用于组织样品固定的方法

用于组织样品固定的方法
【专利摘要】使得处于第一温度的醛固定剂溶液与组织样品接触达第一时间段，另外使得醛固定剂溶液在高于第一温度的第二温度接触组织样品达第二时间段。第一时间段的范围通常为约15分钟至约4小时，且第一温度通常从高于0℃至至少15℃。第二温度通常从超过约22℃至约55℃，且第二时间段的范围为约1小时至约4小时。使用此方法，相比于室温方案的24小时，在约4小时内实现改进的组织形态学和IHC染色以及对翻译后修饰信号的优越保存，并且观察到更均衡的形态学和抗原保存。
【专利说明】用于组织样品固定的方法
发明领域
[0001]公开的实施方案关注通过醛固定来处理组织样品，如对组织样品的福尔马林固定，从而随后将该样品染色和成像用于病理学判读。
[0002]发明背景
[0003]福尔马林已在组织学领域中使用超过半个世纪。当在室温使用时，福尔马林扩散到组织切片中并交联蛋白质和核酸，由此中止代谢、保存生物分子并使组织准备好进行石蜡渗透。在实际中，福尔马林固定主要发生在室温或更高的温度。一些小组在稍微升高的温度实施固定，推测是为了提高交联速率。正如加热提高交联速率一样，冷福尔马林显著降低交联速率。出于此原因，组织学家通常在室温或更高的温度实施组织固定。一些小组使用冷甲醛，但仅在特殊化的情况下使用并且并非用于固定组织。例如，一些小组使用冷福尔马林来检查脂质小滴或其它特殊情况。
[0004]在暴露不足或过度暴露于福尔马林的组织中观察到数种影响。如果组织样品未用福尔马林处理足够长的一段时间，那么该组织在进行标准组织处理时组织形态学通常非常差。例如，在未适当固定的组织中，随后对乙醇的暴露使细胞结构收缩并压缩细胞核，因为该组织不会有机会形成正确交联的点阵(lattice)。当对固定不足的组织染色时(如用苏木精和曙红(H&E))，在细胞和组织结构之间观察到许多白空间，压缩的细胞核和细胞质丧失，而且样品表现为粉红且苏木精染料不均衡。过久暴露于福尔马林的组织通常对于后续免疫组织化学过程作用不佳，推测是因为核酸和/或蛋白质变性和降解。结果，这些组织的最适抗原修复条件作用不当，因此，组织样品表现为染色不足的。
[0005]正确的医学诊断和患者安全性需要在染色前对组织样品的正确固定。因此，肿瘤学家和病理学家已建立用于正确固定组织样品的指南。例如，根据美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology (ASCO)),对于HER2免疫组织化学分析，目前对于中性缓冲福尔马林溶液中的固定时间的指南为至少6小时，优选更久，且长至72小时。开发用于快速固定组织样品的方法对于在显著地降解发生前更好地保存生物学分子和组织形态学，以及尽可能快地为医学专业人员和患者提供准确的测试结合是有利的。
[0006]这类方法对于保存翻译后修饰信号尤为重要。蛋白质的翻译后修饰在细胞代谢中起着极其重要的作用。例如，蛋白质的磷酸化调节许多细胞功能如细胞周期控制、复制、转录和翻译。其它修饰如泛素化可以将那些蛋白质引向降解并对细胞功能有着深刻的影响。遗憾地是，当细胞失去对其中一些修饰的控制时，引起细胞增殖和癌症产生。实际上，大多数癌症途径现在整体上与最终导致细胞变成永生化并诊断为癌性的磷酸化级联关联。对于研究者和公司来说，理解癌症中是否存在特定修饰作为诊断特定癌症类型和/或预测治疗结果的方式是极其重要的。
[0007]遗憾地是，目前存在的方法(通常需要在室温较长的固定和处理时间)对于保存蛋白质修饰是不佳的。在过去，许多研究者都着手于失去蛋白质修饰信号的问题，例如，中止磷酸酶的作用，例如Millipore (激酶抑制剂混合物)目录号20-116)、ThermoScientific (中止磷酸酶抑制剂混合物)目录号78420)等。[0008]工业中其它人已开发出快速冷冻方法以中断修饰酶的作用(Lawson等Cytotoxicity effects of cryoprotectants as single-component and cocktailvitrification solutions, 2011, vol.62, issue2, pagesll5_122)。快速冷冻方法一般适用于其中需要保存完整器官用于移植的情况，而且牵涉DMSO或糖。遗憾地是，快速冷冻可以在最初延缓这类酶的作用，但在样品融化时不抑制其作用。这些办法均具有各种局限性。
[0009]由于实体组织中大多数磷酸酶抑制剂扩散特性较差或缺乏有效性，因此上述办法主要可用于抑制组织提取物或细胞系中的修饰酶。更大的分子抑制剂如蛋白质会具有极其低的扩散速率。更小的分子如原f凡酸盐(orthovanadate)具有更高的扩散速率,但其特异性有限且并非对于所有磷酸酶都极其有效。目前没有通用的、容易执行的、能有效中止实体组织样品中修饰酶作用的方法。如此，本领域中期望开发出在保存组织形态学、蛋白质结构和/或翻译后修饰信号方面提供优秀质量的新的组织固定方法。
[0010]发明概述
[0011]本发明针对用于固定组织的方法。在典型的实施方案中，该方法在保存组织形态学、蛋白质结构和/或翻译后修饰信号方面提供优秀质量。
[0012]某些公开的实施方案关注用于对组织样品进行醛固定(由福尔马林固定例示)的方法，包括在第一温度应用、浸没或以其它方式接触醛溶液和组织样品达第一时间段，然后将组织样品的温度提高至高于第一温度的第二温度达第二时间段。
[0013]醛溶液和组织样品通常在第一温度彼此接触达一段时间，该时间段有效允许醛溶液贯穿扩散到该组织样品的基本上整个横截面。
[0014]组织样品第二温度高于第一温度。组织样品温度的提高可以包括将组织样品的温度相当快速或甚至突然提高至第二温度。进行样品温度的提高以增加交联，同时仍然保存潜在的样品反应性。或者，可以通过将组织样品浸没在处于第二温度的溶液中来实现将组织样品提高至第二温度，其中所述溶液可以是相同或不同的醛溶液。第二温度通常高于环境，更通常高于约22°C，甚至更通常从超过约22°C至至少约50°C，且甚至更通常地从超过约22°C至约45°C。第二时间段有效允许发生内源性分子和结构的基本完全交联。尽管第二时间段可以变化，但它的范围通常是从超过15分钟至长至至少约5小时，通常从约I小时至约4小时，且甚至更通常从约2小时至约3小时。如此设计用于提高温度的速度和方法从而实现翻译后修饰信号的最佳保存。
[0015]尽管第一时间段可以随着组织厚度而变化，但对于厚达4_的厚度，在ASCO CAP指南中其范围通常是从约15分钟至长达约4小时，更通常从超过15分钟至约3小时，且甚至更通常从约I小时至约2小时。公认的是，对于更厚的样品，第一时间段会由扩散速率决定。第一温度为从至少-20°C至约15°C，通常从至少0°C至约15°C，更通常至少0°C至约10°C，且甚至更通常从约3°C至约5°C。
[0016]本方法的某些实施方案包括将处于第一温度的第一醛溶液应用于组织样品，接着将第二醛溶液应用于该组织样品。第二醛溶液可以与第一醛溶液不同。例如，溶液可以处于不同的浓度，或第二醛溶液可以包含不同于第一种醛的醛。所述醛通常是低级烷基醛，如甲醛、戊二醛或其组合。
[0017]本发明一个公开的例示性实施方案包括将组织样品浸没到福尔马林溶液中达第一时间段，所述福尔马林溶液处于等于或高于0°c至高达不超过5°C的温度，所述第一时间段从超过15分钟至长达约4小时。然后，将组织样品浸没到处于第二温度的福尔马林溶液中达第二时间段，所述第二温度为超过约22°C至高达至少45°C，所述第二时间段为从约I小时至约4小时。福尔马林溶液一般是10%NBF。这些处理步骤之后通常是一系列醇清洗，再之后是从超过O分钟至长达至少约30分钟或长至约I小时、约2小时、约3小时或约4小时的清洗液清洗，如二甲苯清洗。然后对组织样品应用蜡以形成蜡浸溃的块。
[0018]如目前理解的，迄今没有人使用过冷却和加热固定办法来提高组织固定的质量。不受操作理论束缚，目前认为在降低的温度，发生很少的交联但固定剂溶液确实渗入基本上整个组织切片中。另外，可能出现的情况是代谢或酶促过程急剧减少。一旦扩散，就快速提高温度，其中交联动力学大大增加。使用此方法，在一些实施方案中，已实现在约4小时中(相比于室温方案的24小时)实现本领域中已知的高质量组织形态学和IHC染色。另夕卜，由于固定剂溶液已基本上扩散到样品中，观察到更均衡的形态学和抗原保存。此方案与现有技术的不同之处在于，将已公开的工作实施方案中通常用于固定组织样品的时间段期间的固定过程分开成第一过程步骤以及第二过程步骤，所述第一过程步骤允许固定剂溶液扩散到组织样品中但使交联最小化，所述第二过程步骤增加交联速率。
[0019]在典型的实施方案中，本方法显著保存组织样品中蛋白质的翻译后修饰信号，例如，保存至少30%、50%、70%或90%的翻译后修饰信号。本发明的组织固定方法能显著地中止破坏翻译后修饰信号的酶活性，如中止磷酸酶的酶活性。
[0020]在另一个典型的实施方案中，本方法显著保存组织样品中的蛋白质的信号，例如，保存至少30%、50%、70%或90%的翻译后修饰信号。本发明的组织固定方法能显著中止降解蛋白质的酶活性，如中止蛋白酶的酶活性。
[0021]在一个例示性实施方案中，使用甲醛固定石蜡包埋(FFPE)的组织样品。本方法相对于现有尝试提供数个优点以保存FFPE组织的修饰状态。本方法使用广泛用于组织学实践的标准福尔马林溶液。低温步骤可以以由冷福尔马林接着是经过加热的福尔马林组成的简单方式实施。本发明在本领域中第一次实现保存FFPE组织中的修饰状态。本技术比现有固定方法更迅速，并且能显著地减少组织标本的周转时间并改进信息流。
[0022]另一个实施方案涉及自动检测方法，包括在自动检测系统中检测依照本发明方法固定的组织样品。
[0023]总之，本方法相对于本领域中现有方法提供至少三处改进。首先，通过允许福尔马林在低温环境中渗透到组织切片中能显著降低酶活性。第二，通过快速提高组织样品温度来增加交联动力学，比在室温所会观察到的更快速地将细胞成分“锁”入位置。此组合使得此技术优于现有方法，并且首次允许在FFPE组织中保存修饰状态。第三，这代表了一种认为适用于很多种修饰状态和酶的通用方法。尽管其他方法靶向一组特定的修饰酶，但此方法使所有修饰酶快速失能，并且因此保存比黄金标准室温规程好得多的一般细胞状态。由于本发明不限于特定组的生物分子或含有特定翻译后修饰的生物分子，因此认为此方法代表一种用于保存任何生物分子或修饰状态的通用方法。如此，本发明能以高质量保存大量的生物分子和含有特定翻译后修饰的生物分子。
[0024]本发明的前述和其它对象、特征和优点从下列详细描述将变为更加明显的，其参照所附图进行。
[0025]附图简述[0026]图1A-1D是用细胞周期蛋白(Cyclin)Dl处理不同时间段(分别为0、2、4和24小时)的组织样品的数字显微镜图像，其图示固定状态对于使用抗体获得的染色结果的强度的影响。
[0027]图2A-2D是用bcl_2处理不同时间段(分别为0、2、4和24小时)的组织样品的数字显微镜图像，其图示固定状态对于使用抗体获得的染色结果的强度的影响。
[0028]图3A-3F是依照不同处理方案处理的组织样品的数字显微镜图像，其图示当用bcl-2、二氨基联苯胺和苏木精试剂处理组织样品时，将组织样品用10%中性缓冲的福尔马林溶液预浸泡10分钟、30分钟和60分钟(分别为A-C和D-F)提高染色质量；图3A-3C是在没有预浸泡的情况下用10%中性缓冲的福尔马林溶液40°C处理获得的图像；图3D-3F是在4°C、10%中性缓冲的福尔马林溶液中2小时预浸泡，接着用10%中性缓冲的福尔马林溶液40°C固定的样品；而图3G和3H是图3C和3F中分别指示的区域的放大图。
[0029]图4A-4B是图3C和3F中所指示区域的进一步放大的数字显微镜图像。
[0030]图5是通过用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性缓冲的福尔马林溶液处理组织样品达0.5-6小时的不同时间段所获得的组织形态学结果的示意图。
[0031]图6是使用在35°C、40°C、45°C和5(TC的10%中性缓冲的福尔马林溶液处理达
0.5-6小时的不同时间段的组织样品，通过bcl-2免疫组织化学分析所获得的抗原性结果的示意图。
[0032]图7是使用有或无预浸泡处理的、用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性缓冲的福尔马林溶液处理达0.5-6小时的不同时间段的组织样品，通过bcl-2免疫组织化学分析所获得的抗原性结果的示意图。
[0033]图8是相比于无预浸泡对照，用各种预浸泡时间处理组织样品的抗原性和组织形态学结果的示意图。
[0034]图9是相比于无预浸泡对照，用各种预浸泡时间处理组织样品的抗原性和组织形态学结果的示意图。
[0035]图10是相比于无预浸泡对照，用各种预浸泡时间处理组织样品的抗原性和组织形态学结果的示意图。
[0036]图1lA-E是在Calu-3异种移植物上对pAKT染色的显微镜图像。
[0037]图12A-D是在有或无磷酸酶(phosphate)处理下在Calu-3异种移植物上对pAKT染色的显微镜图像。
[0038]图13A-B是在有原位导管癌(DCIS)的人乳腺上对pAKT染色的显微镜图像。
[0039]图14A-D是在热降解下在Calu-3异种移植物上对pAKT染色的显微镜图像。
[0040]图14E是在不同条件的热降解下在Calu-3异种移植物上对pAKT阳性染色的定量分析的示意图。
[0041]图15A-E是在Calu-3异种移植物上对pAKT染色的显微镜图像，其显示在取出样品后翻译后信号的降解。
[0042]图16A-1是在人结肠癌上对磷酸标志物染色的显微镜图像。
[0043]图16J和K是在不同固定条件下的正常和癌瘤细胞中对pAKT或pPRAS40阳性染色的定量分析的示意图。
[0044]图17A和B是在人乳腺原位导管癌(DCIS)中对miRNA保存染色的显微镜图像。[0045]图18A和B是在人乳腺原位导管癌(DCIS)中对DNA保存染色的显微镜图像。
[0046]图19A、B和C是在人结肠癌上对Hifl α保存染色的显微镜图像。
[0047]发明详述
[0048]1.缩写、术语和导言
[0049]除非另外记载，依照常规用法来使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于 Benjamin Lewin, Genes VII,由 Oxford University Press 出版，2000(ISBN019879276X) ；Kendrew 等(编)，The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Publishers 出版，1994 (ISBN0632021829)；和 RobertA.Meyers (编),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference，由 Wiley, John&Sons, Inc.出版，1995 (ISBN0471186341);以及其它类似的参考文献。
[0050]如本文中使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，词语“或”意图包括“和”。而且，如本文中使用的，术语“包括/包含”以其法律上接受的定义和方式使用，且在本文中无一处意图改变此类含义。还必须理解，对核酸或多肽或其它化合物给出的所有核苷酸大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均是近似的，并且提供以用于描述。尽管可在实践中或测试本公开中使用类似于或等同于本文中描述的那些的方法和材料，但在下文描述了适宜的方法和材料。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括术语解释在内)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为例示性的且不意图为限制的。
[0051]为了帮助对本公开各实施例的审查，提供下列对缩写和特定术语的解释:
[0052]H&E:苏木精和曙红染色。
[0053]IHC:免疫组织化学。
[0054]ISH:原位杂交。
[0055]NBF:中性缓冲的福尔马林溶液。
[0056]醛:就本发明目的而言，术语“醛”指含有醛的固定剂的交联类型。含有醛的交联固定剂的许多例子是组织学中的常识，包括布安氏液(Bouin’ S)、GlyoxaU乙二醛)、锌-福尔马林、酸性福尔马林(AFA)和戊二醛。
[0057]烷基:饱和的脂肪链。
[0058]动物:活的多细胞脊椎生物，一个包括例如哺乳类和鸟类的范畴。术语哺乳类包括人和非人哺乳类。类似地，术语“受试者”包括人和牲畜受试者，例如人、非人灵长类、犬、猫、马和牛。
[0059]抗体:“抗体”统指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子(举例而言且无限制地，包括IgA, IgD, IgE, IgG和IgM、其组合，以及在任何脊椎动物例如哺乳类如人、山羊、家兔和小鼠的免疫应答期间生成的类似的分子)和抗体片段，其特异性结合感兴趣的分子(或一组高度类似的感兴趣分子)以至于实质性排除对其它分子的结合(例如，对感兴趣分子具有的结合常数比对生物学样品中的其它分子的结合常数高至少IO3M'高至少IO4M4或高至少IO5IT1的抗体和抗体片段)。
[0060]更具体地，“抗体”指特异性识别并结合抗原表位的包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，其各自具有可变区，称为可变重(Vh)区和可变轻(VJ区。Vh区和'区一起负责结合抗体所识别的抗原。
[0061]抗原:可以被特定体液或细胞免疫的产物，如抗体分子或T细胞受体特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子如复杂的碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白质。常用的抗原范畴包括但不限于，病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其它寄生物抗原、肿瘤抗原、牵涉自身免疫性疾病、变态反应和移植物排斥的抗原、毒素和其它混杂性抗原。在一个实施例中，抗原是芽孢杆菌(Bacillus)抗原如YPGA。
[0062]表位:抗原决定簇。这些是分子上抗原性的(即引发特异性免疫应答的)特定化学基团或连续或不连续的肽序列。抗体结合特定抗原性表位。
[0063]福尔马林:甲醛在水中的商业化溶液，其通常用于保存生物学标本。用作固定剂的福尔马林通常是10%中性缓冲的福尔马林(NBF)，但也可以使用其他溶液浓度。如此，可用的福尔马林固定浓度的范围通常从超过0%至高达至少20%，更通常地从5%至高达15%，其中本发明的某些公开的工作实施方案使用10%NBF溶液来固定组织样品。
[0064]半抗原:一种分子，通常为能与抗体特异性组合的小分子，但通常除与载体分子组合以外基本不能为免疫原性的。
[0065]免疫应答:免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞(polymorphonucleocyte))对刺激的响应。免疫应答可以包括身体中涉及宿主防御应答的任何细胞，例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于，先天性免疫应答或炎症。
[0066]分离的:“分离的”微生物(如病毒、细菌、真菌或原生动物)已与不同类型、株或物种的微生物基本分开或从其纯化出来。可以通过多种技术来分离微生物，包括系列稀释
和培养。
[0067]“分离的”生物学组分(如核酸分子、蛋白质或细胞器)是已与该组分天然存在的生物细胞中其它生物学组分(如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本分开或从其纯化出来的。已“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质，或其片段。
[0068]低级烷基:含有1-10个碳原子的饱和脂肪链。
[0069]哺乳动物/哺乳类:该术语包括人和非人哺乳动物两者。类似地，术语“受试者”包括人和牲畜受试者。
[0070]感兴趣的分子或靶物:要针对其存在、位置和/或浓度进行测定的分子。感兴趣分子的例子包括蛋白质和核酸序列。
[0071]单克隆抗体:由B淋巴细胞的单一克隆或其中已转染单一抗体的轻链和重链基因的细胞生成的抗体。单克隆抗体由本领域中技术人员已知的方法生成，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂合抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0072]多重/多路:如期望的，在样品中基本同时或序贯地检测多个靶物。多重可以包括一般地鉴定和/或量化核酸、DNA、RNA、肽、蛋白质，分别地或以任意和所有组合地。
[0073]赘生物形成(Neoplasia)和肿瘤:细胞的异常和不受控生长的过程。赘生物形成是增殖性病症的一个例子。赘生物形成的产物是赘生物(肿瘤)，它是起因于过度细胞分裂的组织的异常生长。不转移的肿瘤被称为“良性的”。入侵周围组织和/或能转移的肿瘤被称为“恶性的”。血液学肿瘤的例子包括白血病，其包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病以及成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症(polycythemiavera)、淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin ' s)病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛性(indolent)和高级形式)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom, s macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、毛细胞白血病和脊髓发育不良(myelodysplasia)。
[0074]实体瘤如肉瘤和癌瘤的例子包括，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性(lymphoid malignancy)、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颉咽管瘤(craniopharyogioma)、室鼓膜瘤(ependymoma)、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑[脊]膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
[0075]多肽:其中单体为经由酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。如本文中使用的，术语“多肽”或“蛋白质”意图涵盖任何氨基酸序列并且包括经修饰的序列如糖蛋白。术语“多肽”特定地意图涵盖天然存在的蛋白质以及那些重组或合成生成的蛋白质。
[0076]术语“残基”或“氨基酸残基”包括对掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸的提述。
[0077]蛋白质:由氨基酸构成的分子，特定地为多肽。
[0078]翻译后修饰:在蛋白质翻译后对其进行的化学修饰。对于许多蛋白质，它是蛋白质生物合成(如此以及基因表达)中的后期步骤。氨基酸的翻译后修饰扩展了蛋白质功能的范围，其通过对其附接其它生化功能基团(如乙酸根、磷酸根、各种脂质和碳水化合物)、改变氨基酸的化学性质(例如瓜氨酸化)或进行结构改变(例如形成二硫桥)来进行。还有，塵可以从蛋白质的氫基端除去氨基酸，或在肽链中部切割。例如，在形成二硫键后肽激素胰1?被切割两次，且从链中部移出皿;所得蛋白质由通过二硫键连接的两条多肽链组成。而且，大多数新生多肽开始于氨基酸甲硫氨酸，因为HiMA上的“起始”密码子也编码此氨基酸。此氨基酸在翻译后修饰中通常被拿掉。
[0079]其它修饰如磷酸化是用于控制蛋白质行为(例如活化或灭活某酶)的普遍机制的一部分。
[0080]可以通过使用本文中公开的方法来实现对翻译后修饰信号的保存。所述方法显著保存组织样品中蛋白质的翻译后修饰信号，例如，保存至少50%、70%、90%或99%的翻译后修饰信号。在一个例示性实施方案中，将通过翻译后修饰信号的PAKT的免疫组织化学信号用作显示对翻译后修饰信号保存的指示物。[0081]蛋白酶:也称为蛋白水解酶蛋白酶,是一大组酶。蛋白酶属于称为水解酶的这类酶，它们在水分子的参与下催化对各种键的2K經反应。
[0082]蛋白酶牵涉将长蛋白质链消化成短片段、分裂连接氨基酸残基的肽键。它们中的一些能将末端氨基酸从蛋白质链脱离(外肽酶，如氨肽酶、羧肽酶A);其它蛋白酶攻击蛋白质的内部肽键(内肽酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶)。
[0083]依照蛋白酶的催化活性位点和作用条件将其分为4个主要的组:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。蛋白酶对特定基团的附接取决于其活性所必需的催化位点和氨基酸(作为成分之一)的结构。
[0084]样品:从受试者犾得的含有基因组DNA、RNA (包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物学标本。例子包括但不限于，外周血、尿液、唾液、组织活检(biopsy)、外科手术标本、羊膜穿刺(amniocentesis)样品和尸检材料。在一个实施例中，样品包括腺癌活检、非癌性组织的样品和正常组织的样品(来自未患已知疾病或病症的受试者)。
[0085]特异性结合模块:特异性结合对的成员。特异性结合对是一对分子，其特征在于它们彼此结合以至于实质性排除对其它分子的结合(例如，特异性结合对能具有比结合对两成员中任意一个与生物学样品中其它分子的结合常数高至少IO3M'高至少IO4M4或高至少IO5M-1的结合常数)。特异性结合模块的特定例子包括特异性结合蛋白(例如抗体、凝集素、亲合素如链霉亲合素、和蛋白A)、核酸序列、和蛋白质-核酸。特异性结合模块还可包括这类特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
[0086]I1.导言
[0087]固定保存生物学样品(组织或细胞)用于后续检查。有3种用于固定组织样品的主要方法。热固定牵涉将样品暴露于足够的热达足够的时间以消除细胞蛋白质的活性，由此中止细胞代谢。热固定一般保存细胞形态学而非蛋白质结构。
[0088]灌注通过血液流动固定样品。将固定剂注射到心脏中并传播到整个身体。此方法保存形态学，但受试者死亡且由于所需固定剂的体积该方法是昂贵的。
[0089]化学固定牵涉将组织样品浸没在大量化学固定剂中，其通常为要固定的组织体积的至少20倍。固定剂扩散通过组织样品并尽可能与活组织接近地保存结构(化学上和结构上的)。交联固定剂(通常为醛)创建组织样品中存在的内源性生物学分子(如蛋白质和核酸)之间的共价化学键。甲醛是组织学中最常使用的固定剂。可以以各种浓度使用甲醛来固定，但它主要以10%中性缓冲的福尔马林(NBF)使用，其为约3.7%甲醛在水性磷酸盐缓冲盐水溶液中。多聚甲醒(Paraformaldehyde)是甲醒的聚合形式,其在加热时解聚以提供福尔马林。戊二醛以与甲醛类似的方式运转，但它是具有更慢的跨膜扩散速率的更大分子。戊二醛固定提供更刚性或更紧密连接的固定产物，其导致快速且不可逆的变化，在4°C快速且较好地固定，提供较好的总体细胞质和细胞核详情，但对于免疫组织化学染色是不理想的。一些固定方案使用甲醛和戊二醛的组合。
[0090]II1.开发背景
[0091]众所周知的是，能通过提高福尔马林的温度来增加组织固定动力学。然而，由发明人进行的最初研究指示，将组织样品直接置于经过加热的福尔马林固定剂中导致在福尔马林渗透到组织中心之前组织外部就早已交联。福尔马林对密实组织的扩散比在升高温度时的交联动力学要缓慢。在此情况下，加热中心处的生物分子而没有任何显著交联，并且因此这些分子更易受到降解和损害的影响。
[0092]因此，本发明的一些公开的实施方案通过首先将组织样品预浸泡在冷固定剂如福尔马林中来将固定剂扩散与不想要的交联分开。然后，在固定剂已渗透到组织后，可以提高固定剂温度以增加交联动力学。这表现为产生更均衡固定的保存生物分子的样品。已进行一系列组织样品固定实验，其仅使用经过加热的福尔马林或将样品首先在低温(例如，从-20V至10°C、从-10°C至5°C、从-0°C至5°C或4°C )在福尔马林中“预浸泡”，接着将同一样品进行加热福尔马林处理。
[0093]作为本发明的一部分，能有效允许固定剂扩散到感兴趣组织中的较低温度溶液可能能在保存翻译后修饰上更有效。可以考虑任何降低凝固点并由此允许固定剂在低于o°c使用的对福尔马林的添加。例如，加入高浓度的盐通常将凝固点降低几度。涵盖向福尔马林溶液直接加入盐，由此将甲醛浓度保持相对不变。另外，由二醇构成的溶液或抗凝固型溶液也会是有效的。这些溶液可以将凝固点降到低至-20°C。不同类型的化学添加剂的例子是本领域中已知的，包括但不限于各种盐和二醇。
[0094]经预浸泡的样品表现为提供在样品中心更好的组织形态学以及更好的抗原保存。
[0095]IV.处理步骤
[0096]本发明的某些公开的实施方案关注多步骤(通常为两步骤)的组织固定方法，用于用醛固定剂(如福尔马林和/或戊二醛)来输注/扩散组织样品。在第一步骤期间，在允许固定剂扩散贯穿样品的基本上整个横截面的条件下用固定剂溶液处理组织样品。此第一步骤使用第一温度的固定剂组合物进行第一段时间，引起基本上完全的组织输注/扩散。第二步骤是使组织样品在第二、更高的温度接受固定剂组合物以允许交联以尽可能快的速率发生，而不损害组织特征如抗原性和形态学。这些处理步骤的每一个均在下文详细论述。
[0097]组织制备过程初始涉及固定剂溶液扩散整个样品。这通常通过将组织样品浸泡到在第一期望温度的期望固定剂组合物中完成。在此初始步骤后一段时间，将组织样品从第一温度的固定剂溶液中取出并浸泡到在高于第一温度的第二温度的固定剂溶液中。此第二步骤进行期望的第二段时间。第一和第二固定剂溶液可以是相同的固定剂溶液，例如NBF，或者是不同的固定剂溶液。作为又一个例子，可以对不同步骤使用完全不同的醛固定剂，如甲醛和戊二醛。而且，代替将样品从在第一温度的固定剂溶液取出，可以将该固定剂温度快速提高至第二温度，如通过使用微波加热。这些步骤中的一个或两个可以伴随着机械搅动固定剂溶液和/或可以伴随着对样品应用超声波。
[0098]在一个例示性实施方案中，本文中描述的发明使用福尔马林作为选定的固定剂，但这不是必须的。福尔马林在磷酸盐缓冲液中含有3.7%甲醛并中和到约pH7.0。然而，可以在本发明中使用含有组织学领域中已知醛的交联固定剂的许多变体，其包括但不限于，布安氏液、Glyoxal(乙二醛)、锌-福尔马林、酸性福尔马林(AFA)和戊二醛等。
[0099]然后对组织样品进行一系列醇浸没，其通常使用范围为从约70%至约100%的递增醇浓度来使样品脱水。醇通常是烷醇，特别是甲醇和/或乙醇。本发明的具体的工作实施方案将70%、95%和100%乙醇用于这些系列脱水步骤。
[0100]在最后一个醇处理步骤后，接着将样品浸没到另一种通常称为清洗溶液的有机溶剂中。此清洗溶液(I)除去残余的醇，并(2)使得样品更为疏水性以进行随后的上蜡步骤。清洗溶剂通常是芳香族有机溶剂如二甲苯。通过对样品应用蜡(通常为石蜡)来形成蜡块。然后从蜡块切出载玻片。
[0101]对于处理步骤的以下论述，本领域普通技术人员会领会的是，可以考虑各种因素来推导出用于特定组织样品的最佳处理条件。这些因素包括:样品厚度，其通常范围为约Imm至约IOmm厚，更通常为约2mm至约8mm厚，且甚至更通常为约4mm至约6mm厚；固定剂溶液体积对组织样品质量，其通常为约10:1至约50:1的体积对质量；固定剂组合物；温度；和样品在固定剂组合物中的浸没时间。
[0102]对于在交联固定剂中浸泡的第一和第二时间的优选描述基于ASC0CAP指南，其中优选的组织厚度厚达约4_。组织厚度可以低于或高于4_，甚至达到整个器官。由于本发明依赖于第一扩散步骤，更厚的组织切片在冷固定剂中会需要比优选的1-5小时更久且长达12小时或更长的第一时间。另外，本领域中技术人员能理解，在固定剂溶液中的第二时间可以久于优选方法的1-5小时且长达8小时或更久。例如，6_厚的组织样品具有在固定剂溶液中4小时的优选第一时间，和在固定剂溶液中4小时或更久的第二时间。本领域中还理解，一些组织类型和一些组织器官可具有与本发明的优选方法稍微不同的时间。
[0103]A.固定剂扩散处理
[0104]该方法的第一步骤是在有效允许组合物基本完全扩散至贯穿样品的基本上整个横截面的条件下用固定剂组合物处理组织样品。第一步骤的有效温度范围是从高于_20°C至至少15°C，优选高于0°C至更通常约10°C的上限温度，且甚至更通常从约3°C至约5°C。对于工作实施方案，温度通常为约4°C。
[0105]当温度升高时，交联速率增加。而且，此第一处理步骤试图平衡与固定剂组合物基本完全扩散贯穿组织样品的整个横截面有关的有益特性，同时最小化与启动交联有关的影响。然而，扩散也随着温度升高而增加，因此对于给定的样品，已发现最大化扩散速率并最小化任何与增加的交联速率有关的有害影响表现为增加益处。
[0106]固定剂组合物到组织样品中的扩散持续达一段时间，该段时间对于组合物扩散贯穿样品的基本上整个横截面是有效的。第一处理步骤的时间段的范围从约15分钟至长达约4小时，最通常从超过15分钟至约3小时，较好的结果通常通过进行固定剂组合物扩散步骤达约1.5小时至约2小时获得。将扩散时间增加至4小时或更久一般具有极小的有益影响。
[0107]与第二处理步骤有关的温度通常高于环境，如高于约22V。对于工作实施方案，温度通常高于环境至高达至少55°C，更通常从约35°C至约45°C，因为该温度范围充分增加交联动力学以允许相对快的组织交联。然而，如果将温度提高到约50°C之上，样品通常开始降解，这对于某些后续组织学反应可能有有害影响。如此，选择温度和时间段上限以允许随后的成像处理步骤(如原位杂交、IHC和/或H&E)有效进行。第二处理步骤的时间段的范围从超过15分钟至长达至少约5小时，更通常为至少约I小时至约4小时，且更通常为约2小时至约3小时。某些公开的工作实施方案在45°C进行第二处理步骤达1.5小时。
[0108]B.附图论述
[0109]图1A_1D(细胞周期蛋白Dl)和2A-2D(bcl_2)来自一系列对照载玻片，其中将组织样品浸没于室温福尔马林中分别达0、2、4和24小时。行业标准需要至少6小时，且更通常地至少8小时，长达72小时的室温福尔马林固定时间。由图1A-1C提供的对照图像例示，不充分固定组织样品(即0、2和4小时的处理时间)时使用细胞周期蛋白Dl免疫组织化学染色方案染色不佳。对照载玻片2A-2C例示，不充分固定组织样品(即0、2和4小时的处理时间)时使用bcl-2免疫组织化学染色方案染色不佳。然而，如基于已知标准会预期到的，将固定时间增加至24小时(图1D和2D)提供经可接受染色的组织样品。
[0110]图3A-3H例示将预浸泡处理用于bcl-2染色的影响。图3A-3C是未预浸泡处理并浸没到40°C 10%NBF溶液中分别达10分钟、20分钟和60分钟的组织样品的图像。图3D-3F是在10%福尔马林固定溶液中预浸泡处理2小时，接着浸没到40°C 10%NBF溶液中分别达10分钟、20分钟和60分钟的组织样品的图像。图3G是来自图3C的区域的放大图，而图3H是来自图3F的区域的放大图。图3A例示来自无预浸泡和10分钟、40°C 10%NBF溶液处理的未充分染色结果。染色程度随着30分钟和60分钟的处理时间延长而增加，其结果分别由图3B和3C提供。图3D-3F也例示预浸泡提供增强的染色结果。然而，可能甚至更具重要性的是通过应用不同处理方案导致的组织染色的均衡性。图3A-3C相对于其时间对应物从样品的外部部分至内部部分是不均衡染色的，所述时间对应物在4°C 10%福尔马林固定溶液中进行2小时预浸泡。此外，每份经预浸泡的样品还具有增强的染色。
[0111]图3G和3H分别来自人扁桃体样品生发中心的图3C和3F的代表性区域。图3C显示组织样品的染色没有图3F的代表性区域好，图3F的代表性区域是在4°C 10%福尔马林固定溶液中进行2小时预浸泡。图3G打分为2+，而3H打分为3+。还有，图3H包含在载玻片中部的已染色的未成熟的淋巴细胞，这提供清楚指示，即使用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡实质性增加了染色方案的灵敏性。图3G未允许显现这些淋巴细胞。
[0112]图4A和4B是图3G和3H的增强的图像。图4B的箭头例示使用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡所产生图像结果的增强的详情。组织形态学对于使用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡产生的组织样品也更好。这可以通过观察图像左边和图像内部看到。对于未在4°C 10%福尔马林固定溶液中进行2小时预浸泡的组织样品，福尔马林未扩散到内部，因此样品的形态学(图4A)不像使用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡产生的组织样品的形态学(图4B)那样得到保存。如果允许在后面应用的提高温度的处理步骤之前发生扩散，那么样品的化学和结构保存要好得多。图像的白空间例示较差固定的区域。当将这类组织样品在随后脱水时，组织收缩并产生更大体积的白区域，其指示较差的固定。
[0113]图5是通过对组织样品的H&E染色获得的组织形态学结果的示意图，上述组织样品首先用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡处理，接着相对于室温对照用在35°C、40°C、45°C和5(TC的10%中性缓冲的福尔马林溶液处理达0.5至6小时的不同时间段。24小时室温载玻片是期望的标准，将处理方案与其进行比较。图5汇总了数项试验的结果，其聚焦于确定提供优越组织形态学的最佳的第二更高温度的浸泡。尽管图5例示使用高达50°C的交联处理温度获得的结果，但还尝试了高得多的处理温度。然后主观评估每份组织样品。浅灰色单元指示不想要的结果；中灰色单元指示中等但并非最佳的结果；而深灰色单元指示该组织样品与24小时室温结果是可比的。温度越高，就需要越少的时间来实现期望的组织形态学。本领域中普通技术人员会领会，通过用高达50°C的福尔马林交联处理温度仅2至6小时提供较好的组织样品。
[0114]图6是通过使用对组织样品的二氨基联苯胺染色所获得的bcl-2免疫组织化学结果的示意图，该组织样品首先用在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡处理，接着相对于室温对照用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性缓冲的福尔马林溶液处理达0.5至6小时的不同时间段。再一次地，增加温度的结果的深灰色单元是与24小时室温结果可比的结果。对于组织形态学和H&E染色，增加温度的处理步骤的温度和时间不太重要，直至使用高达65°C的温度。在该温度后，组织形态学受到有害影响。然而，如图6中指示的，IHC染色对于为上限温度处理步骤选择的温度更敏感。不受具体操作理论束缚，可能的情况是更高的温度使蛋白质变性，抗体也不识别或完全不识别蛋白质上的表位，因此产生降解的IHC染色结果。如此，通过考虑对组织形态学、IHC和原位杂交技术的影响来最好地选择特定方案。
[0115]图7例示对于无预浸泡测试相比于在4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡，来自IHC染色的抗原性结果。加热一般对于组织样品是潜在有害的。这可以对于无预浸泡测试结果看到。对未进行4°C 10%福尔马林固定溶液中2小时预浸泡的样品在45°C和50°C任何加热在抗原性染色结果上具有强烈的负面影响。相比之下，对于在4°C 10%福尔马林固定溶液中进行2小时预浸泡的样品，将组织样品在45°C和50°C加热达短至0.5小时至长达I至2小时产生与24小时室温方法可比的图像结果。
[0116]图8-10例示通过考虑样品的不同预浸泡时间所获得的抗原性和组织形态学结果，所述样品在4 °C 10%福尔马林固定溶液中处理达在图顶部指示的时间量,接着在45 °C组织固定达在各单元中指示的时间段。图8-10例示仅预浸泡I小时对于抗原性结果实质性有益，但2-4小时浸泡对于最佳组织形态学结果可能是优选的。
[0117]图1lA-E例示翻译后修饰信号保存，即用不同固定方案对Calu-3异种移植物上pAKT染色的显微镜图像。将新鲜收获的Calu-3异种移植物肿瘤切成两个大致相等的部分，并用在RT的10%NBF (福尔马林)或在4°C的10%NBF处理。在取出肿瘤5分钟以内，将用RT福尔马林处理的肿瘤样品直接置于溶液中。然后，在浸没后O(A)、2 (B)、4(C)或24(D)小时的时间间隔时将样品从福尔马林取出。将一份肿瘤样品直接置于4°C福尔马林中2小时，然后转移至45°C福尔马林再达2小时(双重温度固定方案)。在所述双重温度固定方案(2+2) (E)中，抗pAKT抗体的染色指示保留比标准RT福尔马林方法显著更多的pAKT (将24小时(D)与2+2小图(E)比较)。
[0118]图12A-D例示在图1lA-E中观察到的信号确实是翻译后修饰保存，其通过有(B和D)或无磷酸酶处理(A和C)在Calu-3异种移植物上对pAKT染色来证明。当用磷酸酶处理样品时(B和D)，消除了抗体的特异性染色，这指示该抗体识别磷酸-模块并且是特异性的。
[0119]图13A-B例示用所述双重温度固定方法(2+2;B)的翻译后修饰保存，其通过在具有原位导管癌(DCIS)的人乳腺上用抗pAKT抗体对pAKT染色来证明。在所述双重温度固定(2+2;B)方案中保存比标准RT福尔马林方法显著更多的pAKT(将24小时㈧与2+2小图比较)。另外，染色对于在所述双重温度固定方案样品中的膜表现为远远更特异性的。
[0120]图14A-D例示用所述双重温度固定方法(2+3.5;B)的翻译后修饰保存，其通过在Calu-3异种移植物上用抗pAKT抗体对pAKT染色来证明。图14F是对图14A-D中显示的PAKT阳性染色的定量分析的示意图。在所述双重温度固定(2+3.5)样品中保存比标准RT福尔马林方法显著更多的pAKT(将24小时与2+3.5小图比较)。在4°C的第一温度浸泡对于保存磷酸标志物是必要的，因为没有第一冷浸泡直接置于经过加热的福尔马林中的肿瘤样品没有保留PAKT染色(0+3.5小图)。
[0121]图15A-F例示在取出样品后的翻译后信号降解。将新鲜收获的Calu-3异种移植物肿瘤切成两个大致相等的部分，包裹在盐水浸泡过的纱布中并置于湿冰上O(A)、10(B)、30 (C)、60 (D)、120 (E)或240 (F)分钟。然后，将每份样品置于4°C福尔马林中2小时，接着转移至45°C福尔马林再达2小时。pAKT信号在取出后30分钟内显著降低(C)，即使在冷却至4°C湿冰时也是如此。
[0122]图16A-1例示用本发明的方法在人结肠癌上对磷酸标志物的保存(底部小图)。还将样品用苏木精和曙红染色(顶部小图)以用于比较组织形态学。图16J和K是在不同固定条件下在正常细胞(在每个示意图的右手边显示的3个条)和癌瘤细胞(在每个示意图的左手边显示的3个条)中对pAKT或pPRAS40阳性染色的定量分析的示意图。出于定量目的使用Aperio载玻片扫描仪扫描载玻片(下部图)。将像素分成(binned)指示阳性(褐色)或阴性(蓝色)的组(由阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性组成的4个组)。在图中报告阳性像素的百分比(所有阳性像素的总和)。在所述双重温度固定(2+2)方案中保存比标准RT福尔马林方法显著更多的磷酸标志物(将24小时与2+2小图比较)。另外，经历有目的的缺血的样品具有比通过所述双重温度固定方案固定的样品或通过24小时室温标准方案固定的样品显著更少的磷酸标志物的保留。
[0123]图17A和B是在人乳腺原位导管癌(DCIS)中对miRNA保存染色的显微镜图像，依照所述双重温度固定方案(2小时4°C 10%NBF，接着是2小时45°C 10%NBF)保存含有原位导管癌(DCIS)的乳腺组织样品，其与那些通过标准24小时室温福尔马林浸泡所固定的样品相比较。在两种样品中均清楚可见miR205染色的强度(强烈的蓝色信号，例示信号由箭头指示)。2+2样品的保存表现为比标准对照24小时固定的组织的保存更为强烈。
[0124]图18A和B是在人乳腺原位导管癌(DCIS)中对DNA保存染色的显微镜图像。实施Ventana的双重ISH方案(DDISH，染色体17/HER2)来测试检测两种不同DNA靶物的单一和多个拷贝的能力。依照Ventana快速固定方案(2小时4°C 10%NBF，接着是2小时450C 10%NBF)保存含有原位导管癌(DCIS)的乳腺组织样品，其与那些通过标准24小时室温福尔马林浸泡所固定的样品相比较。这例示了所述双重温度固定方案保存组织中的核酸DNA并能通过商品化探针检测出来。
[0125]图19A、B和C是在人结肠癌上对Hifla保存染色的显微镜图像。收获人结肠样品并在从患者取出3-7分钟内进行处理。将样品切成大致4_的片，并用3种不同的方案处理。在方案I中，将样品直接置于4°C的福尔马林中2小时，然后转移至45°C福尔马林再达2小时(A)。在方案2中，将样品置于室温福尔马林在浸没后达24小时(B)。在方案3中，使样品有目的地缺血I小时，然后置于室温福尔马林达24小时(C)。在所述双重温度固定(2+2)方案中保存比标准RT福尔马林方法显著更多的Hifla (将24小时与2+2小图比较)。另外，经历有目的地缺血的样品具有比通过所述双重温度固定方案固定的样品(2+2)或通过标准24小时固定方案固定的样品显著更少的Hifl a的保留。
[0126]V.本发明的使用
[0127]本发明可与传统组织化学以及免疫组织化学和原位杂交领域中已知的任意染色系统和方案一起使用。本发明还可以与各种自动化染色系统一起使用，如那些由Ventana Medical Systems, Inc.，Tucson, AZ 销售的，包括 Benchmark XT、BenchmarkUltra和Discovery自动化平台。例示性系统披露于美国专利N0.6，352，861、美国专利N0.5，654，200、美国专利N0.6，582，962、美国专利N0.6，296，809和美国专利N0.5，595, 707。
[0128]下列描述例不了自动化方法和系统的一个合适的实施方案。关注自动化系统和方法的另外的信息还可见于PCT/US2009/067042。显色检测有助于对装置上样式的视觉独立的解译。
[0129]在例示性实施方案中，经由与多种酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP))缀合的抗-物种抗体实现检测。根据缀合至各抗体的酶的多样性，将此酶-抗体缀合物称为HRP或AP多聚体。多聚体技术记载于美国申请N0.12/687，564。
[0130]此类型的检测化学技术目前由Ventana Medical Systems Inc.作为ultraView通用DAB检测试剂盒(P/N760-500)、ultraView通用AP红检测试剂盒(P/N760-501)、ultraView 红 ISH DIG 检测试剂盒(P/N760-505)和 ultraView SISH DNP 检测试剂盒(P/N760-098)销售。
[0131]在例示性实施方案中，该办法使用非内源性半抗原(例如，非生物素，参见美国申请N0.12/660, 017)。在例示性实施方案中，可以与此办法一起使用酪酰胺(tyramide)信号扩大以进一步增加检测的灵敏性和动力学范围(参见PCT/US2011/042849)。
[0132]任何合适的酶/酶底物系统可以用于所公开的固定方法。工作实施方案通常使用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。如果酶是碱性磷酸酶，那么一种合适的底物是硝基蓝氯化四唑(nitro blue tetrazolium chloride) / (5-溴-4-氯-1H-卩引哚-3-基)二氢憐酸(NBT/BCIP)。如果酶是辣根过氧化物酶，那么一种合适的底物是二氨基联苯胺(DAB)。众多其他的酶-底物组合是本领域技术人员已知的。对于这些的一般综述，参见美国专利N0.4，275，149和4，318，980。在一些实施方案中，酶是过氧化物酶，如辣根过氧化物酶或谷胱甘肽过氧化物酶或氧化还原酶。
[0133]美国专利公开2008/0102006描述了由微型处理器操作和控制的机器人流体分配器。美国专利公开2011/0311123描述了用于自动化检测免疫组织化学(IHC)样式的方法和系统。在这些专利申请中披露的自动化检测系统可用于检测本发明所固定的组织样品。
实施例
[0134]提供下列实施例以例示本发明工作实施方案的某些特征。本领域中普通技术人员会领会本发明的范围不限于在这些实施例中所记载的特征。
[0135]实施例1
[0136]本实施例关注在30°C、40°C、5(rC和60°C固定的小鼠肾样品的固定时间过程，并确认先前用人组织样品获得的结果。小鼠肾自Ventana Medical Systems, Inc的BMAC部
门新鲜获得。
[0137]将20ml福尔马林(10%NBF)置于50ml锥形管中。将管置于设成30°C、40°C、50°C或60°C的标准VWR加热块中。将小鼠肾切成两半并将3片置于每个锥形管中。在每个温度浸泡10、30和60分钟后取出一片。
[0138]通过将小鼠肾置于室温福尔马林达0、2、6和23小时进行对照。所有样品均在Renaissance 组织处理器(Ventana Medical Systems, Inc.;目录号 V-REN)中处理并包埋在石蜡块中。将切出的载玻片用Gills II苏木精和曙红Y染色用于组织形态学分析。
[0139]O小时和2小时对照组织显示特征性的乙醇固定特性。23小时对照要好得多。固定的量与温度和时间相关。50°C组织接近用23小时对照获得的结果。
[0140]实施例2
[0141]此实施例关注在50°C、60°C、70°C、8(rC和90°C延长的福尔马林热浸泡以确定在形态学或抗原性受损之前能对样品应用多少热。用福尔马林浸泡重复实施例1，但将人扁桃体片浸没到加热至50°C、60°C、70°C、8(TC和90°C的10%NBF中。如下文例示的尝试各个时
间点:
[0142]
【权利要求】
1.一种用于固定组织样品的方法，其包括: a)使所述组织样品与处于第一温度的第一醛溶液接触达第一时间段，该 第一时间段足以使所述溶液扩散到所述组织样品中；并 b)将a)中获得的组织样品的温度快速提高至第二温度，在所述第二温度达第二时间段，其中所述第一温度为约_20°C至约15°C，所述第二温度为约22°C至至少约50°C，而且所述第二时间段足以保存所述组织样品的翻译后修饰信号。
2.依照权利要求1的方法，其中通过将所述组织样品加热至所述第二温度来提高所述组织样品的所述温度。
3.依照权利要求1的方法，其中通过将所述组织样品浸没到处于所述第二温度的第二醛溶液中来提高所述组织样品的所述温度。
4.依照权利要求1-3中任一项的方法，其中所述溶液是醛溶液或水。
5.依照权利要求1的方法，其中所述第一温度从约0°C至约15°C。
6.依照权利要求5的方法，其中所述醛溶液处于从3°C至约5°C的第一温度。
7.依照权利要求1的方法，其中所述第一时间段的范围从约15分钟至长达约4小时。
8.依照权利要求7的方法，其中所述第一时间段的范围从约I小时至约2小时。
9.依照权利要求1的方法，其中所述第二温度为约35°C至约45°C。
10.依照权利要求1的方法，其中所述第二时间段从超过15分钟至长达至少约5小时。
11.依照权利要求10的方法，其中所述第二时间段为约2小时至约3小时。
12.依照权利要求3的方法，其中所述第二醛溶液与所述第一醛溶液相同或与所述第一醛溶液不同。
13.依照权利要求1的方法，其中所述醛是低级烷基醛。
14.依照权利要求13的方法，其中所述醛选自福尔马林、戊二醛及其组合。
15.一种用于固定组织的方法，其包括: 将组织样品浸没到处于超过(TC至约5°C的第一温度的福尔马林溶液中达超过15分钟至长达约4小时的第一时间段；并将所述组织样品浸没到处于超过约22°C的第二温度的福尔马林溶液中达约I小时至约4小时的第二时间段。
16.依照权利要求15的方法，其在将所述组织样品浸没到处于第二温度的福尔马林溶液中后进一步包括一系列醇清洗。
17.依照权利要求16的方法，其进一步包括超过O分钟至长达约30分钟的二甲苯清洗。
18.一种用于固定组织的方法，其包括: 将处于超过O至约5°C的第一温度的福尔马林溶液应用到所述组织样品达超过15分钟至长达约4小时的第一时间段；并 将所述组织样品的温度提高到超过约22°C的第二温度达约I小时至约4小时的第二时间段。
19.依照权利要求1的方法生成的固定的组织样品。
20.依照权利要求1的方法，其中所述方法显著保存所述组织样品的翻译后修饰信号。
21.依照权利要求1的方法，其中所述组织样品是FFPE组织样品。
22.依照权利要求1的方法，其进一步包括在自动检测系统中检测所述固定的组织样品。
【文档编号】G01N1/30GK103518127SQ201280018757
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年2月17日 优先权日:2011年2月17日
【发明者】M.奥特, A.皮尔逊, D.查芬, E.罗伯茨 申请人:文塔纳医疗系统公司