电磁辐射576。在计算机502上执行的例程可根据已知流动参数判定分析物何时将处于分选区域152中，该等参数在任何情况下也经由流动控制子系统516受计算机502控制。射束挡板478防止电磁辐射576入射于系统570的其它部分上。
[0213]收集容器314在流径138的末端收集含有经分选样品的流体。
[0214]如图26描绘，流槽132保持封闭(也即芯鞘流不曝露于氛围中)且至少自其穿过询问区域148之前至其穿过分选区域152之后不间断(也即芯鞘流不分叉)。另外，流径138的流轴在其穿过询问区域148时与物镜517的光轴同轴。
[0215]以下图表鉴别本发明的方法及仪器的各种例示性组合。此等组合具例示性且不欲以任何方式限制本发明。在该图表中所鉴别的各例示性具体实例中，样品流过流槽中的询问区域且该流槽在询问区域与位于询问区域下游的分选区域之间为封闭的，如上文第77段中所定义。如上文所定义，询问区域与凹形收集器组件或物镜收集器组件的焦点重合。也如上文所指示，收集器组件的光轴与询问区域附近的样品的流轴同轴对准。在任一例示性具体实例中，应了解，询问区域可为具有规定范围的区域或可为与凹形收集器组件的焦点重合的单点，如上文详细描述。
[0216]在图表中，A表示用于流体动力学聚焦的方法及仪器。应了解流体动力学聚焦组件(若使用)或流体动力学聚焦方法可位于流槽的任何区域中，只要流体动力学聚焦可使得样品流在到达询问区域之前达成稳定层流及/或芯鞘型流且维持穿过分选区域即可。Al表示使用图5A及5B中所说明及第87-97段中所述的流体动力学聚焦组件达成的流体动力学聚焦。A2表示使用图6中所说明及第98段中所述的流体动力学聚焦组件达成的流体动力学聚焦。A3表示使用图7A中所说明及第99段中所述的流体动力学聚焦方法达成的流体动力学聚焦。A4表示如第100段中所述通过使样品流体穿过毛细管所达成的流体动力学聚焦。A5表示如图8中所说明及第101段中所述使用声学聚焦使分析物在流槽中居中。除本文所述的任一流体动力学聚焦方法外，视情况也可使用声学聚焦。
[0217]在图表中，B表不用于照射样品的方法及配置。应了解在任一例不性具体实例中，平面镜可并入光学配置中以将电磁能导引至预定位置，以便必要时可利用光学组件的更方便及/或更紧凑配置(与光学组件的同轴对准相比)，如第106段中所述。B1-B4表示自一或多个照射源的直接照射。应了解，尽管使用平面镜重导引来自照射源的电磁能可使照射源在本发明仪器中达成更方便及/或紧凑配置，但自照射源的直接照射被视为直接的。BI表示如第109段中所述自单一照射源的直接照射。Bla表示如图9所示以与询问区域附近的流轴正交的角度自单一照射源的直接照射。Blb表示以除与流轴正交外的角度自单一照射源的直接照射。
[0218]B2表示如第110-113段中所述自多个照射源的直接照射。B2a表示如图10中所示自全部安置于与询问区域附近的流轴正交的平面内的多个照射源的直接照射。B2b表示如第107及111段中所述自关于流轴旋转对称(也即轴对称)的多个照射源的直接照射。B2c表示如第107段中所述自旋转对称(关于任何轴)的多个照射源的直接照射。B2d表示自安置于不同平面内及/或不旋转对称的多个照射源的直接照射。
[0219]B3表示如第114段中所述及图11中所说明使用流槽作为波导自照射源的直接照射。
[0220]B4表示如第115段中所述及图12中所说明自相对于询问区域附近的流轴略微离轴的照射源的直接照射。
[0221]B5表示如第116段中所述及图13中所示使用收集器组件将来自照射源的电磁能聚焦于询问区域上的照射。如第127段中详细描述，收集器组件可具有任何适合的形状。
[0222]B6表示如第117-119段中所述使用单一凹形光学组件将来自照射源的电磁能聚焦于询问区域上的照射。B6a表示如下照射配置:照射源直接照射凹形光学组件，该凹形光学组件接收来自照射源的电磁能且将电磁能聚焦于询问区域上。B6b表示如第117段中所述及图14中所说明的照射配置，其中照射源直接照射圆锥形光学组件，该圆锥形光学组件将电磁能导引至凹形光学组件，该凹形光学组件将照射聚焦于询问区域上。选择图表中的B6(a或b)及B5表示如第116段中所述的照射，其中凹形光学组件将电磁能导引至凹形收集器组件，接着该凹形收集器组件将电磁能聚焦于询问区域上。如第118段中所述，凹形光学组件可具有任何适合的形状。
[0223]B7表示如所述使用两个凹形光学组件照射询问区域的照射。B7a表示如第120段中所述使用两个凹形光学组件的照射，其中来自照射源的电磁能直接入射于第一凹形光学组件上，该第一凹形光学组件将电磁能以环形导引至第二凹形光学组件，该第二凹形光学组件又将电磁能聚焦于询问区域上。B7b表示如第120-123段中所述及图15中所说明使用两个凹形光学组件的照射，其中圆锥形光学组件将来自照射源的电磁能导引至第一凹形光学组件，该第一凹形光学组件又将电磁能以环形导引于第二凹形光学组件上，接着该第二凹形光学组件将电磁能聚焦于询问区域上。选择图表中的B7 (a或b)及B5表示如第116段中所述的照射，其中凹形光学组件将电磁电磁能导引至凹形收集器组件，接着该凹形收集器组件将电磁电磁能聚焦于询问区域上。如第118段中所述，凹形光学组件可具有任何适合的形状。第一及第二光学组件以及凹形光学组件(若使用)可以任何适合的方式对准。举例而言，该等光学组件可彼此同轴对准。若光学组件不同轴对准，则也可使用平面镜将电磁能导引至光学组件、收集器组件或询问区域中的一或多者。
[0224]B8表示经由物镜的照射，例如如第124段中所述及图16及17中所说明。
[0225]C表示照射分析物时收集来自分析物的可侦测信号。Cl表示如第127—138段中所述及图18及19中所说明的凹形收集器组件。如第127段中所述，凹形收集器组件可具有任何适合的形状。C2表示如第144段中所述及图26中所说明用作收集器的物镜。在各具体实例中，收集器收集来自分析物的可侦测信号(照射分析物时)且将该信号传输至侦测器以进行侦测。本文所揭示的任一具体实例可进一步包括平面镜、针孔或其它聚焦组件以在所收集的可侦测信号到达侦测器之前进一步聚焦。
[0226]D表示在分选区域处分选分析物的方法。如第146至160段中详细描述，分选能量可修饰、损坏或以其它方式破坏分析物或分析物的子群体以实现分选。Dl表示如第146-157段中所述直接分选分析物，其中分选能量直接照射分析物，从而可修饰、损坏或破坏分析物。D2表示如第158-160段中所述间接分选分析物。D2a表示通过将分选能量导引至样品流体处、从而引起分选区域处的分析物区域中的样品流体空蚀的分选。D2b表示在分选区域处使用分选能源加热分析物区域中的样品流体的分选。D2c表示通过诱导分析物发生化学修饰(例如促使样品流体中的化学试剂结合于分析物)的分选。D2a-D2c描述于第158-160段中。虽然图表中所示的例示性具体实例各包括分选，但应了解使用分选能量的分选为所揭示方法中视情况选用的步骤。[0227]E表示如第138-143段中所述减少分析物所发射、传输或反射的可侦测信号因流槽壁与收集器组件之间空气-样品流体界面而出现的像差的方法。El表示如第138段中所述通过用折射率与询问区域处的流槽壁的折射率实质上相同的流体、凝胶或固体填充收集器组件来减少像差。E2表示如第139-142段中所述及图20A及20B中所说明通过在围绕询问区域的流槽上整体形成球形模制物来减少像差。E3表示如第143段所述通过使流槽壁在询问区域处极薄来减少像差。E1-E3的任一者或组合可视情况用于本文所揭示的任一具体实例。
[0228]F表示询问区域附近的样品流动方向。Fl表示如第70段中所述及图4A中所说明样品自询问区域向收集器组件的顶点流动。F2表示如第70段中所述及图4B中所说明样品自收集器组件的顶点向询问区域流动。F3表示如图7A中所说明样品自物镜型收集器组件流走。
[0229]G表示在侦测及视情况分选后的样品收集。Gl表示在收集样品时，芯流体自鞘流体穿过像穿过漏斗一样，例如如第163段中所述及图21C中所说明。G2表示收集整个芯鞘流。在Gl或G2中，样品出口可包括增大的面积以在收集时降低样品速度，例如如第162段中所述及图21B中所说明。另外，在Gl或G2中可使用声学聚焦保持分析物在样品流中居中以用于收集。在Gl或G2中样品收集也可在敞开或封闭各器中完成。
[0230]在以下图表中所指定的任一具体实例中，流动式细胞量测术系统也可包括如170-173中一般所述的计算机控制系统。具体而言，计算机控制系统可与分选能源、侦测器、照射源及射流系统中的一者、任何组合或全部通信。就射流系统具体而言，如上文所述，计算机控制系统可控制流动控制子系统有效控制鞘流体及样品流体分别自鞘流体及/或样品流体的供应器的流动及向收集容器的流动。最后，计算机控制系统可控制光学子系统的各种组件，可包括一或多个可移动光学组件(例如镜面或透镜)及/或一或多个电色装置，其可用于选择性导引、重导引及/或阻断来自分选能源及/或照射能源的能量，且可包括一或多个可有效校准或有助于校准以下的可移动光学组件:(I)光学组件的位置；(2)照射能量、分选能量及/或侦测能量的方向；及/或(3)照射能量、分选能量及/或侦测能量的强度。
[0231]此图表包含鉴别以上所揭示的特征选集的例示性具体实例。该等选集格式为逗号分隔型值(comma-separated value)。
[0232]
【权利要求】
1.一种用于侦测射流样品中的分析物的仪器，其包含: 照射源，用于产生电磁能以照射询问区域中的该样品； 凹形收集器组件，其包含顶点、光轴及焦点，该询问区域与该凹形收集器组件的该焦点重合； 封闭流槽，其包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉，且 该样品包含或怀疑包含该分析物并流入该流径，其中: 该样品以芯鞘流或层流形式至少流过该询问区域， 该样品具有自该询问区域向该收集器组件的该顶点移动的流动方向，或自该收集器的该顶点向该询问区域移动的流动方向且该流径的一部分穿过该收集器组件的内部体积，且该分析物响应于照射而产生可侦测信号；及侦测器，用于侦测该可侦测信号。
2.如权利要求1的仪器，其中该侦测器与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准。
3.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该询问区域为询问点。
4.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该照射源以与该询问区域处的该流轴实质上正交的角度照射该样品。
5.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中该照射源在至少两个方向上以与该询问区域处的该流轴实质上正交的角度照射该样品。
6.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中该照射源与该流轴同轴聚焦以照射该流径中穿过该询问区域的该部分。
7.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中该照射源自一或多个方向、以大于O度且小于或等于360度的弧形角度在与该询问区域处的该流轴实质上正交的平面上照射该样品。
8.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中该照射源自一或多个方向、以大于O度且小于或等于360度的弧形角度在与该询问区域处的该流轴倾斜一定角度的平面上照射该样品O
9.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中该照射源自一或多个方向、在包围该询问区域的虚拟球体表面上以点状、弧状、角状、立体角状或任意区域形状照射该样品。
10.如权利要求1至3中任一项的仪器，其中除照射光径受阻引起的中断外，该照射源以关于该询问区域处的该流轴呈实质上旋转对称来照射该样品。
11.如权利要求1至3中任一项的仪器，其进一步包含: 圆锥形光学组件，其中该圆锥形光学组件接收来自该照射源的该电磁能；及凹形光学组件，其包含与该询问区域重合的焦点，其中该凹形光学组件反射来自该圆锥形组件的电磁能且将该电磁能聚焦于该询问区域上以照射该样品。
12.如权利要求1至3中任一项的仪器，其进一步包含:圆锥形光学组件，其中该圆锥形光学组件接收来自该照射源的该电磁能；及环形光学组件，其相对于该圆锥形光学组件配置以收集来自该圆锥形组件的电磁能且将该电磁能聚焦于该询问区域上以照射该样品。
13.如权利要求11或12的仪器，其进一步包含一或多个平面光学组件用于将该电磁能偏转至该照射源与该询问区域之间的任何处。
14.如权利要求11或12的仪器，其中该照射源与该圆锥形组件同轴对准。
15.如权利要求1至3中任一项的仪器，其进一步包含第一及第二凹形光学组件，其经配置以使得该第一凹形光学组件接收来自该照射源的该电磁能且将电磁能的环形射束反射至该第二凹形光学组件，且该第二凹形光学组件将该电磁能的环形射束聚焦于该询问区域上以照射该样品。
16.如权利要求15的仪器，其中该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件各包含光轴且该等光轴为同轴对准。
17.如权利要求16的仪器，其中该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件的该等光轴与该收集器组件的该光轴同轴对准，且该第二凹形光学组件使该电磁能的环形射束关于该询问区域呈轴对称聚焦于该询问区域上。
18.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该流径的一部分穿过该收集器组件的壁。
19.一种用于侦测射流样品中的分析物的仪器，其包含: 照射源，用于照射询问区域处的样品； 第一及第二凹形光学组件，其各包含光轴及焦点； 安置于该第一凹形光学组件的内部体积中的圆锥形光学组件，其中该照射源聚焦于该圆锥形光学组件上； 凹形收集器组件，其包含顶点、光轴及焦点，其中该询问区域与该凹形收集器组件的焦点重合； 封闭流槽，其包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的该部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉；且 该样品包含或怀疑包含该分析物并流入该流径，其中: 该样品以芯鞘流或层流形式至少流过该询问区域， 该第二凹形光学组件使关于该收集器组件的该光轴同轴对准的该电磁能聚焦于该询问区域处的该样品上，且 该分析物响应于照射而产生可侦测信号；及 侦测器，用于侦测该可侦测信号，该可侦测信号由该凹形收集器组件收集且反射至该侦测器。
20.如权利要求19的仪器，其中该第一凹形光学组件呈椭球形、抛物形或球形。
21.如权利要求19或20的仪器，其中该第二凹形光学组件呈椭球形、抛物形或球形。
22.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该收集器组件呈椭球形、抛物形或球形。
23.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该流槽进一步包含包围该询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比该流槽壁的折射率大或小0.1范围内。
24.一种用于侦测射流样品中的分析物的仪器，其包含: 照射源，用于照射询问区域处的样品； 第一及第二抛物形光学组件，其各包含光轴及焦点； 圆锥形光学组件，其安置于该第一抛物形光学组件的内部体积中，其中该照射源聚焦于该圆锥形光学组件上； 椭球形收集器组件，其包含顶点、光轴及焦点，其中该第一抛物形光学组件及该第二抛物形光学组件、该圆锥形光学组件及该椭球形收集器组件同轴对准，且该询问区域与该椭球形收集器组件的该焦点重合； 封闭流槽，其包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的该部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分 裂或分叉， 包围该询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比该询问区域处的该流槽壁的折射率大或小0.1范围内； 该样品包含或怀疑包含该分析物并流入该流径，其中: 该样品以芯鞘流或层流形式至少流过该询问区域， 该第二抛物形光学组件将该电磁能轴对称地聚焦于该询问区域处的该样品上，且 该分析物响应于照射而产生可侦测信号；及 侦测器，用于侦测该可侦测信号，该可侦测信号由该椭球形收集器组件收集且反射至该侦测器。
25.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该收集组件填充有介质，该介质的折射率在比该询问区域处的该流槽壁的折射率大或小0.1范围内。
26.如权利要求中前述任一项的仪器，其进一步包含将由该收集器组件反射的该可侦测信号聚焦至该侦测器的平面镜。
27.如权利要求中前述任一项的仪器，其进一步包含与该侦测器对准的针孔装置以将由该收集器组件反射的该可侦测信号聚焦至该侦测器。
28.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该样品具有自该收集器组件的该顶点向该询问区域移动的流动方向。
29.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该样品具有自该询问区域向该收集器组件的该顶点移动的流动方向。
30.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该流槽为毛细管。
31.如权利要求中前述任一项的仪器，其进一步包含安置于该询问区域上游的该流槽中的流体动力学聚焦组件。
32.如权利要求中前述任一项的仪器，其中该分析物包含第一及第二分析物，该仪器进一步包含在与该侦测器通信耦接的处理器上操作的逻辑例程，该逻辑例程可有效(I)利用该可侦测信号判定产生该可侦测信号的该分析物是否为第一分析物或第二分析物，且(2)根据该判定输出信号。
33.如权利要求32的仪器，其进一步包含可控制分选能源，该分选能源与该逻辑例程通信耦接且可有效地根据来自该逻辑例程的该输出信号在该分选区域处选择性分选该第一分析物或该第二分析物。
34.如权利要求1至31中任一项的仪器，其中当侦测到该可侦测信号时，该侦测器可有效输出信号，该仪器进一步包含可控制分选能源，该分选能源与该侦测器通信耦接且可有效地根据来自该侦测器的该输出信号给予该分选区域处的该分析物能量。
35.一种使用仪器侦测射流样品中的分析物的方法，该仪器包含照射源，具有顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，及与该凹形收集器组件的该焦点重合的询问区域，该方法包含: 控制封闭流槽中的样品流以具有(I)自该收集器组件的该顶点流向该询问区域或(2)自该询问区域流向该收集器组件的该顶点的流动方向，该流槽包含: 样品入口， 样品出口，及 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的该部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉， 其中当该流动方向为自该询问区域流向该收集器组件的该顶点时，该流径的一部分穿过该收集器组件； 照射该询问区域处的该样品，其中该分析物回应于照射而产生可侦测信号； 用该凹形收集器组件收集该可侦测信号，其中该收集器组件将该可侦测信号反射至该侦测器；及 用该侦测器侦测该可侦测信号。
36.如权利要求35的方法，其中该封闭流槽进一步包含包围该询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比该流槽壁的折射率大或小0.1范围内。
37.如权利要求35或36的方法，其中该侦测器与该收集器组件的该光轴同轴对准。
38.如权利要求35至37中任一项的方法，其中该照射区域为照射点。
39.如权利要求35至38中任一项的方法，其包含正交于该询问区域处的该流轴照射该样品。
40.如权利要求35至38中任一项的方法，其包含在至少两个方向上正交于该询问区域处的该流轴照射该样品。
41.如权利要求35至38中任一项的方法，其中照射该样品包含与该流轴同轴配置该照射源及照射该流径中穿过该询问区域的该部分。
42.如权利要求35至38中任一项的方法，其中照射该样品包含: 使用圆锥形光学组件将来自该照射源的电磁能反射至凹形光学组件；及使用该凹形光学组件将该电磁能聚焦于该询问区域上，该凹形光学组件包含与该询问区域重合的焦点。
43.如权利要求35至38中任一项的方法，其中照射该样品包含: 使用圆锥形光学组件将来自该照射源的电磁能反射至环形光学组件，其中该圆锥形光学组件相对于该环形光学组件配置以使得该电磁能由该环形光学组件接收，及使用该环形光学组件将该电磁能聚焦于该询问区域上。
44.如权利要求42或43的方法，其进一步包含使用平面光学组件将来自该照射源的该电磁能反射至该圆锥形光学组件。
45.如权利要求42或43的方法，其中该照射源与该圆锥形光学组件同轴对准。
46.如权利要求35至38中任一项的方法，其中照射该样品包含使用第一凹形光学组件将来自该照射源的电磁能以环形射束形式反射至第二凹形光学组件；及 使用该第二凹形光学组件将该电磁能的环形射束聚焦于该询问区域上。
47.如权利要求46的方法，其中该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件各包含光轴且该等光轴同轴对准。
48.如权利要求47的方法，其中该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件的该等光轴与该收集器组件的该光轴同轴对准。
49.如权利要求35至48中任一项的方法，其中该样品的该流动方向为自该收集器组件的该顶点流向该询问区域，且该流径的一部分穿过该收集器组件。
50.一种在仪器中侦测 分析物的方法，该仪器包含照射源，圆锥形光学组件，第一及第二凹形光学组件，具有顶点、光轴及焦点的凹形收集器组件，及与该凹形收集器组件的该焦点重合的询问区域，该方法包含: 控制封闭流槽中的样品流，该样品流包含或怀疑包含分析物，该封闭流槽包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的该部分与该凹形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉； 使用光学配置照射该询问区域处的该分析物，其中该分析物回应于照射而产生可侦测信号且该光学配置包含: 该第一凹形光学组件及该第二凹形光学组件，其各具有光轴及焦点，及安置于该第一凹形光学组件的内部体积中的该圆锥形光学组件，其中该圆锥形光学组件将来自照射源的电磁能反射至该第一凹形光学组件，该第一凹形光学组件将该电磁能反射至该第二凹形光学组件，且该第二凹形光学组件将该电磁能聚焦于该询问区域上； 用该凹形收集器组件收集该可侦测信号，其中该凹形收集器组件将该可侦测信号反射至侦测器 '及 用该侦测器侦测该可侦测信号。
51.如权利要求50的方法，其中该第一凹形光学组件呈椭球形、抛物形或球形。
52.如权利要求50或51的方法，其中该第二凹形光学组件呈椭球形、抛物形或球形。
53.如权利要求35至52中任一项的方法，其中该收集器组件呈椭球形、抛物形或球形。
54.一种在仪器中侦测分析物的方法，该仪器包含照射源，圆锥形光学组件，第一及第二抛物形光学组件，具有顶点、光轴及焦点的椭球形收集器组件，及设定于与该椭球形收集器组件的该焦点处的询问区域，该方法包含: 控制封闭流槽中的样品流，该样品流包含或怀疑包含分析物，该封闭流槽包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径穿过该收集器组件、该询问区域及安置于该询问区域下游的分选区域，其中该流径中穿过该询问区域的该部分与该椭圆形收集器组件的该光轴同轴对准，且其中该流径中穿过该询问区域及该分选区域的至少一部分以流槽壁为边界以形成连续封闭流径，而无分裂或分叉，及 包围该询问区域的球形组件，该球形组件的折射率在比该流槽壁的折射率大或小0.1范围内； 使用光学配置照射该询问区域处的该分析物，其中该分析物回应于照射而产生可侦测信号且该光学配置包含: 该第一抛物形光学组件及该第二抛物形光学组件，其各包含光轴及焦点，及 安置于该第一抛物形光学组件的内部体积中的该圆锥形光学组件，其中该圆锥形光学组件将来自照射源的电磁能反射至该第一抛物形光学组件，该第一抛物形光学组件将该电磁能反射至该第二抛物形光学组件，且该第二抛物形光学组件将该电磁能聚焦于该询问区域上； 用该椭球形收集器组件收集该可侦测信号，其中该椭球形收集器组件将该可侦测信号反射至侦测器 '及 用该侦测器侦测该可侦测信号。
55.如权利要求35至54中任一项的方法，其中该收集器组件填充有介质，该介质的折射率在比该询问区域处的该流槽壁的折射率大或小0.1范围内。
56.如权利要求35至55中任一项的方法，其进一步包含使用平面镜反射来自该收集器组件的该可侦测信号。
57.如权利要求35至56中任一项的方法，其进一步包含使用与该侦测器对准的针孔装置聚焦来自该收集器组件的该可侦测信号。
58.如权利要求35至57中任一项的方法，其包含控制该样品流以具有自该收集器组件的该顶点向该询问区域移动的流动方向。
59.如权利要求35至57中任一项的方法，其包含控制该样品流以具有自该询问区域向该收集器组件的该顶点移动的流动方向。
60.如权利要求35至59中任一项的方法，其中该流径与该收集器组件的该光轴同轴对准。
61.如权利要求35至60中任一项的方法，其中该流槽为毛细管。
62.如权利要求35至61中任一项的方法，其进一步包含在至少穿过该询问区域的该样品流中形成芯鞘流。
63.如权利要求35至62中任一项的方法,其中该分析物包含第一及第二分析物,该方法进一步包含: 在侦测该可侦测信号后接收来自该侦测器的数据； 利用该所接收的数据判定该询问区域中该分析物的存在；及 利用该所接收的数据判定该分析物是否为该第一分析物或该第二分析物。
64.如权利要求63的方法，其进一步包含控制分选能源以根据该分析物为该第一分析物或该第二分析物的该判定在该分选区域处选择性分选该第一分析物或该第二分析物中的一者。
65.如权利要求64的方法,其中选择性分选包含衍生、杀死、损坏、修饰、破裂或破碎该第一分析物或该第二分析物。
66.如权利要求35至62中任一项的方法，其进一步包含: 在侦测该可侦测信号后接收来自该侦测器的数据，及 控制分选能源以根据该所接收的数据向该分选区域处的该分析物破坏性地给予能量。
67.如权利要求66的方法，其中给予该分析物能量包含衍生、杀死、损坏、修饰、破裂或破碎该分析物。
68.一种用于侦测分析物的仪器，其包含: 照射源； 包含光轴及焦点的物镜； 与该焦点重合的询问区域； 流槽，其具有样品入口、样品出口及设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，其中该流径的至少一部分穿过该询问区域且具有与该光学组件的该光轴同轴对准的流轴；流入该流径中的样品，其包含或怀疑包含分析物，该样品在流轴与该物镜的该光轴同轴对准的该流径的该部分中具有离开该物镜的流动方向，其中该分析物响应于照射而产生可侦测信号； 侦测器，用于侦测该可侦测信号 '及 可控制能源，用于在该光学组件的该焦点下游分选该样品。
69.一种在仪器中侦测分析物的方法，该仪器包含照射源及具有光轴及焦点的物镜、设定于该物镜的该焦点处的询问区域及控制组件，该方法包含: 在离开该物镜的流动方向上控制封闭流槽中的包含分析物的样品流，该流槽包含: 样品入口， 样品出口， 设定于该样品入口与该样品出口之间的流径，该流径以流槽壁为边界，其中该流径的至少一部分穿过该物镜及该询问区域且具有与该物镜的该光轴同轴对准的流轴； 照射该询问区域处的该样品，该分析物响应于照射而产生可侦测信号； 用该物镜收集该可侦测信号且将该可侦测信号反射至侦测器；及 侦测该信号。
70.如权利要求69的方法，其中该分析物包含第一及第二分析物，该方法进一步包含: 在侦测该可侦测信号后接收来自该侦测器的数据； 利用该所接收的数据判定该询问区域中该分析物的存在；及 利用该所接收的数据判定该分析物是否为该第一分析物或该第二分析物。
71.如权利要求70的方法，其进一步包含控制分选能源以根据该分析物为该第一分析物或该第二分析物的该判定选择性分选该第一分析物或该第二分析物中的一者。
72.如权利要求71的方法，其中选择性分选包含衍生、杀死、损坏、修饰、破裂或破碎该第一分析物或该第二分析物。
73.如权利要求中前述任一项的方法或仪器，其中该分析物为精细胞。
74.如权利要求中前述任一项的方法或仪器，其中该分析物包含第一及第二分析物，该第一分析物为包含X染色体的精细胞且该第二分析物为包含Y染色体的精细胞。
75.如权利要求73或74的方法，其进一步包含流体动力学聚焦该样品以使得该等精细胞定向成同方向且在该样品流体中对准，或 如权利要求73或74的仪器，其进一步包含流体动力学聚焦区域，用于使该精细胞定向成同方向且使该等精细胞在该样品流体中对准。
76.原文权利要求76缺失。
77.如权利要求中前述任一项的方法，其进一步包含声学聚焦该分析物以使该样品中的该分析物居中，或 如权利要求中前述任一项的仪器，其进一步包含邻近该流槽的转换器，该转换器可有效发射用于声学聚焦该样品中的该分析物的机械波。
78.如权利要求中前述任一项的方法或仪器，其中该样品以每秒约0.1mm3至每秒约30mm3的速率流过该流槽。
79.如权利要求中前述任一项的方法或仪器，其中该样品以芯鞘流形式流动且鞘流体以每秒约20mm3至每秒约600mm3的速率流动。
80.如权利要求中前述任一项的方法，其包含当该等分析物穿过该询问区域时侦测每秒超过100，000个分析物的该可侦测信号。
【文档编号】G01N15/14GK103477203SQ201280009586
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年2月15日 优先权日:2011年2月15日
【发明者】马克·鲁雪, 兰道·马克斯 申请人:麦克罗毕克斯生物系统公司