生物聚合物的光学解析装置及方法

生物聚合物的光学解析装置及方法
【专利摘要】本发明涉及生物聚合物的光学解析装置，其具备：生物聚合物的特性解析芯片1100，其具备固体基板1110、设置于固体基板1110的多个纳米孔1120，1121、和配置于固体基板1110的导电性薄膜1130a，1130b，1131a，1131b，导电性薄膜1130a，1130b，1131a，1131b的至少一部分面向纳米孔1120，1121而设置；光源和照射光学系统，其用于产生进入到纳米孔1120，1121中的生物聚合物的拉曼散射光；检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在特定的波长范围内以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器，将外部光从上述光源和照射光学系统照射到特性解析芯片1100，在上述检测装置中检测解析芯片1100中的生物聚合物的拉曼散射光，由其检测结果解析构成生物聚合物的单体单元的特性。
【专利说明】生物聚合物的光学解析装置及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用开有纳米尺寸的孔的薄膜状的器件来解析生物聚合物的特性的装置以及方法，特别是涉及在薄膜上形成近场，不标记DNA、RNA等核酸而进行光学检测从而进行序列解析的器件的结构、解析装置以及解析方法。
【背景技术】
[0002]作为实现更先进的下一代DNA测序仪的方法，使用纳米孔的技术引起了关注。可认为纳米孔方式的大特点在于，能够不标记DNA、换言之不使用酶、荧光色素等试剂而进行解析。纳米孔根据其形成法大致划分而分类为2种。一种是将形成纳米尺寸的开口(以下称为“纳米孔”)的通道蛋白埋设于双分子膜的所谓的生物纳米孔，另一种是对半导体材料实施微细加工而形成纳米孔的所谓的固态纳米孔。
[0003]另外，作为这样的使用纳米孔的DNA的解析法，目前提出了二种方法。第I方法是阻塞电流方式。即，在形成有纳米孔的薄膜的两侧设置液槽，在各个液槽中设置电解质溶液和电极，对电极间施加电压时，则电流穿过纳米孔而流动。电流的大小以一次近似方式与纳米孔的截面积成比例。DNA通过纳米孔时，则DNA阻塞纳米孔，有效截面积减少，因此电流减少。将该减少量称为阻塞电流。以阻塞电流的大小为基础，可识别DNA的单链与双链的差异。另外报告了在生物孔的一个形态中，可根据阻塞电流的大小而辨别DNA的碱基的种类(非专利文献1，以下亦称为“第I现有例”)。但是可认为用于生物孔的双分子膜是有机低分子以弱的力而聚集形成的微细的薄膜，在机械稳定性方面存在问题。另外由于通道蛋白质向双分子膜组入的工序依赖于自然现象，因此在通道的数量的控制、重现性方面存在问题。另一方面可认为，由于固态纳米孔使用半导体基板等作为薄膜，从结构的稳定性的观点考虑比生物孔有利。另外由于机械性地形成纳米孔，因而也具有可实现工业化生产这样的优点。另外也报告了除了利用半导体基板以外还利用石墨烯(graphene)来作为薄膜材料，对通过设置于其中的固态纳米孔的生物分子进行分析的装置以及方法(专利文献I)。然而在固态纳米孔方面没有报告过成功基于阻塞电流而识别DNA的碱基的种类。
[0004]第2方法是隧道电流方式。即，提出了如下方式:将电极对面向纳米孔而相对地设置，对电极间施加电压，测定通过纳米孔的DNA与电极之间的隧道电流，根据隧道电流的大小对DNA进行解析。作为关联技术，存在有如下报告:使用扫描探针显微镜，将对糖进行了修饰的核苷溶解于有机溶剂而导入纳米间距电极间，计量隧道电流时，则隧道电流的平均值因碱基的种类而不同(非专利文献2，以下亦称为“第2现有例”)。然而试样是核苷(不具有磷酸)而不是链状的核酸，存在有需要对试样进行修饰、需要将试样溶解于有机溶剂、没有使用纳米孔等实验条件上的制约，除此以外，隧道电流存在有分布，在碱基的种类之间存在有重叠，因此也存在有碱基识别的能力低这样的课题。
[0005]另一方面，作为不标记单分子的核酸而计量的其它方法，报告了 TERS(TipEnhanced Raman Scattering,针尖增强拉曼散射)法(非专利文献3,以下亦称为“第3现有例”)。在此方法中，在AFM(原子力显微镜)的探针的前端形成银，利用AFM扫描固定于云母基板的链状核酸分子而取得核酸分子的AFM像，然后使探针接近于核酸，照射激光。于是，在探针前端形成局部性的光的增强场(近场)，将核酸激发。对激发后的核酸所发出的拉曼散射光进行分光计量，从而取得核酸的拉曼散射光谱。所获得的信号的S/N大于近场中所含的核酸碱基的数，因此可获得能够对单个碱基进行计量的灵敏度。另外拉曼散射光谱具有相对于波数的强度图案这样的二维信息，因此具有与阻塞电流、隧道电流等一维信息相比信息量飞跃性地增多、定性上的识别能力高这样的特点。近场的大小由探针前端的曲率确定，该第3现有例的空间分辨率为约IOnm的级别。将其换算为核酸的碱基数而相当于约30碱基部分的长度，因此在由该方法获得的结果中大量的碱基的信息发生重复。为了从重复的信息算出各个碱基的信息，例如提出了反复进行如下操作而求出序列信息的方法，所述操作为:使探针沿着核酸的链进行扫描，根据拉曼散射光谱的变化(差分)而推测进入到近场中的碱基和从近场出来的碱基(以下记作“差分法”)。为了实施该方法，需要预先将核酸固定于固体基板，另外在计量中需要包含高分辨率的微动工作台的AFM装置，需要以亚nm的精度将AFM的探针进行三维扫描这样的微细的操作。即，存在有装置构成、操作复杂这样的课题。
[0006]此外，例如在使用具有多个纳米孔的器件(多纳米孔)来同时解析多个DNA的碱基序列的情况下，需要同时检测从多个纳米孔产生的信号。例如报告了，使用与4个碱基对应的2色荧光的组合而将靶标DNA转换为荧光标记寡核苷酸，在纳米孔阵列中分析荧光标记寡核苷酸，基于产生的2色荧光信号来确定靶标DNA的碱基序列的方法(非专利文献4)。该方法中，需要将靶标DNA转换为分析用的寡核苷酸的操作，此外使用荧光，因此费用
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[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:国际公开W02009/035647号
[0010]非专利文献
[0011 ]非专利文献 1: Clarke, J.et al., Nat.Nanotech.第 4 卷第 265-270 页,2009 年
[0012]非专利文献2: Chang, S.et al.，Nano Lett.第 10 卷第 1070-1075 页，2010 年
[0013]非专利文献3:Bailo, E.et al., Angew.Chem.1nt.Ed.第 47 卷第 1658-1661页，2008年
[0014]非专利文献4:McNally, B.et al.，Nano Lett.第 10 卷第 2237-2244 页，2010 年
【发明内容】

[0015]发明要解决的问题
[0016]利用生物孔根据阻塞电流对生物聚合物进行解析的方法(第I现有例)的机械稳定性低，难以稳定地获得具有重现性的结果。另外利用纳米孔根据隧道电流对生物聚合物进行解析的方法(第2现有例)的碱基的识别能力低，难以高精度地读取核酸的碱基序列。利用TERS对生物聚合物进行解析的方法(第3现有例)的装置构成复杂，需要微细的操作。此外，现有例中存在多个纳米孔的测定等多个试样的同时测定困难这样的课题。
[0017]因此，本发明的课题是，提供机械稳定性优异、以高空间分辨率和灵敏度并且以简单的装置构成，用于解析生物聚合物的特性的装置以及方法。此外，本发明的课题在于，提供同时地检测即高通量、高精度地检测由多个纳米孔产生的信号的装置以及方法。
[0018]用于解决课题的方法
[0019]本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在固体纳米孔中，通过在基板上以适当的配置设置适当的导电性薄膜，或通过在固体基板上设置流路，从而可以提高基于拉曼散射来解析进入到纳米孔或流路中的生物聚合物的特性时的空间分辨率，而且可以改善灵敏度。此外发现，在检测拉曼散射光时，将拉曼散射光在各波长以不同的比率进行分割，将分割出的光用具有多个检测像素的检测器检测，计算出分割出的对应的图像位置的强度的比率，从而可以以高通量检测由多个纳米孔产生的信号，可以由计算出的比率解析生物聚合物的特性。本发明是基于这些认识而完成的，具体而言，包含以下方案。
[0020][I], 一种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备:
[0021]生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、设置于该固体基板的多个纳米孔、和配置于该固体基板的导电性薄膜，该导电性薄膜的至少一部分面向该纳米孔而设置，
[0022]光源和照射光学系统，其用于产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和
[0023]检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在特定的波长范围内以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器，
[0024]外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
[0025][2], 一种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备:
[0026]生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、设置于该固体基板的多个纳米孔、和配置于该固体基板的导电性薄膜，该导电性薄膜的至少一部分面向该纳米孔而设置，
[0027]光源和照射光学系统，其用于产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和
[0028]检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在每个指定的波长带以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器，
[0029]外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
[0030][3],根据[I]或[2]所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述生物聚合物由至少4种单体构成，所述分离部对构成该生物聚合物的每种单体以透射光与反射光的强度比至少区分成4种的不同比率来分割光。
[0031][4],根据[I]?[3]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，通过向所述导电性薄膜照射所述外部光，从而所述导电性薄膜在面向所述纳米孔的开口部的端部产生近场，产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光。
[0032][5],根据[I]?[4]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜具有锐角的端部，该锐角的端部面向所述纳米孔的开口部而配置。
[0033][6],根据[I]?[5]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述特性解析芯片每I个纳米孔具备至少2张导电性薄膜，该至少2张导电性薄膜夹着所述纳米孔的开口部而相互相对地配置。
[0034][7],根据[I]?[6]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜由金属形成。
[0035][8],根据[I]?[6]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜由石墨形成。
[0036][8-2].根据[8]所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，石墨是石墨烯。
[0037][9],根据[I]?[8]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜的厚度为0.1nm?10nm。
[0038][9-2].根据[I]?[9]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述固体基板具有实质上透射光的薄膜部分，在该薄膜部分设置有纳米孔。
[0039][9-3].根据[I]?[9]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，在所述固体基板的表面配置有所述导电性薄膜。
[0040][10].根据[I]?[9]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，在所述固体基板的所述纳米孔的中心轴方向的中间深度配置有所述导电性薄膜。
[0041][11].根据[I]?[10]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述纳米孔的深度为构成生物聚合物的单体单元的3倍以上的大小。
[0042][12].根据[I]?[11]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，还具备数据处理部，其由在所述检测装置中被检测到的拉曼散射光的光强度之比来解析生物聚合物的特性。
[0043][13].根据[I]?[12]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，还具备试样移动机构，其使生物聚合物中的单体逐个单元地进入到所述纳米孔中。
[0044][14].根据[I]?[13]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、和适体所组成的组。
[0045][15].根据[I]?[14]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，所述生物聚合物的特性解析为核酸的碱基序列的确定。
[0046][15-2].根据[I]?[15]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，还具备记录来自所述检测装置的计量值的帧缓冲存储器。
[0047][16].—种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备:
[0048]生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、和配置于该固体基板表面的多对导电性薄膜，成对的该导电性薄膜以一定间隔相对地配置，
[0049]光源和照射光学系统，其用于产生生物聚合物的拉曼散射光，
[0050]检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在每个指定的波长带以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器，
[0051]外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
[0052][17].—种生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，包括下述工序:
[0053]在[I]?[16]的任一项所述的生物聚合物的光学解析装置中，向特性解析芯片照射外部光，产生进入到纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光的工序，[0054]在检测装置中检测所述拉曼散射光的工序，和
[0055]基于所述拉曼散射光的检测结果来解析生物聚合物的特性的工序。
[0056][18].根据[17]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、和适体所组成的组。
[0057][19].根据[17]或[18]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，确定核酸的碱基序列。
[0058][19-2].根据[17]?[19]的任一项所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，所述生物聚合物存在于包含不能进入到所述纳米孔中的第2聚合物的试料溶液中。
[0059][19-3].根据[17]?[19]的任一项所述的生物聚合物的特性解析方法，其将所述拉曼散射光的透射光和反射光的强度比与基准或对照进行比较，鉴定构成生体聚合物的单体的种类。
[0060]发明的效果
[0061]根据本发明，可以提供生物聚合物的光学解析装置以及解析方法。本发明的解析装置，由于基于固体纳米孔方式，因此结构的稳定性高，可靠性高，而且通过拉曼散射可以二维地以高空间分辨率并且高灵敏度解析生物聚合物的特性。此外，在二维地配置而成的多个纳米孔中可以同时解析多个生物聚合物，因此本发明的解析装置和解析方法简便并且
高通量。
【专利附图】

【附图说明】
[0062]图1是生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的示意图。
[0063]图2是纳米孔芯片的截面的示意放大图。
[0064]图3是生物聚合物的光学解析装置的构成概略图。
[0065]图4是显示试样单元的构成概略的截面图。
[0066]图5是显示具有锐角的三角形状的金属薄膜的结构的示意图(A)，和显示在该金属薄膜的附近产生的近场的模拟结果(B)。
[0067]图6是显示2个三角形状的金属薄膜的结构的示意图(A)，和显示在这些金属薄膜的附近产生的近场的模拟结果(B)。
[0068]图7显示核酸碱基的典型的拉曼散射光谱。
[0069]图8显示实施例6中检测到的2分割像(透射光和反射光)的光谱分布(A和B)、和每个碱基种类的比率计算结果(C)。
[0070]图9是生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的变形例的示意图。
[0071]图10是纳米孔芯片的变形例的截面的示意放大图。
[0072]图11是实施例2的多纳米孔芯片的示意图。
[0073]图12是使用了多纳米孔芯片的生物聚合物的光学解析装置的构成概略图。
[0074]图13是实施例3的纳米孔芯片的截面的示意放大图。
[0075]图14是实施例4的纳米孔芯片的示意图。
[0076]图15是实施例5的纳米孔芯片的示意图。
[0077]图16是实施例5的纳米孔芯片的截面的示意放大图。
[0078]图17是实施例6的检测装置的构成概略图。[0079]图18是实施例6中的滤波器和反射镜的特性图。
[0080]图19显示实施例6中的其它分色镜的例子(示意图)。
[0081]图20是实施例7的检测装置的构成概略图。
[0082]图21是具备具有突起状结构的流路的特性解析芯片的构成概略图。
[0083]图22是显示试样单元的构成概略的截面图。
[0084]图23是具备具有突起状结构的流路的特性解析芯片的变形例的构成概略图。
[0085]图24是具备具有一列金属纳米粒子的流路的特性解析芯片的构成概略图。
[0086]图25是具备具有一列金属纳米结构体的流路的特性解析芯片的构成概略图。
[0087]图26是具备具有多列金属纳米粒子的流路的特性解析芯片的构成概略图。
[0088]图27是具备具有多列金属纳米结构体的流路的特性解析芯片的构成概略图。
【具体实施方式】
[0089]以下，详细地说明本发明。本申请主张于2011年6月3日申请的日本专利申请第2011-124871号的优先权，并包含上述专利申请的说明书和/或附图所记载的内容。
[0090]本发明涉及下述生物聚合物的光学解析装置、以及使用该解析装置来解析生物聚合物的特性的方法，所述生物聚合物的光学解析装置具备:用于利用纳米孔和拉曼散射(优选为针尖增强拉曼散射:TERS)来解析生物聚合物的特性的器件(生物聚合物的特性解析芯片)、用于产生拉曼散射光的光源和照射光学系统、和用于检测拉曼散射光的检测装置。本发明的解析装置中，外部光从光源和照射光学系统照射到特性解析芯片，通过检测装置检测在该解析芯片中产生的生物聚合物的拉曼散射光。
[0091]首先，对生物聚合物的特性解析芯片(以下，也称为“解析芯片”)进行说明。解析芯片具备固体基板、设置于上述固体基板的至少I个纳米孔、和配置于上述固体基板的至少I张导电性薄膜。
[0092]或者，生物聚合物的特性解析芯片可以具备固体基板、和设置于上述固体基板的至少一个流路。
[0093]固体基板可由电绝缘体的材料例如无机材料以及有机材料(包括高分子材料)形成。作为电绝缘体材料的例子，列举出硅、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯。固体基板的尺寸以及厚度如果可设置纳米孔则没有特别限定，按照与后述的生物聚合物的解析时使用的解析装置的构成要素(检测器等)适合的方式调整。固体基板可以通过本【技术领域】的公知方法而制作，或者也可以以市售品的方式获取。例如，固体基板可通过使用光刻以及蚀刻、激光烧蚀、注射成型、铸造、分子束外延、化学蒸镀(CVD)、电子射线或会聚离子束等技术而制作。固体基板也可为了避免其它的分子向表面的吸附而进行涂布。
[0094]固体基板优选具有用于设置纳米孔或流路的薄膜部分。即，将适于形成纳米尺寸的孔或流路的材料及厚度的薄膜部分设置于固体基板，从而可简便且有效率地将纳米孔或流路形成于固体基板上。这样的薄膜部分可以为与固体基板相同的材料，或者也可由其它的电绝缘体材料形成。从形成纳米孔或流路的观点考虑，薄膜部分的材料优选为例如氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiN)、氮氧化硅(SiON)、金属氧化物、金属硅酸盐等。另外，从后述的外部光的激发效率和聚光效率的观点考虑，薄膜部分(以及根据情况为固体基板整体)优选为实质上透明。该处“实质上透明”是指可使外部光的大概50%以上、优选80%以上透射。另外，薄膜部分可以为单层也可以为多层，在多层的情况下，后述的导电性薄膜也可夹于薄膜部分的层而配置。固体基板的薄膜部分的厚度为IOnm?200nm,优选为15nm?IOOnm,更优选为20nm?50nm。薄膜部分可通过本【技术领域】中公知的技术,例如通过减压化学气相沉积(LPCVD)，从而形成于固体基板上。
[0095]在固体基板设置至少I个纳米孔，优选设置2个以上纳米孔。在本发明中“纳米孔”以及“孔”是纳米(nm)尺寸的孔，并且是贯通固体基板的表里的孔、优选是贯通固体基板的薄膜部分的表里的孔。即，本发明中使用的解析芯片被划分到所谓的固态纳米孔。另外在本发明中“开口”是指孔出去到固体基板表面的部分。在生物聚合物的特性解析时，试样溶液中的生物聚合物、离子等从一侧的开口进入纳米孔，从相同或相反侧的开口露出于纳米孔外。
[0096]孔的尺寸(即开口尺寸)可根据解析对象的生物聚合物的种类而选择恰当的尺寸，例如为Inm?IOOnm,优选为Inm?50nm,具体为Inm以上2nm以下,3nm以上5nm以下，IOnm以上50nm以下等等。ssDNA(单链DNA)的直径为约1.5nm,用于对ssDNA进行解析的孔径的恰当的范围为1.5nm?IOnm左右，优选为1.5nm?2.5nm左右。dsDNA(双链DNA)的直径为约2.6nm，用于对dsDNA进行解析的孔的直径的恰当的范围为3nm?IOnm左右，优选为3nm?5nm左右。以其它的生物聚合物例如蛋白质、糖链等为解析对象的情况下也可同样地选择对应于生物聚合物的外径尺寸的孔径。纳米孔的深度可通过调整固体基板或固体基板的薄膜部分的厚度而调整。纳米孔的深度为构成生物聚合物的单体单元的2倍以上的大小，优选为3倍以上的大小,更优选为5倍以上的大小。例如在选择核酸作为生物聚合物的情况下，纳米孔的深度优选为碱基3个以上的大小，例如约Inm以上。由此，可一边控制生物聚合物的形状和移动速度一边使其进入纳米孔，可实现高灵敏度以及高精度的解析。另外孔的形状基本上为圆形，但是也可为椭圆形、多边形。
[0097]可在固体基板上设置至少一个孔，在设置多个孔的情况下，优选规则性地排列。配置多个孔的间隔根据所使用的检测器、聚光系统、分离部的能力，可以为0.1 μ m?10 μ m，优选为0.5 μ m?4 μ m。孔可通过本【技术领域】的公知方法，例如通过照射透射型电子显微镜(TEM)的电子束，通过使用纳米光刻技术或离子束刻蚀技术等，从而形成于固体基板。
[0098]在固体基板上配置至少I张导电性薄膜。导电性薄膜可由具有导电性或光散射特性的材料形成。作为这样的材料，列举出金属例如钼、钯、铑、钌等钼族，金、银、铜、铝、镍等；石墨例如石墨烯(可以是单层或多层中的任一个)等。
[0099]导电性薄膜的厚度根据采用的材料为0.1nm?IOnm,优选为0.1nm?7nm。导电性薄膜的厚度越小，则越可对所产生的近场进行限定，可实现高分辨率且高灵敏度的解析。另外导电性薄膜的尺寸没有特别限定，可根据所使用的固体基板以及纳米孔的尺寸、所使用的激发光的波长等来适当选择。
[0100]关于导电性薄膜的形状，如果是可通过照射外部光而产生并且增强近场的形状，那么可制成任意的形状。这样的产生近场的探针在本【技术领域】中是公知的，例如已知:具有可通过针尖增强拉曼散射(TERS)而产生以及增强近场的锐角的端部的形状、金属领结结构等。
[0101]在导电性薄膜为具有锐角的端部的形状的情况下，该端部的角度为10?80度，优选为20?60度、更优选为20?40度。关于这样的用于形成近场光的导电性薄膜(光散射体)的优选的形状，想参照例如日本特开2009-150899号公报。另外，导电性薄膜的端部的顶点部分也可以不是严密的意义上的点，也可以是带有具有一定值以下、优选为IOnm以下的曲率半径的圆形的形状等。锐角的端部以外的导电性薄膜的形状没有特别限定，在无角的圆形、有角的情况下，只要与端部的顶点的角度相比为钝角，则可以自由地选择。另外导电性薄膜的整体形状只要具有锐角的端部，就可制成任意的形状，可制成三角形、四边形以及五边形等多边形、扇形、圆形和三角形的合成形等。
[0102]另一方面，也可采用金属领结(bow-tie)结构作为导电性薄膜的形状。即，将圆形、椭圆形或多边形的2张导电性薄膜按照其形状的凸部相互相对的方式配置。关于这样的金属领结结构，想参照例如美国专利第6，649，894号。金属领结结构也可视为在形成近场的区域插入了间隙(开口)的结构。通过插入间隙而导入各向异性，使检测灵敏度得到改善。关于对这样的技术的说明，想参照例如美国专利第6，768，556号以及美国专利第6，949，732 号。
[0103]关于导电性薄膜，只要其至少一部分面向纳米孔而设置，就可配置于固体基板的表面上，或者也可配置于固体基板之间。例如，可在固体基板的表面上面向纳米孔的开口部而配置。或者，可在固体基板上的纳米孔的中心轴方向上的大致中间的位置(深度)配置导电性薄膜。在此情况下，导电性薄膜优选为由固体基板的薄膜部分夹着的结构。由此，近场是在纳米孔的中心轴方向(深度方向)的中间附近形成，因此可一边控制生物聚合物的形状和移动速度一边在纳米孔内产生生物聚合物的拉曼散射光，可高精度以及高灵敏度地进行解析。另外，在将导电性薄膜配置于固体基板的情况下，优选考虑照射的外部光的偏光方向而配置。
[0104]另外，导电性薄膜相对于各纳米孔配置至少一张即可，可以是奇数也可以是偶数。例如，导电性薄膜可相对于各纳米孔而配置I张、2张、3张、4张或其以上。如后述的实施例中记载那样，存在多张导电性薄膜时，则形成强的光的部位，因此优选相对于各纳米孔配置2张以上导电性薄膜。或者，以上述的形状为I单元，导电性薄膜也可制成具有多个单元的I张薄膜。关于具体的例子，可制成实施例5那样的连结着2个单元的薄膜结构物。
[0105]关于导电性薄膜，优选将其端部面向纳米孔的开口部而配置。更具体而言，将导电性薄膜配置于正交于纳米孔中心轴的面内，且将薄膜的端部面向纳米孔的开口部而配置。另外在配置至少2张导电性薄膜的情况下，优选使这些导电性薄膜夹着纳米孔的开口部而相互相对而配置。在这样的情况下，将外部光照射于导电性薄膜，从而在导电性薄膜面向纳米孔的端部产生近场，产生进入纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
[0106]导电性薄膜可通过本【技术领域】的公知方法而制作，配置于固体基板。例如，由银形成导电性薄膜的情况下，可通过溅射将所希望的厚度的银薄膜形成于基板，然后通过电子束而形成所希望的形状。另外由单层的石墨烯形成导电性薄膜的情况下，可通过将由石墨制作的石墨烯放置于支撑基板，照射电子束而形成希望的形状的石墨烯。
[0107]通过对上述的解析芯片照射外部光，从而可将进入到上述纳米孔中的生物聚合物激发而产生拉曼散射光，基于该拉曼散射光的检测结果对生物聚合物的特性进行解析。优选的是，通过对解析芯片的导电性薄膜照射外部光，从而在该导电性薄膜面向纳米孔的开口部的端部形成近场，利用该近场光对生物聚合物进行二维性的扫描。所形成的近场的厚度基本上与导电性薄膜的厚度同等、即，导电性薄膜正交于纳米孔的中心轴，因而所形成的近场的中心轴方向的厚度与导电性薄膜的厚度为同等程度。因此，通过使用上述的解析芯片，可以以高空间分辨率且高灵敏度对生物聚合物进行解析。
[0108]此外，代替纳米孔，而在成对配置的导电性薄膜之间，即在流路中导入生物聚合物，使其沿着固体表面移动，从而可以检测生物聚合物的拉曼散射光。形成流路的导电性薄膜对可以导入生物聚合物，并且优选以适合于拉曼散射的间隔配置。流路优选由导电性薄膜形成，但也可以由其它材质形成。此外，流路的宽度、形状等，考虑解析对象的生物聚合物的种类和大小、产生的近场等，只要是本领域技术人员，就能够适宜设计。
[0109]一实施方式中，在流路的至少I处形成具有尖锐端的突起形状。关于突起形状，只要是可以产生近场的形状，则可以以任意的数目和位置、任意的形状来形成。例如，可以与纳米孔相关地形成上述的导电性薄膜的形状。作为一例，突起形状，可以相对于流路的行进方向，在流路的2个壁面中的任一个上形成，或者相对于流路的行进方向从流路的2个壁面相对地形成。
[0110]其它实施方式中，在流路的至少I处，横断流路地固定有I列以上金属纳米粒子或金属纳米结构体。金属纳米粒子或金属纳米结构体，只要是可以产生近场，则可以以任意的数目和位置，以任意的形状和材质形成。
[0111]通过向上述解析芯片照射外部光，从而进入到上述流路中的生物聚合物被激发而产生拉曼散射光，可以基于该拉曼散射光的检测结果来解析生物聚合物的特性。优选地，向解析芯片的流路中的突起形状、金属纳米粒子或金属纳米结构体的部分照射外部光，从而在该部分产生近场，使用该近场而产生拉曼散射，二维地扫描生物聚合物。所形成的近场的厚度基本上与流路的厚度同等。因此，通过使用上述解析芯片，从而可以以高空间分辨率并且高灵敏度，而且以高的S/N比，来解析生物聚合物。
[0112]接下来，对用于产生拉曼散射光的光源和照射光学系统进行说明。
[0113]光源可以使用照射可以产生拉曼散射光的波长的外部光(激发光)的本【技术领域】中公知的光源。作为光源，例如，没有限定，但可以使用氪(Kr)离子激光器、钕(Nd)激光器、氩(Ar)离子激光器、YAG激光器、氮激光器、蓝宝石激光器等，照射波长约400?900nm的外部光。所产生的拉曼散射光是由通常的拉曼散射、共振拉曼散射、针尖增强拉曼散射(TERS)、表面增强拉曼散射(SERS)等产生的光。
[0114]此外，为了从光源向解析芯片照射外部光并进行收束，优选使用与光源组合，具备透镜(透镜和物镜)、反射镜(半透明反射镜、分色镜等)、扩束器、ND滤波器的照射光学系统。关于照射光学系统，为了使背景信号(background signal)降低,可以与滤波器(带通干涉滤波器等)或滤波器组件、共焦针孔、遮光板、吸收端等组合。这样的用于产生拉曼散射光的装置构成在本【技术领域】中是公知的，只要是本领域技术人员，就可以选择适宜优选的构成要素。
[0115]接着对检测装置进行说明。检测装置具备:阻断激发光的滤波器、拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在特定的波长范围内以不同的反射率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器。
[0116]作为拉曼散射的聚光系统，可以使用I个或多个物镜、和/或I个或多个反射镜。根据需要，可以具备I个或多个滤波器。关于分离部，只要是根据波长而以不同的比率(反射率)将光分割成透射光和反射光，就没有特别限定。可以遍及特定的波长范围的整个区域，全部以不同的比率进行分割。例如，可以使用分色镜、或具有同样特性的其它镜。分色镜的特性的一例如图18(B)所示，越是高的波数的光，以越高的比率使光透射(或反射)。此外，其它镜的特性的一例如图19所示，以每个特征性拉曼散射峰的波数成阶梯状变化的比率使光透射(或反射)。优选地，关于上述分离器，构成生物聚合物的单体的每个种类，透射光与反射光的强度比可以仅区分成至少该种类的数目(例如至少4种)的方式，在特定的波长范围内以不同的比率分割光。
[0117]关于成像光学系统，只要是可以在所使用的二维检测器中成像光，则没有特别限定，可以使用例如I个或多个成像透镜(aromatic lens ( 7口774'7夕>>:^)等)。
[0118]二维检测器可以将成像后的光学像转换成电信号而作为二维的图像输出。此外根据使用的解析芯片中的纳米孔的数目和配置、流路的形状，可以使用I个或多个二维检测器。作为这样的二维检测器，可举出CCD(电荷耦合元件)区域传感器、CMOS(互补型金属氧化膜半导体)区域传感器、其它高灵敏度元件的区域传感器等。所使用的二维检测器可以为适当的像素尺寸和像素数，此外对其形式(背面照射型、正面照射型等)也没有特别限定。优选地，二维检测器，具有分别检测以不同的比率分割而成的透射光和反射光的像素。关于二维检测器，为了防止伴随检测的高速化的灵敏度降低，优选使用光电倍增机构，例如具有图像增强器、或在元件内部具有信号的倍增功能的电子倍增型CCD照像机(EM-CCD)等。此外，如果二维检测器的帧率(运作速度)为IkHz以上，则特别优选。
[0119]另外，检测装置优选具备可直接记录拉曼散射光的图像信息的大容量存储器，由此可不介由电缆、板(board)、电脑等而高速地进行解析。例如，本发明的解析装置优选进一步具备记录来自检测装置的计量值的帧缓冲存储器。另外，本发明的解析装置也可与用于将来自上述检测装置的计量值进行数字化并输出的输出装置(例如电脑、监视器)连接。
[0120]如上所述，检测装置中，拉曼散射光通过聚光系统被聚光，在分离部中例如在各波长以不同的反射率分割成透 射光和反射光，分割出的光被成像而用二维检测器检测。这样的检测装置的构成和运作方法在例如国际公开W02010/150468号和US2012/097864A1中记载。本说明书的实施例中，将这样的检测装置称为“2分割比率分光检测装置”。
[0121]在本发明中，不使拉曼散射波长分散，作为2个分割出的二维像而计量，因此可以同时检测来自二维地高密度地配置的多个纳米孔或流路的拉曼散射光，能够高通量地解析通过多个纳米孔或流路的生物聚合物。
[0122]本发明的解析装置优选还具备数据处理部，其由在检测装置中被检测到的拉曼散射光的光强度之比来解析生物聚合物的特性。这样的数据处理部为例如计算机组件。
[0123]另外本发明的解析装置优选具备试样移动机构，即，可控制生物聚合物的移动速度的机构。试样移动机构例如在预定的时机使生物聚合物中的单体逐一单元地进入到解析芯片的纳米孔或流路中。作为这样的机构，可使用例如通过电泳驱动生物聚合物的试样驱动装置(任意函数发生器、电极等)。利用这样的试样移动机构，从而可按照生物聚合物中的单体依次地进入到纳米孔或流路中并脱离的方式控制生物聚合物的移动，可随着时间经过而检测对应于各个单体(结构单元)的拉曼散射光。
[0124]另外，作为控制生物聚合物的移动速度的方法，存在有提高包含生物聚合物的试样溶液的粘性的方法。例如通过控制解析芯片周围的温度，降低试样溶液的温度，使试样溶液的粘性变高，从而可抑制生物聚合物的布朗运动。或者，向试样溶液中添加除了测定对象以外的第2聚合物，从而可提高试样溶液的粘性，同时可使生物聚合物的立体结构为直链状，因此可控制生物聚合物的形状和移动速度。此时，作为第2聚合物，优选使用大于纳米孔的内径或流路的宽度的尺寸的聚合物，更优选使用三维地交联而得到的聚合物，从而使第2聚合物无法进入到纳米孔中，可排除由不是测定对象的第2聚合物引起的拉曼散射。
[0125]控制生物聚合物的移动速度的其它的方法为:对存在于解析芯片的上部和下部或流路的各个试样溶液施加压力差的方法。将与生物聚合物利用电泳而要通过纳米孔或流路的力相反的方向的力施加于生物聚合物，从而可降低生物聚合物通过纳米孔或流路的速度。
[0126]通过一边控制生物聚合物的形状和/或移动速度一边进入到解析芯片的纳米孔或流路，从而使生物聚合物的主轴与纳米孔或流路的中心轴大致一致。通过试样移动机构驱动生物聚合物，从而使生物聚合物通过纳米孔或流路，使构成生物聚合物的单元要素(单体)依次通过解析芯片中形成的近场。即，沿着聚合物的主轴方向而排列的单体依次暴露于近场，吸收光，产生拉曼散射光。通过利用检测装置检测和计量该拉曼散射光，从而依次获得来源于单体的拉曼散射光的信息。
[0127]在本发明中，使用上述的本发明的生物聚合物的光学解析装置，可进行生物聚合物的特性解析。在本发明中“生物聚合物”是指:多个单元结构的低分子(单体、monomer)连结而得到的多聚物(低聚物)、高分子(聚合物)之中，存在于生物体的生物聚合物以及由存在于生物体的生物聚合物衍生的生物聚合物。具体包括:核酸，例如单链DNA(ssDNA)以及双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)以及双链RNA(dsRNA)、包含DNA和RNA的杂交核酸等；肽核酸；蛋白质以及肽，例如由D-以及L-氨基酸形成的蛋白质以及肽；糖链，例如多糖、糖蛋白质中的糖链；适体，例如RNA适体等。另外，生物聚合物中包括包含自然中不存在的序列、构成要素的聚合物，例如也包括具有聚㈧、聚⑴、聚(G)、聚(C)等序列或任意的序列的人为地合成出的聚合物分子。另外，生物聚合物中也包括:由本【技术领域】中公知的核酸扩增技术(例如聚合酶链式反应)制备出的核酸、载体中克隆的核酸。包含这些生物聚合物的试样的制备方法在本【技术领域】中是周知的，本领域技术人员可根据生物聚合物的种类适当选择制备方法。
[0128]在本发明中所谓“解析”，是指生物聚合物的特性解析。在优选的实施方式中，所谓“解析”，是指解析作为构成生物聚合物的单元的单体的序列顺序，例如解析核酸的碱基序列。为了进行生物聚合物的特性解析，检测构成生物聚合物的每个单体(在生物聚合物为核酸的情况下为碱基)的拉曼散射光，基于其检测结果，进行单体的定性(识别)。
[0129]拉曼散射光，通过上述的检测装置，在每个波长以不同的比率分割成透射光和反射光，透射光强度与反射光强度在二维检测器中作为二维像而被检测到。可以由该拉曼散射光的光强度之比来解析生物聚合物的特性，即进行构成生物聚合物的单体的定性。因此，本发明中，依次获得构成生物聚合物的单体的拉曼散射光，将所获得的拉曼散射光的检测结果与(基准)标准比较，判定单体的定性(即种类)，通过时间序列地依次实行这些工序，从而可进行序列解析，即，确定生物聚合物中单体排列的顺序。
[0130]实施例
[0131]以下，通过实施例以及附图来更具体地说明本发明。但是，以下的实施例并非对本发明进行限定。
[0132][实施例1]单孔构成的纳米孔芯片和使用了该纳米孔芯片而进行的生物聚合物的特性解析
[0133]使用图1说明本发明的生物聚合物的特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图1为纳米孔芯片100的示意图。如图示那样纳米孔芯片100由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130等构成。如图示那样，将与基板110的最宽广的面(以下基板面)平行的平面定义为xy面，将导电性薄膜130和纳米孔120连结的方向定义为χ轴，将与xy面垂直的方向定义为z轴。纳米孔120与基板面大致垂直地形成，换言之纳米孔的中心轴与z轴平行。
[0134]图2为本实施例的纳米孔芯片100的包含纳米孔120的中心轴121的xz截面的示意放大图。基板110在Z轴上方的基板面具有薄膜部分111，进一步在其上方具有导电性薄膜130。另外基板在z轴下方具有锥体状的洼部(以下称为“窗部112”)，在该处基板的薄膜部分111露出。在该窗部112的薄膜部分111形成纳米孔120。如图示那样，导电性薄膜130的I个端部131面向纳米孔120的开口部的上端。如图1中略记那样，该端部131的平面形状为尖锐端，该尖锐端面向纳米孔120。
[0135]下面使用图3说明本发明的生物聚合物的光学解析装置的构成的一个例子。图3为本实施例的生物聚合物的光学解析装置200的构成概略图。解析装置200由光源210、括束器220、分色镜230、物镜240、滤波器250、2分割比率分光检测装置260 (详细内容记载于实施例6以及7中)、终端270、xyz微动工作台600、试样驱动装置700、试样单元300、个人电脑等计量控制装置(没有图示)等构成。在试样单元300中收纳纳米孔芯片100。
[0136]图4所示为试样单元300的构成概略的xz截面图。试样单元300由纳米孔芯片100、上部部件310、下部部件320、螺丝类(没有图示)等构成。下部部件320在其内部形成O-环330、试样用流路410、420、430、试样用腔室440、电极用腔室450，另外形成试样用连接端口 460、470、电极用连接端口 480。在下部部件320中介由试样用连接端口 460、470而气密性连接试样送液管(没有图示)，另外介由电极用连接端口 480而气密性连接银氯化银电极(没有图示)。银氯化银电极的具有氯化银的端收纳于电极用腔室450(没有图示)，其具有银的端(以下，银端)露出于电极用连接端口 480的外部。在上述试样送液管、试样用连接端口 460、试样用流路410、试样用腔室440、试样用流路420、电极用腔室450、试样用流路430、试样用连接端口 470、试样送液管中，没有间隙地(没有气泡的混入)充满试样溶液(没有图示)。因此，试样用腔室440内的试样溶液在电极用腔室450中与银氯化银电极接触，两者电化学性地导通。在上部部件310方面也与下部部件320同样。
[0137]下面使用图1至图8说明本发明的纳米孔芯片的运作的概要。首先进行试样单元300的准备。具体而言，在上部部件310与下部部件320之间夹着纳米孔芯片100并且由O-环330压接，气密地形成上部及下部的试样用腔室540以及440。从试样送液管导入IOOmM KCl水溶液作为试样溶液，在试样用腔室540、440、电极用腔室450中装满试样溶液。
[0138]下面将试样单元300设置于解析装置200。具体而言，将试样单元300固定于微动工作台600。使用微动工作台600、未图示的目视用光学系统，从而将光学系统的焦点对准到试样单元300内的纳米孔芯片100的薄膜部分111。将设置于试样单元300的2个银氯化银电极连接于试样驱动装置700。试样驱动装置700内置电压源或电流源，可以以上部试样用腔室540为基准，对下部试样用腔室440施加电压。
[0139]解析装置的光学系统如下运作。具体而言，将从光源210出射的激光通过扩束器220 (或透镜对、光束整形器等)而整形后，利用分色镜230进行反射，利用物镜240，聚光于纳米孔芯片100的薄膜部分111。激光通过薄膜部分111而照射导电性薄膜130，其端部131(面向纳米孔120的开口部)产生强的近场光。如果在形成该近场光的区域(以下称为“近场”)导入生物聚合物，则近场光激发生物聚合物，产生构成生物聚合物的单体所特有的拉曼散射光。将拉曼散射光用物镜240聚光，通过分色镜230，利用滤波器250来除去瑞利散射光和反斯托克斯线，将拉曼散射光中的斯托克斯线入射至2分割比率分光检测装置260，使用2分割比率分光检测装置260(斯托克斯线的)作为强度比的差异而检测拉曼散射光的透射和反射光谱的差异。通过了薄膜部分111、导电性薄膜130的光由终端270向吸收或无关系的方向扩散。
[0140]作为测定对象的生物聚合物的一个例子，DNA的测定顺序如以下那样。即，作为试样，使用了例如将长度IOkb (knt)的单链DNA按照成为InM的浓度的方式溶解于IOOmM KCl水溶液而得到的试样。将其作为下部试样溶液导入试样用腔室440。使用试样驱动装置700对下部试样用腔室440施加IOOmV的负电压时，则穿过纳米孔120，从而试样溶液中的离子发生电泳，电流(离子电流)流动。在近场最初仅存在水和KC1，因此仅观测到水的拉曼散射光。DNA通过电泳从下部试样用腔室440穿过纳米孔120而向上部试样用腔室540电泳。DNA通过纳米孔120时，作为DNA的构成要素的核酸碱基进入到在导电性薄膜130的端部131形成的近场之中。于是，产生该碱基特有的拉曼散射光，通过2分割比率分光检测装置260取得基于其拉曼散射光谱的强度比。继续进行DNA的电泳时，则核酸碱基也移动，脱离到近场之外。于是，该碱基特有的拉曼散射光消失。进一步继续进行泳动时则DNA的序列上的下一个碱基同样地依次进入以及脱离近场，反复进行这样的工序，随着时间经过而取得基于对应碱基的序列的拉曼散射光谱的强度比的变化。为了使每个各碱基成为不同的强度比，随着时间经过地取得其信号，由其时间变化求出DNA的碱基序列。以上是本实施例的运作的概要。
[0141]以下，对各构成要素进行详细说明。
[0142]按照以下的顺序制作出本实施例中的纳米孔芯片100。使用硅基板作为基板110，通过LPCVD (减压化学气相沉积)在其表面形成厚度约20nm的氧化膜(该氧化膜最终成为薄膜部分111)。通过电子束(EB)刻蚀在基板底面形成窗部的图案，通过反应性离子蚀刻而去除表面层，然后通过KOH(氢氧化钾)湿法蚀刻而去除硅，从而形成了具有薄膜部分111的窗部112。作为导电性薄膜130，通过溅射在基板表面上形成了银的薄膜。银的膜厚为约5nm。在银的薄膜之上涂布抗蚀剂，通过EB刻蚀而形成图1所示的三角形样的图案，通过蚀刻去除三角形样图案以外的区域的银，去除了抗蚀剂。最后，用透射型电子显微镜(TEM)观测基板，对三角形的端部131照射TEM的电子束，从而形成了纳米孔120。纳米孔的内径为约10nm。在本实施例中使用氧化硅而形成薄膜部分111，但是也可同样地使用氮化硅等。
[0143]本实施例中作为导电性薄膜130的材料使用了银，但是此材料不限定于银，如果是一般而言具有导电性的材料则可使用任意的材料，一般而言可优选使用金属。作为可用作导电性薄膜的其它的金属，有钼、钯、铑、钌等钼族的金属，金、铜等。
[0144]在本实施例中试样单元300、特别是上部部件310和下部部件320的中央部(将试样用腔室440、540与外部隔开的部分)采用了透明的部件。作为可采用的透明部件，有玻璃、石英、在光源波长中透明度高的丙烯酸类等塑料材料。下部部件320的中央部采用透明的部件，从而可将来源于光源210的激光高效地照射于纳米孔芯片100。另外上部部件310的中央部采用透明的部件，从而通过了纳米孔芯片100的透射光、散射光可没有发生反射地通过，抑制背景光。[0145]在图3和图4中物镜240与试样单元300 (所含的纳米孔芯片100)稍稍离开而图示，但是在实际的装置中优选两者尽量靠近。优选物镜240与纳米孔芯片100的距离为3mm以下，优选为1mm以下地接近。由此，可提高基于激发光的激发效率、散射光的聚光效率，进行高灵敏度的测定。另外物镜240优选使用液浸型。物镜优选为高数值孔径，数值孔径^ 0.8是特别良好的。
[0146]本实施例中的生物聚合物的光学解析装置以与第3现有例同样的显微镜一体型激光器拉曼分光装置为基础而构筑。其中，作为xyz微动工作台600，使用显微镜附带的工作台，没有使用AFM用的压电工作台。在本实施例中使用了输出lmW、波长53Inm的Kr离子激光器作为光源210。作为试样驱动装置700，使用任意函数发生器、根据需要将任意函数发生器与衰减器(电阻分压器)组合而使用。试样驱动装置700可输出输出电压范围为O至±10V的DC、或任意的波形。作为任意波形的典型例，列举出脉冲波，脉冲的峰的时间宽度为10纳秒单位，并且脉冲的峰的电压值也在上述的输出电压范围中，可任意输出。
[0147]以下，对本实施例的运作进行详细说明。
[0148]纳米孔芯片100的基板110主要由硅(Si)形成。基板的厚度为约700 μ m。基板的薄膜部分111由氧化硅(SiO2)形成，厚度也薄至约20nm。因此，基板的窗部112中，激光通过薄膜部分111而照射导电性薄膜130。通过用激光照射导电性薄膜130，从而在其端部131产生强的近场。该近场的z方向的厚度与导电性薄膜130的厚度为同等程度，即5~IOnm左右。
[0149]在窗部112以外，基板110具有约700 μ m厚度。作为基板110的材料的Si将激光吸收、反射、散射，因而激光基本上不到达在窗部112以外的区域之上形成的薄膜部分111、在其上形成的导电性薄膜130。因此，除了该窗部112以外的区域中可抑制导电性薄膜130中的近场的形成。即，通过上述的构成，具有如下特点:可将导电性薄膜130中的近场的形成主要限定于窗部112的区域、特别限定于作为目标的端部131，可抑制除了目标以外的区域中的背景光的产生。
[0150]以下，关于本实施例以及后述的变形例中采用的结构，叙述通过模拟近场的形成进行解析并且比较而得到的结果。
[0151]如本实施例那样使光入射于三角形的导电体时，使用FTDT法(时间区域光传播Solver OptiFDTD, Optiwave System Inc.)计算其附近中产生的近场光分布。在该计算中，将解析区域的尺寸在X、Y、Z各个方向，制成0.3 X 0.2 X 2.6um (另外，X、Y、Z是仅仅图5和图6中使用的坐标系，Y是垂直于XZ平面的方向)。另外导电体的材料设为银，厚度为10nm，前端尖角设为90度。入射波设为波长780nm的平面波，在远离导电体的面一个波长的位置产生了波源(λ=780ηπι)。入射波的偏光方向为X方向。关于边界条件，XY侧面为周期的边界条件，Z方向侧面为吸收边界条件。网孔尺寸在整个计算区域中均匀地为2.6nm。
[0152]图5的A是解析出的结构的示意图。另外，在图5的B中，将近场强度密度(I)的计算结果与入射波的强度密度(Iin)之比的XY平面分布绘制于纵轴。如图示那样在薄膜三角形的前端产生最强的光的部位，其最大值按照入射强度比计为约1100倍。
[0153]另外，在设置2个该三角形的薄膜、使顶点相互隔开3nm而相对的情况下，也进行计算，将其结果示于图6的A和B。这相当于后述的变形例。在此情况下，可获得约7100倍的增强效果。
[0154]总结以上的模拟的结果时，则示出了通过使用如本实施例、特别是如后述的变形例那样的结构以及形状的导电性薄膜，从而形成较强地具有光电场的增强效果的近场。
[0155]DNA刚进入纳米孔120后，在观测到来源于碱基的拉曼散射光的时间点，使用试样驱动装置700，从而可降低施加于下部试样用腔室440的电压的绝对值，可降低DNA的电泳速度。另外，在降低施加电压的绝对值的状态下使电压的极性反转(将下部试样用腔室440设为阳电压)，从而可以以低的速度使DNA链在反方向上泳动。在此条件下，进行泳动直到观测不到来源于碱基的拉曼散射光为止，从而可将DNA链的前端推回至近场之外。从该状态起，在降低施加电压的绝对值的状态下将电压的极性进行归原(将下部试样用腔室440设为阴电压)，从而可从DNA链的先头起慢慢泳动，反复进行拉曼散射计量。由此可以在以充分的精度计量拉曼散射光谱所必需的时间中，将作为测定对象的碱基留在近场之中。
[0156]使用试样驱动装置700,可将施加于下部试样用腔室440的电压设为一定(DC),此外也可设为脉冲波，以短的周期反复进行DNA的泳动和停止。在此情况下，可调节脉冲波的脉冲宽度(脉冲宽度变调)。降低I周期之内的脉冲为ON的时间的比例(占空比)并且提高该OFF的时间的比例，从而可缩短I周期之内的泳动时间并且使该停止时间变长。例如使用频带IOOMHz的任意函数发生器从而以IOns单位使脉冲宽度可变，因此将I周期的长度设为例如IOms的情况下，占空比可以以1/1，000, 000的分辨率进行调节。即，可根据占空比以极其高的分辨率(低)调节DNA链的平均移动速度。另外通过与脉冲高度(pulse-height)的调节(脉冲高变调)组合，也可进一步精密地调节泳动速度。通过控制泳动电压、其脉冲宽度，从而在以充分的精度计量拉曼散射光谱所必需的时间中，可将作为测定对象的碱基留在近场之中。另外，通过在停止时间内取得拉曼散射光谱，从而也可避免因测定对象在计量中进入或脱离近场而导致信号变动的不良情况，也可使计量值高精度化。
[0157]另外，也可使施加于下部试样用腔室440的电压在正压与负压之间周期性地反复。此时，按照通过时间平均而得到的电压为稍稍负压的方式进行调节，从而与将电压简单地设为一定的负压的情况相比，可将DNA链稳定地拉长，且可慢慢地穿过纳米孔120而泳动到上部试样用腔室540，可灵敏度良好地计量基于DNA链中的各个碱基的拉曼散射。
[0158]作为控制DNA链的泳动速度的其它方法，提高试样溶液的粘性是有效的。如果追加控制纳米孔芯片周围的温度的机构，降低试样溶液的温度，则试样溶液的粘性变高，同时可抑制DNA链的布朗运动，因此成为对于DNA链的拉曼散射计量而言良好的条件。另外，向试样溶液中添加除了测定对象以外的聚合物，从而可提高试样溶液的粘性，同时可将DNA链的立体结构制成直链状，因此成为对于DNA链的拉曼散射计量而言良好的条件。作为聚合物，也可使用毛细管电泳用的分离介质。优选使用大于纳米孔的内径、进一步优选三维地交联而得到的聚合物，从而不会妨碍测定，可仅仅提高粘性。特别是根据后述的实施例的图13，可将增强场即计量区域闭入于纳米孔内部，在此情况下，不是测定对象的聚合物不进入计量区域，而可仅仅使作为测定对象的生物聚合物例如DNA链进入到测定区域，可排除由不是测定对象的聚合物引起的拉曼散射。
[0159]为了实现降低DNA的电泳速度的目的，也可采用可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制的其它的方法。作为第I方法，可将能够高灵敏度地检测上下的试样用腔室(440以及540)间的电压的一对计量电极分别新地(除了既存的银氯化银电极另外)设置于上下的试样用腔室。在此情况下，以使用一对计量电极计量出的实际的电压为基础，通过反馈控制施加于银氯化银电极的电压，从而可准确地对上下的试样用腔室之间施加规定的微小电压。作为第2方法，可采用恒电位方式。在此情况下，将既存的I对银氯化银电极分别视为试样极和对电极，并且在对电极侧的试样用腔室440以及540新地设置参照极，可按照试样极与参照极之间的电压成为设定了的值的方式，控制在试样极和对电极中流动的电流。通过以上的方法，可将规定的微小电压准确地施加于上下的试样用腔室440以及540间，可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制。作为第3方法，可采用恒电流方式(Galvano Stat mode)。在此情况下，将既存的I对的银氯化银电极分别视为试样极和对电极，可一边监控从一方流向另一方的电流一边按照成为规定值的方式反馈控制。通过此方法，从而可将规定的微小电流准确地流到上下的试样用腔室440以及540间，可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制。
[0160]说明控制DNA链通过纳米孔120的速度的进一步其它的方法。如果使充满于下部试样用腔室440的试样溶液和充满于上部试样用腔室540的试样溶液中具有压力差，从而将与DNA链想要利用电泳而通过纳米孔的力相反的方向的力施加于DNA链，那么可降低DNA链通过纳米孔的速度。例如，对充满于下部试样用腔室440的试样溶液施加大气压，另一方面通过泵机构、压电机构对充满于上部试样用腔室540的试样溶液施加大气压以上的压力时，则可产生从上部试样用腔室540朝向下部试样用腔室440的方向即，与DNA链的电泳为反方向的压力。该压力差也可通过基于上部和下部的试样溶液的组成差例如离子浓度差等的渗透压而控制。通过该压力差，从而在与DNA链的电泳相反的方向，S卩，从上部试样用腔室540朝向下部试样用腔室440的方向，使试样溶液在纳米孔120中以块体运动的方式流动，也可降低DNA链的通过速度。该试样溶液流动也可通过使纳米孔120的内表面具有电荷，使纳米孔120内部产生电渗透流从而实现。试样溶液流动也可进一步产生以下那样的效果。试样溶液按照包入DNA链的方式流动，使DNA链在纳米孔120内部在其中心轴附近局部存在，同时可将DNA链在中心轴方向拉长。这可使DNA链的各碱基稳定地通过增强场的中央，可实现精度高的拉曼散射计量。
[0161]图7表示核酸碱基的典型的拉曼散射强度(光谱)的例子。4种碱基A、C、T以及G，分别在特征性的波数(以下亦称为“特征带”)中，散射光强度显示为峰。该例子中的A、T、G的特征带的峰分别由al、tl、gl表示，波数分别为约730,1180,650011' C的峰位置Cl (即约1730CHT1)与T的峰位置t2(即1600CHT1)稍稍重复，但是通过考虑T所固有的特征带tl的有无而可辨别T和C。在上述以外，作为C和T的特征带，也存在有可适用C:1260cm-\T:1360cm-1的可能性。这样在识别峰本身而进行检测的情况下，例如需要以IOcnT1的分辨率检测拉曼散射光谱。即，需要将每I处纳米孔为400cm-1?lSOOcm—1的波数范围以140分割以上分割并检测，因此检测器需要大量的像素数。此外，由于以大量的像素进行测定，因此在期望高速地测定的情况下是不适合的。如本实施例那样，通过利用2分割比率分光检测装置，作为强度比的差异而检测拉曼散射光的光谱的差异，从而每I处纳米孔基本上能够以2像素的信号进行检测和识别，使检测器的像素少，并能够低成本化，也能够高速重复测定。另外，具体而言，如图8所示，将拉曼散射光在特定的波长范围内分别以不同的比率分割为透射光和反射光，可以由透射光与反射光的强度比率识别4种碱基(详细内容在实施例6中记载)。
[0162]在本实施例中例示出取得A、C、T、G的光谱而进行DNA的解析的情况，但是本发明的应用范围不受限于此。例如通过对U的光谱进行解析，从而可进行RNA的解析。另外通过取得甲基化C的光谱，从而可直读DNA的甲基化。进一步通过取得氨基酸的光谱，从而可进行肽、蛋白质的解析，另外通过取得糖的光谱，从而可进行糖链的解析。
[0163]本实施例的生物聚合物的光学解析装置基于固态纳米孔，因此具有结构的稳定性高并且可靠性高这样的特点。另外本实施例以拉曼光谱为指标进行单体种类的判定。光谱计量中，由于具有强度比和强度这样的二维信息，因此与隧道电流强度等一维信息相比信息量飞跃性地增多，定性上的识别能力高，因此具有碱基的识别能力高这样的特点。本实施例将近场固定于纳米孔120的开口部，使用试样驱动装置700，使DNA泳动，控制了与近场的相对位置关系。由此，无需将核酸预先固定于固体基板110，也不必需要高分辨率的微动工作台、AFM。另外不必需要以亚nm的精度将AFM的探针二维地扫描这样的微细的操作。SP，具有装置构成、操作变得简便这样的特点。
[0164][实施例1的变形例]
[0165]作为实施例1的变形例，可实施如下述的构成那样的纳米孔芯片100a。图9为基于本变形例的纳米孔芯片IOOa的不意图。如图不那样纳米孔芯片IOOa由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130a、130b等构成。即，在具有2张相当于实施例1中的导电性薄膜130的导电性薄膜方面，与(仅具有一张导电性薄膜130)实施例1不同。图10是本变形例的纳米孔芯片IOOa的包含纳米孔120的中心轴121的xz截面的示意放大图。如图示那样，导电性薄膜130a、130b形成于薄膜部分111的z轴上方，它们的端部131a、131b分别面向纳米孔120的开口部的上端，相互地相对。即，导电性薄膜130a和130b隔着与纳米孔120的孔径大致同样的距离而设置。
[0166]用于本变形例的纳米孔芯片IOOa的解析装置、运作与实施例1同样。不同的是，通过激光照射而生成的近场光在导电性薄膜130a、130b的端部131a、131b的间隙中产生。另外，如从由实施例1表示的模拟结果获知的那样，来源于两者的导电性薄膜的近场光相互地增强叠合，近场的强度增强。另外，通过导电性薄膜130a、130b的存在，使得近场的X方向的分布受限制，局限于纳米孔120的孔径程度。作为结果，本变形例的近场的形状的对称性高，因此均匀性高。另外本变形例中，近场的强度如上述那样按照入射光量比计为约7，000倍左右之高(图6)，因此为高灵敏度，近场具有在空间上均匀并且空间分辨率也高这样的特点。
[0167][实施例2]多纳米孔解析装置构成
[0168]使用图11说明本发明的生物聚合物特性解析用的多纳米孔芯片的构成的一个例子。图11是本实施例2的多纳米孔芯片1100的示意图。如图示那样多纳米孔芯片1100由基板1110、纳米孔1120、1121、以及导电性薄膜1130a、1130b、1131a、1131b等构成。如图示那样，本实施例的多纳米孔芯片1100是，在I个基板1110上具有多个由纳米孔以及相对的导电性薄膜等形成的上述变形例的单元结构、即，图10中例示的单元结构。[0169]下面，使用图12说明本实施例中的生物聚合物的光学解析装置的构成的一个例子。图12是本实施例2的进行生物聚合物的特性解析的多通道解析装置2000的构成概略图。多通道解析装置2000由光源210、括束器220、分色镜230、物镜240、滤波器250、2分割比率分光检测装置2010、终端270、xyz微动工作台600、试样驱动装置700、试样单元300、个人电脑等计量控制装置(没有图示)等构成。试样单元300中收纳多纳米孔芯片1100。
[0170]接下来说明本实施例的运作的概略。本实施例2的运作与实施例1同样，但作为纳米孔芯片使用具有多个单元结构的多纳米孔芯片1100。因此，在多纳米孔芯片1100上的多个场所，来源于试样的拉曼散射光分别独立地产生。该拉曼散射光用物镜240聚光，通过分色镜230，利用滤波器250来除去瑞利散射光后，在2分割比率分光检测装置2010的检测面上成像。来自各个纳米孔开口部的拉曼散射光作为聚合物的每个种类以不同的比率对其强度进行了分割的2分割像来检测，能够同时地检测、识别来自多纳米孔的拉曼散射光。在使拉曼散射波长分散而检测的以往方式的情况下，如实施例1所记载那样，每I处纳米孔需要为140以上的像素。在二维检测器的像素尺寸为8微米、成像倍率60倍的情况下，如果在基板上与相邻的纳米孔的距离为20微米左右，则发生光谱的重叠，难以测定。本发明中，可以不使拉曼散射波长分散，而作为亮点的像而测定，因此可以在来自相邻地配置的纳米孔的分散像不重叠的情况下进行测定。因此，可以在多纳米孔芯片上窄地配置纳米孔彼此的间隔。例如，能够以0.5微米?几微米左右的正方格子的格子点状地配置，能够高密度配置。特别是在拉曼散射测定中，由于以高析像度、高NA的透镜进行检测，因此视场尺寸变小。可以如本实施例那样以高密度配置，从而能够进行更多的纳米孔的测定，可以使解析的通量提高。
[0171]此外，在进行波长分散的情况下，相对于多纳米孔芯片1100的光学系统中心轴的设置位置能够每次测定而变化，因此每次每个纳米孔都需要由该检测面上的位置进行像素坐标与波长的关系，即波长校正，但在本实施例的情况下，仅仅检测亮点的像即可，因此不需要波长校正等操作，可以简便地进行计量。
[0172]利用电泳通过纳米孔的DNA链一般为高速。例如施加电压IOOmV时，碱基长IOkb (knt)的单链DNA的纳米孔通过时间为约lms，每一碱基的增强场停留时间(假定增强场的空间性的变宽为无限小)不过于0.1 μ S。因此，在此条件下为了独立地计量来源于各碱基的拉曼散射信号，需要将2分割比率分光检测装置2010的运作速度设为IMHz以上。利用以往的显微镜系统高灵敏度地计量荧光、磷光、散射光等的情况下，特别是同时计量二维状地分布的测定对象的情况下，检测器的运作速度通常为30Hz以下，特别快速的速度也是不足ΙΚΗζ。因此将检测器的运作速度设为IKHz以上、优选为1MHz，这是在本发明中通过组合纳米孔和通过纳米孔的DNA链的拉曼散射光谱计量而产生的新的课题。作为实现这样的超高速检测的手段，与以往的显微镜系统中通常使用的CCD(电荷耦合元件)相比，优选为CMOS (互补型金属氧化膜半导体)。在CXD中按照检测元件整体、或者以I列单元使像素依次进行AD转换，与此相对，在CMOS中也可对二维状地排列的全部检测像素同时进行AD转换，可将AD转换所需要的时间缩短几百?几千倍。不限于CMOS，如果每个检测像素是具有AD转换功能的检测器则可获得同样的效果。另外，为了削减将由检测器取得的大量的信号介由电缆、板(board)转送于控制用电脑、书写入内置的硬盘等所需要的时间，因而在检测器中内置大容量的存储器、从而不经由上述而保管大量的信号，这也有效。另一方面，伴随着检测的高速化，各个计量的曝光时间显著降低。为了防止由此导致的灵敏度降低，对于本发明而言优选的构成是:导入增强场、使用液浸型的高数值孔径物镜、或者检测器使用雪崩光电二极管等高灵敏度元件，或具有图像增强器、电子倍增型CCD (EM-CCD)等倍增机构，等等。即，在本发明中，优选使用具有倍增机构的检测器。
[0173]根据本实施例2则可对于多个纳米孔同时取得拉曼散射光谱，因此具有计量的多重度高，结果的可靠性高这样的特点。此外，具有在进行多重度高的计量的情况下通量高这样的特点。
[0174]作为本实施例的变形例，也可对各个纳米孔逐一地设置独立的试样用腔室，使用各个纳米孔同时地计量不同的试样。另外，该变形例具有可并列地计量多个试样因而通量高这样的特点。
[0175]另外本例中，是在导电性薄膜对(例如，1130a与1130b，或，1131a与1131b)之间形成纳米孔，生物聚合物通过该纳米孔内的构成。也可以通过改变纳米孔，将导电性薄膜对之间设为流路来实施。通过与基板面平行地使生物聚合物移动，使其通过导电性薄膜对(1130a与1130b，或，1131a与1131b等)之间，此时同样地检测产生的拉曼散射光，从而可以并列地计量多个试样，能够进行通量高的解析。
[0176][实施例3]三明治结构的纳米孔芯片
[0177]使用图13说明本发明的进行生物聚合物特性解析的纳米孔芯片的构成的一个例子。图13是本实施例3的纳米孔芯片IOOb的包含纳米孔120的中心轴121的xz截面的示意放大图。基板110在z轴上方的基板面具有薄膜部分111a，在其上具有导电性薄膜130a、130b，进一步在其上具有薄膜部分111b。其它与实施例1的变形例(图10)同样。
[0178]本实施例3的纳米孔芯片IOOb的制作法与实施例1 (的变形例)类似，但是通过EB刻蚀形成导电性薄膜130a、130b的图案后,通过派射形成膜厚约20nm的由SiO2形成的薄膜部分11 Ib，其后通过TEM而形成纳米孔这一点不同。薄膜部分11 Ib薄因此纳米孔芯片IOOb的外观与实施例1 (的变形例)同样，即如图9那样。
[0179]本实施例3的运作与实施例1 (的变形例)同样，但是以下的点不同。第1，导电性薄膜130a、130b由薄膜部分Illb被覆着，因此可与试样相互作用的近场局限于纳米孔120的内部。剩余的近场被封入薄膜部分111a、薄膜部分Illb的内部，因此无法与包含生物聚合物的试样相互作用。因此具有如下特点:不产生来源于存在于除了作为目标的纳米孔120内部以外的空间中的试样的背景信号，S/N高。第2，近场形成于纳米孔120的中心轴方向的恰好中央附近，因而通过纳米孔而限制着作为试样的DNA等生物聚合物的xy方向的运动，因此试样可与均匀的近场相互作用，因此具有所获得的信号的重现性高这样的特点。第3，在通过纳米孔120的过程中DNA在轴方向伸长，因而具有如下特点:可消除高级结构，可按顺序将各个碱基导入近场，试样的序列上的观测区域与测定时刻的对应关系简单化，容易解析。
[0180][实施例4]通电于导电性薄膜的纳米孔芯片
[0181]使用图14说明本发明的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图14是本实施例4的纳米孔芯片IOOc的示意图。如图示那样纳米孔芯片IOOc由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130a、130b、布线图案132a、132b、触点133a、133b等构成。布线图案132a、132b、触点133a、133b分别与导电性薄膜130a、130b电导通。[0182]布线图案132a、132b、触点133a、133b与上述的实施例中的导电性薄膜130a、130b同样地形成了。不同的是，使用了金作为布线图案、触点的材质，布线图案采用了 I微米作为厚度，触点采用了 100微米作为厚度等等。
[0183]本实施例4的生物聚合物的光学解析装置与实施例1?3同样，但是以下的点不同。即，本实施例4中，从触点133a、133b介由卡缘连接器(card edge connector)(没有图示)，按照成为反相位的方式连接于试样驱动装置700的第2电压输出。
[0184]本实施例4的运作与上述的各实施例同样，但是以下的点不同。即，在本实施例4中，从试样驱动装置700将脉冲状的电压施加于试样用腔室，从而使生物聚合物穿过纳米孔120而泳动了。另外，通过激光器照射而在导电性薄膜130a、130b的端部形成了近场。试样驱动装置700的脉冲为OFF之时，泳动电压被解除，并且触点133a、133b被施加反相位、即，ON脉冲，该脉冲电压通过布线图案132a、132b传输到导电性薄膜130a、130b，施加于其端部131a、131b(没有图示)。于是，作为生物聚合物的DNA的磷酸基被诱引到导电性薄膜130a、130b的阳极侧的端部，因而这个期间可暂时地强制性地停止DNA的泳动。在这个期间，取得基于生物聚合物的拉曼散射光的强度比。同样地，试样驱动装置700的脉冲为ON之时,施加泳动电压,并且触点133a、133b被施加反相位、即OFF脉冲，解除DNA的泳动的暂时强制停止，因而再次开始DNA的泳动。这个期间未检出拉曼散射光。
[0185]在本实施例4中具有如下特点:不仅通过泳动电流的脉冲驱动，而且通过使基于对导电性薄膜的电压施加而进行的生物聚合物的强制停止/解除与泳动电流的脉冲同步地进行，从而可更精密地控制生物聚合物通过纳米孔的移动。
[0186][实施例5]使用了石墨烯作为导电性薄膜的纳米孔芯片
[0187]使用图15和图16而说明本发明的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图15是本实施例5的纳米孔芯片IOOd的示意图。纳米孔芯片IOOd由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130c、130d等构成。如图示那样本实施例5与实施例3类似，但是主要是以下的点不同。第1，使用了单层的石墨、即，石墨烯(graphene)作为导电性薄膜130c、130d。第2，导电性薄膜130c、130d的平面形状按照由框状的结构将周围包围的形式而相互地连结着。换言之，导电性薄膜130c、130d是具有空隙134a、134b的I张薄膜状的结构物。(空隙134a、134b也在纳米孔120的部分处相互地连结着)。第3，纳米孔120的直径采用了 2nm这一点不同。
[0188]图16是包含纳米孔120的中心轴121的xz截面的示意放大图。由于放大率高，因此未图示导电性薄膜130c、130d的外框。
[0189]本实施例5的纳米孔芯片IOOd的制作法与实施例3类似，但是在基板110上形成薄膜部分Illa后的工序不同。S卩，另行,使用机械剥离法从石墨制作石墨烯(graphene),通过光学显微镜确认是单层。使用Schneider等人的Nano Letters (2010) 10, 1912中记载的楔固(wedging)法，将该石墨烯转送于作业用的支撑基板之上。使用高焦点的TEM(加速电压300kV)，从而对支撑基板连同石墨烯照射电子束而对碳进行冲压，形成了空隙134a、134b及其连结部分。从TEM取出支撑基板，再次使用楔固(wedging)法，从而将实施了上述加工的石墨烯转送于基板110的薄膜部分Illa之上。其后与实施例3同样地，通过溅射形成薄膜部分111b，进一步使用TEM(对空隙134a、134b的连结部分照射电子束)形成了纳米孔 120。[0190]本实施例5的运作与实施例3同样，但是以下的点不同。第1，由石墨烯形成导电性薄膜130c、130d，因此其厚度为约0.3nm、极其薄。因此，在其端部131a、131b之间形成的近场的厚度也为Inm以下、极其薄，就连DNA的碱基数也为I?3碱基左右，具有空间分辨率高这样的特点。即，具有如下特点:基于上述的差分法的解析的误差少，并且可以以更高的准确度识别碱基的种类。第2，由于导电性薄膜130c、130d由石墨烯形成，因此其端部131a、131b的厚度为极其薄，在厚度方向考虑时则锐尖。关于近场，前端是锐尖时则具有电场集中而增强效果变高这样的特点。第3，具有如下特点:由于导电性薄膜130c、130d由石墨烯(即碳)形成，因而与银相比对于在水溶液中的氧化等的稳定性高。另外，在本实施例中使用了单层的石墨烯，但是也可使用2层至15层左右的石墨烯。即使在使用这些多层的石墨烯或石墨的情况下，也可形成5nm以下的极其薄的导电性薄膜，因此不仅可获得与上述同样的效果，而且也具有强度高这样的特有的效果。第4，具有纳米孔的内径小因而可抑制试样的通过速度这样的特点。
[0191]作为本实施例5的变形例，可采用撤去导电性薄膜130c、130d的外框而分别独立，如实施例4那样拉出布线而连接于外部装置的方法。通过采用隧道电流的计量装置作为外部装置，从而可计量出穿过导电性薄膜130c、130d的端部131a、131b间的试样而流动的隧道电流。该变形例具有端部的厚度薄因而隧道电流计量中的空间分辨率高这样的特点。将该变形例与实施例1至实施例5组合，从而可同时进行拉曼测定和隧道电流测定。通过互补地使用两者的结果，从而可提高解析结果的可靠性。另外，也可通过使用一方的结果而检测出DNA的碱基的存在，取得另一方的计量时机的同步，从而提高计量的S/N，提高解析结果的可靠性。
[0192]另外，可将本发明的设置有导电性薄膜的纳米孔芯片适用于荧光计量方式、例如，使用荧光探针的纳米孔测序仪。在此情况下，通过活用利用导电性薄膜而形成的近场，从而可实现高灵敏度、且高的空间分辨率。
[0193]进一步，将构成上述的本发明的各要素、以往的技术组合2种以上，从而进一步提高解析精度，这也是有效的。
[0194][实施例6]2分割比率分光检测装置
[0195]使用图17说明关于本发明的生物聚合物的光学解析装置中的检测装置的构成的一例。图17是本实施例6的生物聚合物解析用的检测装置的构成图。图3和图12所记载的光源、扩束器的部分省略了。
[0196]作为测定基板使用纳米孔芯片100或多纳米孔芯片1100。以下的说明中对多纳米孔芯片1100的情况进行说明。从基板上的多个纳米孔120，分别独立地产生来源于试样的拉曼散射光。该拉曼散射光用物镜240聚光，通过分色镜230，利用滤波器250除去瑞利散射光后，用2分割比率分光检测装置260检测。2分割比率分光检测装置260由2分割比率分光检测装置用分色镜32、辅助滤波器17a、17b、成像透镜18a、18b、二维传感器照像机19a、19b、二维传感器照像机控制器20a、20b构成。
[0197]被聚光了的拉曼散射光利用2分割比率分光检测装置用分色镜32而分离成每个波长以不同的比率分割出的光束。将分离出的光束分别通过辅助滤波器17a、17b，使该像用成像透镜18a、18b成像于二维传感器照像机19a、19b (高灵敏度冷却二维CXD照像机)，进行检测。照像机的曝光时间的设定、光图像的摄取时机等的控制介由二维传感器照像机控制器20a、20b而控制PC21来进行。另外，滤波器组件250中，组合使用作为光源的激光除去用的节点滤波器、与使进行检测的波长带透射的带通干涉滤波器。激光除去用的节点滤波器使用所使用的激光器专用的周知的特性的滤波器。将带通干涉滤波器(和辅助滤波器17a，17b)的概略特性示于图18(A)中，将2分割比率分光检测装置用分色镜32的概略特性示于图18(B)中。另外横轴作为波数而表示。
[0198]另外，装置具备自动对焦机构、以及用于基板位置调整等的透射光照明、反射光照明、透射光/反射光观察用镜筒、和TV照像机(没有图示)、和监视器22。可以用卤素照明等实时地观察基板1100的状态。
[0199]作为本实施例中使用的二维传感器照像机19a、19b，使用CCD区域传感器。可以使用各种像素尺寸、像素数的CCD区域传感器。例如，使用像素尺寸为16X16微米且像素数512X512像素的高灵敏度电子倍增型冷却CXD照像机。另外，作为二维传感器照像机，除了 CCD区域传感器以外，一般可以使用C-MOS区域传感器等摄像照像机等。CCD区域传感器中，根据结构，有背面照射型、正面照射型，可以使用任一种。此外，如本实施例那样在元件内部具有信号的倍增功能的电子倍增型CCD照像机(EM-CCD)等也在实现高灵敏度化方面是有效的。此外，传感器期望为冷却型，为一 20°C左右以下，从而可以降低传感器所具有的暗噪声，可以提闻测定的精度。
[0200]每I处纳米孔的CXD的必要像素为3X3像素左右或其以上，在该中央部检测纳米孔中的拉曼散射的亮点。在512X512像素的(XD区域传感器的情况下，也能够同时地检测最大29000个纳米孔中的拉曼散射，进行识别。如果扩大纳米孔彼此的配置间隔，则与其对应地同时计量纳米孔数减少。在纳米孔的尺寸为其以上、或基板尺寸更宽广的情况下，也能够对区域进行划分而分割进行计量。该情况下，在工作台下部配置用于使基板的位置移动的X — Y移动机构部，用控制PC21控制向照射位置的移动、光照射、光像检测。本实施例中X — Y移动机构部未图不。
[0201]接下来对拉曼散射光的检测和识别进行说明。具体而言，从多纳米孔芯片1100的多个纳米孔，检测来源于试样的拉曼散射光，识别该试样成分，即碱基的种类并测定强度的方式进行说明。
[0202]图17中，将对二次传感器照像机((XD照像机)19a、19b的综合成像倍率设为20倍，计量来自各纳米孔的拉曼散射光。在多纳米孔芯片1100内的纳米孔配置成4微米X4微米的格子状的情况下，将纳米孔彼此的间隔分割成5份而以CCD像素检测。
[0203]例如，使用分散元件进行波长分散的情况下，格子点的最接近的间隔为4微米，以CCD像素数计为5像素。在5像素以内使拉曼散射光谱分散，进行光谱分离实质上困难。此夕卜，实际的成像图像中，各个纳米孔的发光亮点不收纳于I像素而具有扩展，因此遍及数像素而成像，重叠进一步变大，因此光谱分离变得更困难。
[0204]本实施例中，由于不使来自纳米孔的拉曼散射光分散而进行成像，因此这样的限制消失。对于高密度地配置的多纳米孔芯片的测定是有效的。
[0205]各碱基的拉曼散射光(例如图7)分别以不同的比率到达二维CXD照像机19a、19b。二维CXD照像机19a、19b中，没有波长方向的信息，仅获得亮点的亮度信息。具体而言，拉曼散射光分离成由图7所示的光谱与图18(B)所示的光谱的累积来确定的反射光像和透射光像，获得各自的亮点。图8中显示亮点为分别来源于A、C、G、T的拉曼散射像时的各亮点所含的光谱分布和比率。图8(A)是相当于图7的拉曼散射光的各碱基的透射光光谱成分，(B)是反射光光谱成分。由于各碱基的拉曼散射光谱(图7)不同，因此每个碱基种类利用2分割比率分光检测装置用分色镜32进行透射的光谱成分与进行反射的光谱成分不同，检测到的透射强度与反射强度不同。即，如图8(C)那样，对于每个碱基种类，相对于全部强度的透射强度的比率不同，可以由该比率来识别碱基种类，能够判定通过纳米孔的碱基。这样，使用每个波长以不同的比率分割的分色镜，分割一个亮点的光强度，将它们利用不同的像素进行检测，从而可以识别来自4种碱基的拉曼散射，并进行检测。对于控制PC21，从各CCD照像机的图像，挑选出各纳米孔的亮点，计算出其强度之比，识别碱基的种类。
[0206]另外，可以使用的分色镜的特性不限于本实施例所示的特性，只要是具有使4种以上的拉曼散射的反射强度与透射强度的比率为不同(可以区分)组合的特性，则能够适用。此外除了 DNA的碱基序列以外也可以适用于RNA序列等。
[0207]此外，二维CXD照像机19a、19b不需要为2个，也可以为I个。该情况下只要在使分割出的像成像于相同二维CCD照像机时，将图像横向错开等而使位置不同即可。
[0208]本实施例中，对4种碱基的识别进行了说明，但也能够为3种，此外5种、6种以上的组合也能够使用。
[0209]本实施例中，作为分色镜32，使用在指定的波数范围内具有透射率实质上大致为0%?大致为100%的大致线形的特性的2色性镜,但也可以为大致10%?大致80%的大致线形的特性。此外根据所使用的多个散射光谱，在每个任意的波数带，透射率、反射率可以为不同特性的分割镜。例如，也同样能够是每个特征性的拉曼散射峰的波数，阶梯状地变化的特性的镜(图19中示意地图示)。
[0210]根据本实施例，精密配置多个纳米孔，在具备多个检测像素的多个检测器的特定像素中分别成像来源于进入到各纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光，测定每个检测器的强度比，从而可以识别构成生物聚合物的单体的种类。特别是可以用I台或2台作为检测器的二维C⑶照像机来检测识别3种或4种以上单体。由此，可以抑制装置成本。当然，也能够每I分子都进行检测。
[0211]此外，本实施例中，使用将纳米孔以一定间隔的格子状地配置的基板。通过格子状地配置纳米孔，从而透射像与反射像内的相对应的亮点的识别变得容易。在不使用格子状地配置捕捉区域的基板的情况下也对应。在随机地形成的情况下，只要比较两者的图像，进行图案解析，或参照基准标记，判定相互地对应的亮点即可，由此也可获得同样的效果。
[0212]此外，每I个发光亮点的CXD的像素数为5 X 5像素，但能够调整为4X 4像素、5 X 4像素、4 X 3像素、3 X 3像素等。即使以这些像素数进行检测，也可以高效率地检测识别高密度地捕捉的分子。
[0213][实施例7]2分割比率分光检测装置的其它构成
[0214]对本发明的生物聚合物的光学解析装置中的检测装置的构成的一例进行说明。图20是本实施例7的生物聚合物特性解析用的检测装置的构成图。与图17同样地，图3和图12所记载的光源、扩束器的部分省略了。
[0215]作为测定基板，使用纳米孔芯片100或多纳米孔芯片1100。以下的说明中，对于多纳米孔芯片1100的情况进行说明。从基板上的多个纳米孔，分别独立地产生来源于试样的拉曼散射光。该拉曼散射光用物镜240聚光，通过分色镜230，利用滤波器250来除去瑞利散射光后，用2分割比率分光检测装置2010检测。2分割比率分光检测装置2010由2分割比率分光检测装置用分色镜32、反射镜40a、40b、40c、辅助滤波器17a、17b、成像透镜18c、二维传感器照像机19c、二维传感器照像机控制器20c构成。
[0216]首先，利用用于分割的分色镜32，每个波长以不同的比率分割成透射光和反射光。对于分割出的光束，反射光用反射镜40a反射，以指定的角度导入成像透镜18c中。透射光用反射镜40b和40c弯折，以其它指定的角度导入相同成像透镜18c中。两光束以不同的角度入射到成像透镜18c，从而相对于二维传感器照像机19c (高灵敏度冷却二维CXD照像机)，错开各自的图像而进行成像。为了除去杂散光，辅助滤波器17a、17b使用带通干涉滤波器。根据情况，可以不使用辅助滤波器。二维传感器照像机19c的图像介由二维传感器照像机控制器20c而由控制PC21收集并进行解析。另外，使分割透射光与分割反射光的光路的长度尽量相同，但也可以不是一定相同。图中成像倍率是两光束相同，但也可以为不同。只要判断为相同亮点的分割透射光像和分割反射光像，就能够解析。
[0217]根据本实施例，由于可以用I台二维CCD照像机检测来源于多个纳米孔的拉曼散射光，因此计量变得简便，同时不需要进行二维CCD照像机的由个体差引起的灵敏度校正，此外，也不需要控制测定的时机，因此测定精度提高。
[0218][实施例8]具备具有突起状结构的流路的特性解析芯片
[0219]使用图21说明本实施例的生物聚合物特性解析用纳米流路芯片的构成的一实施例。纳米流路芯片800由基板810、流路820、覆盖玻璃840等构成。在覆盖玻璃840上，具有用于在与流路820的两端相当的位置导入测定试样的开口部851、和用于导出的开口部852。流路820由基板810上的导电性薄膜形成，在中央的观察区域830具有突起结构831，产生实施例1记载的增强场。即，在流路的I处形成具有尖锐端的突起形状(突起状结构)，该突起形状相对于流路的行进方向而形成于流路的一个壁面。
[0220]进行本实施例的生物聚合物的特性解析的解析装置的构成与实施例1同样(参照图3)，但试样单元的构成是不同的。图22是显示试样单元8300的构成概略的截面图。试样单元8300由纳米流路芯片800、上部部件8310、下部部件8320、螺丝类(没有图示)等构成。关于上部部件8310，在其内部形成O —环8330、试样用流路8340、8350、电极用流路8360、8370、试样用连接端口 8341、8351、电极用连接端口 8361、8371。上部部件8310介由试样用连接端口 8341、8351而气密性地连接试样送液管(没有图示)，此外介由电极用连接端口 8361、8371而气密性地连接银氯化银电极(没有图示)。具有银氯化银电极的氯化银的端收纳于电极用流路腔室(没有图示)，该具有银的端(以下，银端)露出在电极用流路的外部。上述试样送液管、试样用流路8340和8350、试样用连接端口 8341和8351、电极用流路8360和8370、电极用连接端口 8361和8371中，无间隙(无气泡的混入)地充满试样溶液(没有图示)。因此，试样单元8300和纳米流路芯片800内的试样溶液与银氯化银电极接触，两者电化学地导通。
[0221]使用图3、图21和图22对本实施例的运作的概要进行说明。首先进行试样单元8300的准备。具体而言，在上部部件8310与下部部件8320之间夹着纳米流路芯片800而以O —环8330压接，气密性地连接试样用流路8340和8350与纳米流路芯片800的开口部851和852。从试样送液管导入IOOmM KCl水溶液作为试样溶液，在试样单元8300的试样用流路8340、8350、电极用流路8360、8370、试样用连接端口 8341、8351、电极用连接端口8361、8371、和纳米流路芯片800的流路820中充满试样溶液。
[0222]接下来将试样单元8300设置于解析装置200。具体而言，将试样单元8300固定于微动工作台600。使用微动工作台600和未图示的目视用光学系统，使光学系统的焦点与试样单元8300内的纳米流路芯片800的观察区域部分830 —致。将设置于试样单元8300的2个银氯化银电极连接于试样驱动装置700。试样驱动装置700内置电压源或电流源，可以将试样导入侧的电极用连接端口 8361作为基准，向试样导出侧的电极用连接端口 8371施加电压。
[0223]解析装置的光学系统、和作为测定对象的DNA的测定步骤如实施例1所示。取得利用电泳而使测定试样通过形成于导电性薄膜860的端部831的近场时的增强拉曼散射光的时间变化。
[0224]本实施例的纳米流路芯片制作法与实施例1 (的变形例)中的导电性薄膜130的制作法是同样的。在硅基板810上形成金薄膜860，涂布抗蚀剂后，利用EB刻蚀形成图21所示的测定区域830的图案，利用蚀刻除去其以外的区域的金，除去抗蚀剂，最后使覆盖玻璃840盖上而固定。关于突起结构831的尺寸，与实施例1是同等的。此外夹持于突起结构831和导电性薄膜860的流路820的宽度为约30nm。其与实施例1所记载的纳米孔的孔径大致相同，能够不凝集地通过例如DNA分子。
[0225]本实施例中作为导电性薄膜860的材料而使用了金，但该材料不限定于金，可以适合使用一般具有导电性的材料，一般为金属。作为能够作为导电性薄膜而使用的其它金属，有钼、钯、铑、钌等钼族的金属，银、铜等。
[0226]本实施例中使用的覆盖玻璃840的材料为玻璃、石英、光源波长下透明度高的丙烯酸系等塑料材料等。
[0227]本实施例中，测定试样沿着流路而与基板810水平地行进。即，本实施例的生物聚合物特性解析用芯片，在并非具有纳米孔而是具有纳米尺寸的流路这方面，与实施例1是不同的。该结构的优点在于不需要在基板的上下设置试样用腔室。实施例1中，由于在物镜与芯片之间存在试样用腔室，因此在观察时有时由于由腔室内部的试样溶液产生的信号而背景光增加。根据本实施例，由于可以排除该影响，因此噪声成分减少。此外不用试样用腔室，从而与以往任何时候相比都可以使物镜接近于测定区域。因此，能够使用与实施例1相比NA更高的透镜，因此信号强度增加。结果是具有下述特征:与实施例1相比，可以以高的S/N进行观察。
[0228]另外作为与本实施例接近的变形例，能够如下述的构成那样实施纳米流路芯片800a。图23是本变形例的纳米流路芯片800a的示意图。基本构成与上述实施例和图21类似，但如图示那样纳米流路芯片800a，在测定区域具有2个突起形状831、832方面与(仅具有I个突起形状831)图21不同。2个突起形状的端部从流路的左右壁面分别相互相对。端部的间隔为约30nm。其与图21的情况下的纳米孔的孔径大致相同，能够不凝集而通过例如DNA分子。
[0229]用于本变形例的纳米孔芯片800a的解析装置、运作也同样。关于本变形例的效果的特征，也如上所述。此外，也能够使本实施例和变形例所记载的流路820在基板810表面上二维地多个配置。[0230][实施例9]具备具有一列纳米粒子的流路的特性解析芯片
[0231]使用图24对本实施例的生物聚合物特性解析用纳米流路芯片的构成的一实施例进行说明。纳米流路芯片900由基板910、流路920、覆盖玻璃940等构成。在覆盖玻璃940上，具有用于在与流路920的两端相当的位置导入测定试样的开口部951、和用于导出的开口部952。流路920由基板910上的导电性薄膜960形成，在中央的观察区域930，遍及流路920的整个宽度而固定有一列纳米粒子931，产生实施例1记载的增强场。如图示所示本实施例与实施例8类似，但在测定区域不存在突起形状，取而代之的是固定纳米粒子，这方面是不同的。其它与实施例8同样。
[0232]本实施例的芯片制作方法如下所述。首先按照实施例8的步骤，制作纳米尺寸的流路920。在基板表面涂布抗蚀剂，通过EB刻蚀形成流路图案。接下来，固定金纳米粒子931。在包含流路920的基板910整体涂布抗蚀剂，利用EB刻蚀(正)形成用于在流路上固定金纳米粒子931的图案。进行后烘烤，用纯水冲洗，形成流路的一部分露出的状态。利用溅射而在露出部分形成SiO2薄膜后，利用丙酮除去抗蚀剂。最终形成在流路920的底的一部分存在SiO2薄膜的状态。使硅烷偶联剂反应，在SiO2薄膜上加成官能团。相对于上述官能团而使金纳米粒子931反应，进行结合。最后使覆盖玻璃940盖上，进行固定。
[0233]本实施例9的运作与实施例1 (的变形例)是同样的。在使用了金纳米粒子931的情况下，增强场产生于各个粒子的周边和粒子间的间隙。使流路920的高度(与导电性薄膜960的膜厚相等)与金纳米粒子931的直径同等，使流路920的宽度为金纳米粒子931的直径的整数倍，从而金纳米粒子931最密地填充于流路920，其结果是，测定试样通过增强场。
[0234]根据本实施例，通过使用金纳米粒子931而可以获得与实施例8同样的效果。此外与实施例8相比，具有可以比较简便地制作芯片这样的特征。
[0235]本实施例中，作为纳米粒子931的材料而使用了金，但该材料不限定于金，可以适合使用一般具有导电性的材料，一般为金属。作为能够作为导电性薄膜而使用的其它金属，有钼、钯、铑、钌等钼族的金属，银、铜等。此外，固定树脂制的珠后，利用溅射而将各种金属进行表面涂布，然后利用加热等而排除树脂成分，也可获得同样的效果。
[0236]另外作为与本实施例接近的变形例，能够如下述的构成那样实施纳米流路芯片900a。图25是本变形例的纳米流路芯片900a的不意图。基本构成与图24类似,但如图不那样纳米流路芯片900a，在测定区域930a具有圆筒状的金属结构体931a这方面与图24的情况不同。
[0237]本变形例的制作方法与流路920的制作方法同样，采用EB刻蚀。用于本变形例的纳米流路芯片900a的解析装置、运作与实施例8是同样的。关于本变形例的效果的特征，也如实施例8所记载。本变形例中配置了圆筒状的金属结构体931a，但其形状也可以为三棱柱、四棱柱等多棱柱状。此外，也能够使本实施例和变形例所记载的流路920 二维地多个配置于基板910表面。
[0238][实施例10]具备具有多列纳米粒子的流路的特性解析芯片
[0239]使用图26说明本实施例的生物聚合物特性解析用纳米流路芯片的构成的一实施例。纳米流路芯片1000由基板1010、流路1020、覆盖玻璃1040等构成。在覆盖玻璃1040上，具有用于在与流路1020的两端相当的位置导入测定试样的开口部1051、和用于导出的开口部1052。流路1020由基板1010上的导电性薄膜1060形成，在中央的观察区域1030，遍及流路1020的整个宽度而固定有多列纳米粒子1031，产生实施例1记载的增强场。如图示那样本实施例与实施例9类似，但在不是固定有一列而是多列纳米粒子1031这方面是不同的。其它与实施例9同样。
[0240]本实施例的芯片制作方法与实施例9同样。本实施例的运作与实施例8 (的变形例)同样，但在以下方面是不同的。在使用了金纳米粒子的情况下，增强场产生于各个粒子的周边和粒子间的间隙。因此，与实施例8相比可以以宽范围产生增强场。实施例8中的增强场限定于突起形状的前端部分的直径30nm的范围，但根据本实施例，具有可以将增强场的范围扩大到最大为激光的照射斑的尺寸这样的特征。此外与实施例8和实施例9相比，具有可以提高每I像素的信号强度这样的特征。
[0241]在使用元件尺寸为16um/像素的EM-CXD，以放大倍率20倍进行观察的情况下，CXD的I像素相当于纳米流路芯片1000上的0.8um。纳米粒子1031的直径为0.lum，在流路1020以最密填充固定的情况下，在相当于CCDl像素的区域中，金纳米粒子1031在流路1020的行进方向上存在大约10列。即，I像素所示的信号强度成为由大约10列金纳米粒子1031产生的增强效果的累计。例如将在实施例9中泳动速度为I时测定试样存在于增强场的时间设为I的情况下，本实施例中泳动速度为I时测定试样存在于增强场的时间为
10。即，通过使用上述构成的纳米流路芯片1000，可以以大约10倍的泳动速度获得与实施例9同等的效果。
[0242]如上所述，根据本实施例，能够进行更高效地并且简便的增强观察。此外本实施例特别适于生物体单体担载体中的测定。
[0243]另外作为与本实施例接近的变形例，能够如下述的构成那样实施纳米流路芯片IOOOa0图27是本变形例的纳米流路芯片IOOOa的示意图。基本构成与图26类似，但如图示那样纳米流路芯片1000a，在测定区域1030a具有圆筒状的金属结构体1031a方面与图26的情况是不同的。
[0244]本变形例的制作方法与流路1020的制作方法同样，采用EB刻蚀。本变形例的用于纳米流路芯片IOOOa的解析装置、运作与实施例8是同样的。关于本变形例的效果的特征，如实施例8所记载。本变形例中，配置了圆筒状的金属结构体1031a，但该形状也可以为三棱柱、四棱柱等多棱柱状。此外，也能够将本实施例和变形例所记载的流路1020 二维地多个配置于基板1010表面。
[0245]本说明书中引用的全部的刊物、专利以及专利申请，以参考方式将其全文并入本说明书中。
[0246]产业上的可利用性
[0247]本发明提供生物聚合物的光学解析装置以及解析方法。本发明的解析装置基于固态纳米孔方式，因此结构的稳定性高并且可靠性高，另外可以通过拉曼散射而二维地以高空间分辨率并且高灵敏度对生物聚合物的特性进行解析。此外，由于可以在多个纳米孔中同时地解析多个生物聚合物，因此本发明的解析装置和解析方法简便并且高通量。因此，本发明可用于期望对生物聚合物的特性进行解析的领域例如生物技术、生物化学、医疗等领域中。
[0248]符号的说明[0249]17a，17b辅助滤波器
[0250]18a，18b，18c 成像透镜
[0251]19a，19b，19c 二维传感器照像机
[0252]20a, 20b, 20c 二维传感器照像机控制器
[0253]21 控制 PC
[0254]22监视器
[0255]32 2分割比率分光检测装置用分色镜
[0256]40a, 40b, 40c 反射镜
[0257]100,100a, 100b, 100c, IOOd 纳米孔芯片
[0258]110 基板
[0259]111，Illa基板的薄膜部分
[0260]Illb薄膜部分
[0261]112基板的窗部
[0262]120纳米孔
[0263]121纳米孔的中心轴
[0264]130,130a, 130b, 130c, 130d 导电性薄膜
[0265]131，131a，131b导电性薄膜的端部
[0266]132a, 132b 布线图案
[0267]133a，133b 触点
[0268]134a, 134b 空隙
[0269]200解析装置
[0270]210 光源
[0271]220扩束器
[0272]230分色镜
[0273]240 物镜
[0274]250滤波器、滤波器组件
[0275]260 2分割比率分光检测装置
[0276]270 终端
[0277]300试样单元
[0278]310上部部件
[0279]320下部部件
[0280]330 O-环
[0281]410，420，430 试样用流路
[0282]440 (下部)试样用腔室
[0283]450电极用腔室
[0284]460，470试样用连接端口
[0285]480 (下部)电极用连接端口
[0286]540 (上部)试样用腔室
[0287]580 (上部)电极用连接端口[0288]600 xyz微动工作台
[0289]700试样驱动装置
[0290]800,800a纳米流路芯片[0291 ]810 基板
[0292]820 流路
[0293]840覆盖玻璃
[0294]851,852 开口部
[0295]830,830a观察区域，测定区域
[0296]831，832突起结构，端部
[0297]860导电性薄膜
[0298]900,900a纳米流路芯片
[0299]910 基板
[0300]920 流路
[0301]930,930a观察区域，测定区域
[0302]931 纳米粒子
[0303]931a圆筒状的金属结构体
[0304]940覆盖玻璃
[0305]951,952 开口部
[0306]960导电性薄膜
[0307]1000，IOOOa纳米流路芯片
[0308]1010 基板
[0309]1020 流路
[0310]1030，1030a观察区域，测定区域
[0311]1031纳米粒子
[0312]1031a圆筒状的金属结构体
[0313]1040覆盖玻璃
[0314]1051,1052 开口部
[0315]1060导电性薄膜
[0316]1100多纳米孔芯片
[0317]1110 基板
[0318]1120,1121 纳米孔
[0319]1130a, 1130b, 1131a, 1131b 导电性薄膜
[0320]2000多解析装置
[0321]2010 2分割比率分光检测装置
[0322]8300试样单元
[0323]8310上部部件
[0324]8320下部部件
[0325]8330 O —环
[0326]8340试样用流路[0327]8341试样用连接端口
[0328]8350试样用流路
[0329]8351试样用连接端口
[0330]8360电极用流路
[0331]8361电极用连接端口
[0332]8370电极用流路
[0333]8371电极用连接端口。
【权利要求】
1.一种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备: 生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、设置于该固体基板的多个纳米孔、和配置于该固体基板的导电性薄膜，该导电性薄膜的至少一部分面向该纳米孔而设置， 光源和照射光学系统，其用于产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和 检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在特定的波长范围内以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器， 外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
2.一种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备: 生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、设置于该固体基板的多个纳米孔、和配置于该固体基板的导电性薄膜，该导电性薄膜的至少一部分面向该纳米孔而设置， 光源和照射光学系统，其用于产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光，和 检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在每个指定的波长带以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器， 外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
3.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述生物聚合物由至少4种单体构成，所述分离部对构成该生物聚合物的每种单体以透射光与反射光的强度比至少区分成4种的不同比率来分割光。
4.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，通过向所述导电性薄膜照射所述外部光，从而所述导电性薄膜在面向所述纳米孔的开口部的端部产生近场，产生进入到所述纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光。
5.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜具有锐角的端部，该锐角的端部面向所述纳米孔的开口部而配置。
6.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述特性解析芯片，每I个纳米孔具备至少2张导电性薄膜，该至少2张导电性薄膜夹着所述纳米孔的开口部而相互相对地配置。
7.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜由金属形成。
8.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜由石墨形成。
9.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述导电性薄膜的厚度为0.1nm~10nm。
10.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，在所述固体基板的所述纳米孔的中心轴方向的中间深度配置有所述导电性薄膜。
11.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述纳米孔的深度为构成生物聚合物的单体单元的3倍以上的大小。
12.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，还具备数据处理部，其由在所述检测装置中被检测到的拉曼散射光的光强度之比来解析生物聚合物的特性。
13.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，还具备试样移动机构，其使生物聚合物中的单体逐个单元地进入到所述纳米孔中。
14.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、和适体所组成的组。
15.根据权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置，所述生物聚合物的特性解析为核酸的碱基序列的确定。
16.一种生物聚合物的光学解析装置，其特征在于，具备: 生物聚合物的特性解析芯片，其具备固体基板、和配置于该固体基板表面的多对导电性薄膜，成对的该导电性薄膜以一定间隔相对地配置， 光源和照射光学系统，其用于产生生物聚合物的拉曼散射光， 检测装置，其具备拉曼散射光的聚光系统、将聚光的光在每个指定的波长带以不同的比率分割成透射光和反射光的分离部、将分割出的光成像于检测器的成像光学系统、和用于检测成像后的光的二维检测器， 外部光从所述光源和照射光学系统照射到所述特性解析芯片，该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光在所述检测装置中被检测。
17.—种生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，包括下述工序: 在权利要求1所述的生物聚合物的光学解析装置中，向特性解析芯片照射外部光，产生进入到纳米孔中的生物聚合物的拉曼散射光的工序， 在检测装置中检测所述拉曼散射光的工序，和 基于所述拉曼散射光的检测结果来解析生物聚合物的特性的工序。
18.根据权利要求17所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、和适体所组成的组。
19.根据权利要求17所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，确定核酸的碱基序列。
20.一种生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，是具备固体基板、和设置于所述固体基板的至少一个流路的生物聚合物的特性解析芯片，通过照射外部光，产生进入到所述流路中的生物聚合物的拉曼散射。
21.根据权利要求20所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述流路由导电性薄膜形成。
22.根据权利要求21所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述流路的至少I处形成具有尖锐端的突起形状，该突起形状相对于流路的行进方向而形成于流路的2个壁面中的任一个。
23.根据权利要求21所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述流路的至少2处形成具有尖锐端的突起形状，该突起形状相对于流路的行进方向而从流路的2个壁面相对地形成。
24.根据权利要求22或23所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述突起形状产生近场，使用所述近场而产生所述拉曼散射。
25.权利要求21所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述流路的至少I处，横断流路地固定有I列以上金属纳米粒子。
26.根据权利要求25所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述金属纳米粒子产生近场，使用所述近场而产生所述拉曼散射。
27.根据权利要求21所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述流路的至少I处，横断流路地固定有I列以上金属纳米结构体。
28.根据权利要求27所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述金属纳米结构体产生近场，使用所述近场而产生所述拉曼散射。
【文档编号】G01N21/65GK103582809SQ201280027201
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2011年6月3日
【发明者】高桥智, 隈崎修孝 申请人:株式会社日立高新技术