终点光学系统和使用方法

终点光学系统和使用方法
【专利摘要】用于检测连续流PCR系统中的光谱和空间信息的系统和方法。使用激光器发射电磁辐射的入射束。使用直线发生器从激光器接收入射束，并且将入射束转换为电磁辐射的入射直线。使用包括与PCR系统的一个或多个微通道流体联通的一个或多个透明管的管阵列从直线发生器接收入射直线。使用成像透镜从管阵列接收反射的电磁辐射，并且聚焦反射的电磁辐射。使用光谱仪从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射，并且从聚焦的反射的电磁辐射检测光谱强度。使用成像器从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射，并且检测光谱强度的位置。
【专利说明】终点光学系统和使用方法
【背景技术】
[0001]聚合酶链反应(PCR)系统或热循环仪通常包括样本块、加热盖、以及加热和冷却元件。然后这些部件由机载控制系统控制或监测。实时PCR系统或热循环仪通常还包括用于检测由附接至核酸样本的一个或多个探针发出的电磁辐射的光学检测系统。实时PCR系统还能够包括用于控制和监测系统部件并分析由光学检测系统产生的数据的外部计算机或控制系统。
[0002]当前标准PCR系统和实时PCR系统是基于孔的系统。这些系统接收在包括多个孔的样本支持设备中的样本。样本在载入PCR系统中之前制备或与试剂混合。然后PCR系统循环孔中样本的温度。另外，实时PCR系统为电磁或荧光发射监测孔中样本。
[0003]因为对遗传信息和基因组信息的使用和需求增大，所以对PCR扩增和分析的需求也增大了。具体地，改善PCR系统的生产能力已经变得越来越重要了。虽然每一代PCR系统能够略微更快地循环样本温度，但是该技术没有跟上其它遗传和基因组分析仪器的性能改进。例如，脱氧核糖核酸(DNA)测序仪器发展至样本制备和PCR扩增是对测序实验在时间和成本方面最具限制性的步骤的程度。
[0004]另外，当前PCR系统对基于孔的技术的依赖限制了这些系统的总生产能力。当前系统能够以大约40分钟循环样本的温度。因此，使用具有384个孔的最大的基于孔的样本支持设备所产生的最大总样本生产能力是大约每小时500个样本。而且，当前PCR系统接收已经在样本支持设备中制备或混合的样本。因此这些系统依赖于耗时且有时有人工步骤的基于孔的样本制备。

【发明内容】

[0005]提供一种用于检测连续流聚合酶链反应(PCR)系统中的光谱和空间信息的系统和方法。该系统包括激光器、直线发生器、管阵列、成像透镜、光谱仪、和成像器。该方法包括使用激光器、直线发生器、管阵列、成像透镜、光谱仪、和成像器的步骤。
[0006]在该系统和方法中，激光器发出电磁辐射的入射束。直线发生器从激光器接收入射束。直线发生器将入射束转换为电磁辐射的入射直线。管阵列从直线发生器接收入射直线。管阵列包括与PCR系统的一个或多个微通道流体相通的一个或多个透明管。成像透镜从管阵列接收反射的电磁辐射。成像透镜聚焦反射的电磁辐射。光谱仪从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射。光谱仪从聚焦的反射的电磁辐射检测光谱强度。最后，成像器从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射。成像器检测光谱强度的位置。
[0007]在各种实施方式中，处理器从光谱仪接收光谱强度并从成像器接收位置。然后处理器从光谱强度和位置为移动通过管阵列的样本确定强度值。
[0008]直线发生器能够包括但不限于鲍威尔透镜(Powell lens)或衍射直线发生器。在各种实施方式中，将一个或多个光学元件置于直线发生器与管阵列之间从而将入射直线从直线发生器引导至管阵列。在各种实施方式中，将一个或多个光学元件置于管阵列与成像透镜之间从而将反射的电磁辐射从管阵列引导至成像透镜。在各种实施方式中，镜子用于将入射直线从直线发生器引导至管阵列以及将反射的电磁辐射从管阵列引导至成像透镜二者。
[0009]在各种实施方式中，成像透镜包括具有可变孔径的宽光圈透镜。在各种实施方式中，成像透镜包括一个或多个滤光器。例如，该一个或多个滤光器从反射的电磁辐射去除入射直线的反射。在各种实施方式中，成像器包括电荷耦合装置(CCD)相机。
[0010]本教导的这些特征和其它特征在本文中提出。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]本领域的技术人员将理解的是，以下所述的图纸仅由于说明。图纸不是旨在以任何方式限制本教导的范围。
[0012]图1是示出计算机系统的框图，本教导的实施方式可以在该计算机系统上实施。
[0013]图2是示出用于高生产能力聚合酶链反应(PCR)扩增和分析的系统的示意图。
[0014]图3是示例性流程图，示出根据各种实施方式的用于高生产能力PCR扩增和分析的方法。
[0015]图4是系统示意图，该系统包括根据各种实施方式执行用于高生产能力PCR扩增和分析的方法的一个或多个不同软件模块。
[0016]图5是用于根据各种实施方式的连续流PCR系统的软件系统结构的示意图。
[0017]图6是示出根据各种实施方式的系统初始化方法的流程图。
[0018]图7是示出根据各种实施方式用于发布传输控制协议/互联网协议(TCP/IP)命令的方法的流程图。
[0019]图8是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第一部分的流程图。
[0020]图9是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第二部分的流程图。
[0021]图10是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第三部分的流程图。
[0022]图11是示出根据各种实施方式的系统关闭方法的流程图。
[0023]图12是示出根据各种实施方式用于处理错误的方法的流程图。
[0024]图13是根据各种实施方式的瓣阀敞开方法的示意图。
[0025]图14是根据各种实施方式的液体/板处理系统的示意图。
[0026]图15A-15F是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第一部分的流程图。
[0027]图16A-16B是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第二部分的流程图。
[0028]图17A-17B是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第三部分的流程图。
[0029]图18是示出根据各种实施方式用于液体处理初始化的方法的流程图。
[0030]图19A-19B是示出根据各种实施方式用于液体处理的方法的流程图。
[0031]图20是示出根据各种实施方式用于液体处理关闭的方法的流程图。
[0032]图21是示出根据各种实施方式的桥后方法之间关系的状态图。
[0033]图22是示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第一部分的流程图。
[0034]图23是示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第二部分的流程图。
[0035]图24是示出根据各种实施方式的桥后预运行方法的流程图。
[0036]图25是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第一部分的流程图。
[0037]图26是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第二部分的流程图。[0038]图27是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第三部分的流程图。
[0039]图28是示出根据各种实施方式的桥后运行结束方法的流程图。
[0040]图29是示出根据各种实施方式的桥后关闭方法的流程图。
[0041]图30是示出根据各种实施方式的托盘和定位路径点的示意图。
[0042]图31是示出根据各种实施方式文件如何在图形用户界面(GUI)与仪器之间传输的示意图。
[0043]图32是示出根据各种实施方式用于使用文件传输协议(FTP)服务器上传文件的方法的流程图。
[0044]图33是根据各种实施方式的用于在连续流PCR系统中检测光谱和空间信息的系统的侧视图的示意图。
[0045]图34是根据各种实施方式的用于检测连续流PCR系统中光谱和空间信息的系统的俯视图的不意图。
[0046]图35是根据各种实施方式的管阵列板的三维视图的示意图。
[0047]图36是根据各种实施方式的管阵列板的俯视图的示意图。
[0048]图37是根据各种实施方式的管阵列板的侧视图的示意图。
[0049]图38是示出根据各种实施方式的用于检测连续流PCR系统中光谱和空间信息的方法的流程图。
[0050]图39是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的软件模块的示意图。
[0051]图40是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的液体处理分系统管理程序软件模块的示意图。
[0052]图41是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的预扩增管理程序软件模块的示意图。
[0053]图42是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的桥后检测分系统软件模块的示意图。
[0054]图43是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的扩增后管理程序软件模块的示意图。
[0055]图43是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的扩增后管理程序软件模块的示意图。
[0056]图45是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的初级分析分系统软件模块的示意图。
[0057]图46是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的文件系统管理程序软件模块的示意图。
[0058]图47是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的流控制分系统管理程序软件模块的示意图。
[0059]图48是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的辅助分系统管理程序软件模块的示意图。
[0060]在对本教导的一个或多个实施方式进行详细描述之前，本领域的技术人员将理解的是，本教导在其应用中不限于在以下描述或者图中所示的构造、部件安排、和步骤细节。 而且，应理解的是，本文中所采用的词组和术语是出于描述的目的并不应视为限制性的。
【具体实施方式】
[0061]计算机实施系统
[0062]图1是示出计算机系统100的框图，本教导的实施方式可以在其上实施。计算机系统100包括用于交流信息的总线102或其它通信结构，以及与总线102联接以处理信息的处理器104。计算机系统100还包括存储器106，存储器106可以是随机存取存储器(RAM)或其它动态储存装置，存储器106联接至总线102，用于确定将由处理器104执行的指令和库调用。存储器106还可以用于在执行将由处理器104执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算机系统100还包括联接至总线102并用于为处理器104存储静态信息和指令的只读存储器(ROM) 108或其它静态存储设备。诸如磁盘或光盘的存储设备110提供并联接至总线102，用于存储信息和指令。
[0063]计算机系统100可以通过总线102联接至用于向计算机使用者显示信息的显示器112，诸如电子射线管(CRT)或液晶显示器(IXD)。包括字母数字键和其它键的输入设备114联接至总线102，用于将信息和命令选择交流至处理器104。另一类型的使用者输入设备是光标控制装置116，诸如鼠标、轨迹球和光标方向键，用于将方向信息和命令选择交流至处理器104，并用于控制光标在显示器112上的移动。该输入设备通常在两个轴线(第一轴线(SP，x)和第二轴线(即，y)>上具有两个自由度，允许该设备在平面上指定位置。
[0064]计算机系统100能够执行本教导。与本教导的某些实施一致，结果由计算机系统100响应于处理器104执行包含在存储器106中的一个或多个指令的一个或多个序列而提供。这种指令可以从另一计算机可读介质读入存储器106，诸如存储设备110。包含在存储器106中的指令序列的执行导致处理器104执行本文中所述的过程。可替代地，硬连线电路可以用于替代软件指令或者与软件指令结合从而实施本指导。因此，本指导的实施不限于任何具体的硬件电路和软件。
[0065]本文中所使用的术语“计算机可读介质”指参与为执行向处理器104提供指令的任何介质。这种介质可以采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质、和传输介质。非易失性介质包括例如光盘或磁盘，诸如存储设备110。易失性介质包括动态存储器，诸如存储器106。传输介质包括同轴电缆、铜线、和光纤，包括构成总线102的电线。
[0066]普通形式的计算机可读介质包括，例如，软盘、软磁盘、硬盘、磁带、或任何其它磁性介质、CD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片、纸带、任何其它带孔图案的物理介质、随机存取存储器(RAM)、可编程只读存储器(PR0M)、和可擦可编程只读存储器(EPR0M)、快闪可擦可编程只读存储器(FLASH-EPR0M)、任何其它存储器片或存储器盒、或任何其它计算机能够从中读取的有形介质。
[0067]各种形式的计算机可读介质可以涉及用于将一个或多个指令的一个或多个序列传递至处理器104执行。例如，指令最初可以在远程计算机的磁盘中。该远程计算机能够将指令加载至其动态存储器中，并通过使用调制解调器的电话线发送指令。计算机系统100的本地调制解调器能够接收在电话线上的数据，并使用红外发射器将数据转换为红外信号。联接至总线102的红外检测器能够接收红外信号中传递的数据并将数据置于总线102上。总线102将数据传递至存储器106，处理器104从存储器106取回并执行指令。由存储器106接收的指令可以可选择地存储在存储设备110中，或者在由处理器104执行之前，或者在由处理器104执行之后。
[0068]根据各种实施方式，配置成由处理器执行以执行方法的指令存储在永久且有形的计算机可读介质。该计算机可读介质可以是存储数字信息的设备。例如，计算机可读介质包括本领域中众所周知用于存储软件的光盘只读存储器(⑶-ROM)。计算机可读介质由适于执行配置成进行执行的指令的处理器访问。
[0069]本教导各种实施的以下描述已为说明和描述提出。该描述不是无遗漏的并且不会将本教导限于公开的确切形式。鉴于以上教导或者可以从本教导的实践中可能获得修改和变更。此外，所述实施包括软件，但是本教导可以作为硬件和软件结合或者单独以硬件实施。本教导可以用面向对象程序系统和非面向对象的程序系统二者实施。
[0070]数据处理的系统和方法
[0071]连续流PCR系统
[0072]如上所述，当前聚合酶链反应(PCR)系统对基于孔的技术的依赖能够限制这些系统的总生产能力。而且，当前PCR系统接收已经在样本支持设备中制备或混合的样本。因此，这些系统依赖耗时且有时存在基于孔的样本制备的手动步骤样本。
[0073]在各种实施方式中，使用了用于连续流PCR扩增和分析的系统的方法。这些系统和方法显著提高了 PCR实验的样本生产能力并减少了由基于孔的技术施加的限制。具体地，用于连续流PCR的系统和方法通过将样本制备步骤纳入PCR过程基本上排除了该步骤。
[0074]图2是根据各种实施方式示出用于高生产能力PCR扩增和分析的系统200的示意图。系统200包括PCR系统210和处理器220。PCR系统210进而包括液体处理系统230、流体抽吸系统240、桥后检测系统250、热循环仪260、和终点检测系统270。
[0075]处理器220与PCR系统210相通。处理器220能够包括但不限于计算机、微处理器、微控制器、特定用途集成电路(ASIC)、或者能够执行指令以及发送和接收数据或控制通信的任何设备。
[0076]处理器220指示液体处理系统230为PCR实验获取多个样本和多个试剂。在各种实施方式中，处理器220指不液体处理系统230用移液管从位于液体处理系统230的托盘231上的第一样本支持设备(未示出)吸取样本、用移液管从位于液体处理系统230的托盘232上的第二样本支持设备(未示出)吸取化验试剂、以及用移液管从容器233吸取优质混合物(master mix)试剂。
[0077]在各种实施方式中，样本支持设备可以是具有多个样本区域的玻璃或塑料滑动件。样本支持设备的一些示例可以包括但不限于多孔板，诸如标准微量滴定96孔、384孔板、或缩微卡、或者基本上平面的支承，诸如玻璃或者塑料滑动件。在各种实施方式中样本支持设备的样本区域可以包括凹陷、凹处、隆起线、及其结合，以规则或不规则排列在基质的表面上形成图案。
[0078]处理器220指示流体抽吸系统240保持通过多个微通道的输送流体的连续流。输送流体或油是用于围绕系统200输送样本的被动缓冲液。图2示出多个微通道的单个微通道。该单个微通道或管包括引流线路241和热循环仪线路242。引流线路241用于排出多余的输送流体并且以恒定低速保持通过微通道的输送流体的连续流。热循环仪线路242用于输送混合样本通过系统200。[0079]为了从液体处理系统230接收多个样本和多个试剂作为多个微通道中的微滴，处理器220指示流体抽吸系统240保持输送流体的连续流。通过流体抽吸系统240的输送流体的连续流通过流体抽吸系统240的线路245从液体处理系统230的尖端235将样本微滴吸上来。同样地,通过流体抽吸系统240的输送流体的连续流通过流体抽吸系统240的线路246从液体处理系统230的尖端236将化验试剂微滴吸上来并且从液体处理系统230的尖端237通过流体抽吸系统240的线路247将优质混合物试剂微滴吸上来。
[0080]而且，输送流体的连续流通过流体抽吸系统240使用多个微通道的几何结构引起多个样本和多个试剂混合。这导致多个微通道中的多个混合样本。例如，引起多个样本和多个试剂混合的微通道的几何结构是微通道的接合点或者液桥。
[0081]接合点249是用于为单一微通道混合样本和试剂的不例性液桥。线路245、246、和247在接合点249相会。通过精确的定时控制，处理器220指示液体处理系统230在特定时间使用尖端235、236、和247选择样本、化验试剂、和优质混合物微滴，使得流体抽吸系统240同时将这些微滴吸引至接合点249。因为样本、化验试剂、和优质混合物微滴同时到达接合点249，所以它们在随输送流体的连续流移动混合。混合物产生混合样本微滴。该混合样本微滴离开接合点249并进入热循环仪线路242。该混合样本微滴继续以恒定流速在热循环仪线路242中随输送流体的连续流移动。
[0082]为了确定是否每个混合样本微滴都正确混合，处理器220针对为多个混合样本微滴中的每个混合样本微滴从桥后检测系统250接收一个或多个桥后检测值。桥后检测系统250，例如，在热循环仪线路242中以处理器220选择的精确时间步骤检测的混合样本微滴。在各种实施方式中，桥后检测系统250是光学系统,该光学系统包括一个或多个照明光源和一个或多个相机。在各种实施方式中，使用一个相机且一个或多个桥后检测值包括由每个混合样本微滴吸收或反射的电磁辐射的强度。
[0083]在各种实施方式中，桥后检测系统250使用三个相机。那么由处理器220接收的一个或多个桥后检测值包括由每个混合样本微滴的样本的第一染料发出的电磁辐射的第一强度、由每个混合样本微滴的化验试剂的第二染料发出的电磁辐射的第二强度、由每个混合样本微滴的优质混合物试剂的第三染料发出的电磁福射的第三强度。在各种实施方式中，一个或多个桥后检测值还包括混合样本微滴的时间戳，所以处理器能够确定用于生成混合样本微滴的样本和试剂。
[0084]在各种实施方式中，如果处理器220从一个或多个桥后检测值确定该混合样本微滴混合不正确，那么处理器220指示液体处理系统230对混合样本微滴的样本和化验试剂再次取样。换言之，如果处理器220确定混合样本微滴的一个或多个桥后检测值不表不合适的混合物，那么处理器指示液体处理系统230对用于生成混合样本微滴的样本和试剂再次取样。
[0085]在多个混合样本微滴中的混合样本微滴由桥后检测系统250分析后，该混合样本微滴移动至热循环仪260。处理器220指示热循环仪260为了循环在多个微通道中的多个混合样本微滴的温度而保持一个或多个温度。在各种实施方式中，热循环仪260包括被命令为保持两个或更多温度的两个或更多加热和冷却元件。因为每个混合样本微滴在两个或更多加热和冷却元件之间移动，所以混合样本微滴的温度进行循环。
[0086]最后，处理器220为多个混合样本微滴中的每个混合样本微滴从终点检测系统270接收一个或多个终点检测值。处理器220使用一个或多个终点检测值分析PCR实验。在各种实施方式中，终点检测系统270也是光学检测系统。例如，终点检测系统270是确定空间和光谱信息二者的超光谱成像系统。因此，在各种实施方式中，一个或多个终点检测值包括微通道的位置以及从该微通道检测到的光谱强度值。微通道的位置允许处理器220确定混合样本微滴，而检测到的光谱强度值提供PCR实验的结果衡量标准。
[0087]图3是示例性流程图，示出根据各种实施方式的用于高生产能力PCR扩增和分析的方法。
[0088]在方法300的步骤310中，使用处理器指示PCR系统的液体处理系统为PCR实验获取多个样本和多个试剂。
[0089]在步骤320中，使用处理器指示PCR系统的流体抽吸系统保持通过多个微通道的输送流体的连续流。该连续流允许流体抽吸系统从液体处理系统接收在多个微通道中微滴的多个样本和多个试剂。该连续流还允许流体抽吸系统使用多个微通道的几何结构混合多个样本和多个试剂。混合多个样本和多个试剂在多个微通道中产生多个混合样本微滴。
[0090]在步骤330中，用处理器为多个混合样本微滴中每个混合样本微滴从PCR系统的桥后检测系统接收一个或多个桥后检测值从而确定每个混合样本微滴是否正确混合。
[0091]在步骤340中，使用处理器命令PCR系统的热循环仪保持一个或多个温度以使在多个微通道中的多个混合样本微滴的温度循环。
[0092]在步骤350中，使用处理器针对多个混合样本微滴中每个混合样本微滴从PCR系统的终点检测系统接收一个或多个终点检测值以分析PCR实验。
[0093]在各种实施方式中，计算机程序产品包括非暂时性和有形的计算机可读存储介质，该存储介质的内容包括具有在处理器上执行的指令从而用于高生产能力PCR扩增和分析执行方法的程序。该方法由包括一个或多个不同软件模块的系统执行。
[0094]图4是系统400的示意图，系统400包括根据各种实施方式执行用于高生产能力PCR扩增和分析的方法的一个或多个不同软件模块。系统400包括液体处理模块410、流体抽吸模块420、桥后检测模块430、热循环仪模块440、和终点检测模块450。
[0095]液体处理模块410指示PCR系统的液体处理系统为PCR实验获取多个样本和多个试剂。
[0096]流体抽吸模块420指示PCR系统的流体抽吸系统保持通过多个微通道的输送流体的连续流。该连续流允许流体抽吸系统从液体处理系统以多个微通道中的微滴接收多个样本和多个试剂。该连续流还允许流体抽吸系统使用多个微通道的几何结构混合多个样本和多个试剂。混合多个样本和多个试剂在多个微通道中产生多个混合样本微滴。
[0097]桥后检测模块430针对多个混合样本微滴中每个混合样本微滴从PCR系统的桥后检测系统接收一个或多个桥后检测值从而确定每个混合样本微滴是否正确混合。
[0098]热循环仪模块440指示PCR系统的热循环仪保持一个或多个温度以使多个微通道中的多个混合样本微滴的温度循环。
[0099]终点检测模块450针对多个混合样本微滴中每个混合样本微滴从PCR系统的终点检测系统接收一个或多个终点检测值从而分析PCR实验。
[0100]示例件连续流PCR系统
[0101]示例性连续流PCR系统是能够同时从优质混合物、样本以及原始物(primer) /探针采样并且在微通道几何结构(液桥)中混合这些样本的连续流96线路PCR仪器。混合微滴向下游流至对其进行扩增的热循环仪。然后该微滴通过测量其荧光强度的数据采集系统。
[0102]为了能够进行系统操作，具有以下软件控制元件:流体抽吸系统、液体处理/板处理系统、桥后检测、热循环仪、终点检测、和辅助设备。流体抽吸系统包括五个流量传感器、五个泵和多于40个的水平传感器和阀。液体处理/板处理系统包括板堆叠装置、条码阅读器、和15轴线采样单元。桥后检测包括三个巴斯勒(Basler)相机。热循环仪包括每个都具有独立变性块的四个24线路温度控制热循环仪(TC )。终点检测包括一个滨松(Hamamatsu )Orca相机和一个激光器。
[0103]图5是用于根据各种实施方式的连续流PCR系统的软件系统结构的示意图。
[0104]图6是示出根据各种实施方式的系统初始化方法的流程图。
[0105]图7是示出根据各种实施方式用于发布传输控制协议/互联网协议(TCP/IP)命令的方法的流程图。
[0106]图8是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第一部分的流程图。
[0107]图9是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第二部分的流程图。
[0108]图10是示出根据各种实施方式用于发布运行命令的方法的第三部分的流程图。
[0109]图11是示出根据各种实施方式的系统关闭方法的流程图。
[0110]图12是示出根据各种实施方式用于处理错误的方法的流程图。
[0111]流体抽吸系统
[0112]再次参照图2，系统200在连续流原则下操作。恒定油流通过热循环仪(TC线路242)保持并且该油流输送混合微滴。为了满足生产能力要求，要求液桥上游(从采用尖端至桥)的流比通过热循环仪流快。引流线路241安装至桥并放出多余的油。TC线路242和二者都以固定流速操作。要求这些线路在增加至线路的微滴沿每个线路提高压降时受控。在TC线路242和引流线路241中的混合流等于优质混合物、样本和原始物-探针线路中的流。
[0113]此外，该抽吸系统包括一些分系统，这些分系统用于使该系统充油并放掉空气。图2示出总示意图(单一线路系统)，示出TC线路242、引流线路241以及硬件部件所在之处。
[0114]护套
[0115]如果PCR系统在连续流下操作，穿过空气从孔至孔移动系统会导致将空气吸入系统中。这一点通过使用护套/瓣阀避免。这些口径较大的管围绕采样管并且将其包在油中。在护套中的油连续流(由三个独立的护套泵驱动)与吸入系统的流相匹配(或稍超出)，确保连续流线路总是包裹在油中。因此，尖端能够在不将任何空气吸入系统的情况下从孔至孔自由移动。
[0116]液体处理/换板
[0117]图13是根据各种实施方式的瓣阀敞开方法1300的示意图。为了便于使用瓣阀/护套(在能够进行采样之前需要敞开)，尖端安装在双Z轴线上。第二次级轴线1320安装在初级轴线1310上。护套/瓣阀安装在初级轴线1310上，而尖端安装在次级轴线1320上。
[0118]在方法1300的步骤I中，机器头在空气中移动至所需孔上方。
[0119]在步骤2中，初级轴线1310使尖端(护套和次级轴线1320)降低并进入每个孔中覆盖样本的油覆盖层。
[0120]在步骤3中，然后次级轴线1320延伸尖端(推开阀)，使尖端位于样本之上。同时，初级轴线1310升高相等距离。合起来的效果是次级轴线1320空间静止，而初级轴线1310向上移动。与瓣阀的几何结构相结合，该移动允许在每个(96孔板)孔中使用额外的30μ I样本。
[0121]在步骤4中，次级轴线1320进一步降低至孔中并完成瓣阀的开启。次级轴线1320暂停直至触发采样。
[0122]在步骤5中，在所要求的精确时间下，次级轴线1320浸入流体中并且将75nl流体(样本/原始物-探针、优质混合物物，大约150nl)吸上来。所吸取的流体数量取决于所采用的流速和尖端在流体中的时间。 [0123]在步骤6中，然后尖端从样本中缩回并且暂停以准备再次采样(如果需要)。如果下一样本需要从邻近孔(或换板)采样，则尖端缩回护套中，然后初级轴线1310将采样头移出至空气中。带套运动与出套运动相反。
[0124]图14是根据各种实施方式的液体/板处理系统1400的示意图。在系统1400中，液体/板处理提供沿15轴线的运动。作为参考，系统1400分为三个采样系统和一个板处理系统。每个阶段的动作方向由箭头示出。注意示出的是多腔单元的采样臂。但是，为了清晰，优质混合物单元和单尖端单元的采样臂被描绘为不可见。另外，优质混合物单元安装在外壳的顶部。单个轴线为:
[0125].单尖端采样
[0126]ο X 轴
[0127]O Y 轴
[0128]ο 初级 Z 轴(Zl)
[0129]ο 次级 Z 轴(Ζ2)
[0130].多腔采样
[0131]ο X轴
[0132]O Y 轴
[0133]ο 初级 Z 轴(Zl)
[0134]ο 次级 Z 轴(Ζ2)
[0135]ο旋转轴
[0136]?优质混合物采样
[0137]ο X 轴
[0138]ο 初级 Z 轴(Zl)
[0139]ο 次级 Z 轴(Ζ2)
[0140].板处理
[0141]O Y轴
[0142]Q Xl轴(托盘1-单尖端)
[0143]0X2轴(托盘2-多腔)
[0144]单尖端系统包括96个尖端，每个尖端能够进入96孔板或者384孔板上的单一孔。因此系统1400能够以单次移动中从96孔板采样或者在四次移动中从384孔板采样。多腔系统包括4束24尖端。每束中的全部24线路能够进入单一孔。束中的每个线路对单尖端线路中的一个排列一在桥中汇合，然后流入热循环仪。多腔头安装在旋转单元上。因此，通过四个旋转以及浸入，在托盘2 (多腔侧)上的四个孔能够对整个96孔板排列。同样地，16个机器人的移动(四个多腔旋转乘以四个单尖端移动)能够允许在托盘2上的四个孔能够对整个384孔板排列。
[0145]图15A-15F是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第一部分的流程图。
[0146]图16A-16B是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第二部分的流程图。
[0147]图17A-17B是示出根据各种实施方式用于板堆叠的方法的第三部分的流程图。
[0148]图18是示出根据各种实施方式用于液体处理初始化的方法的流程图。
[0149]图19A-19B是示出根据各种实施方式用于液体处理的方法的流程图。
[0150]图20是示出根据各种实施方式用于液体处理关闭的方法的流程图。
[0151]微滴编组
[0152]离开液桥的微滴流分为多个包(根据机器人取得一个样本的时间戳)。处于方便，这些包称为微滴编组(carriages)。使用编组一编组之间的间隔至少是微滴之间间隔的两倍一使个体液体的确定更简单，并且事实上使微滴流中错误易于确定。例如，编组2的微滴2(每个编组5个微滴)可以比连续流的微滴12更易于确定。同样地，错误也能轻松地确定。如果在5个液体的编组中只有4个微滴，那么很明显发生了错误；如果出现6个，那么一个微滴未混合或者已混合然后分为两个微滴。
[0153]图21是示出根据各种实施方式的桥后方法之间关系的状态图。
[0154]图22是示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第一部分的流程图。
[0155]图23是示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第二部分的流程图。
[0156]图24是示出根据各种实施方式的桥后预运行方法的流程图。
[0157]图25是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第一部分的流程图。
[0158]图26是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第二部分的流程图。
[0159]图27是示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第三部分的流程图。
[0160]图28是示出根据各种实施方式的桥后运行结束方法的流程图。
[0161]图29是示出根据各种实施方式的桥后关闭方法的流程图。
[0162]桥后检测
[0163]桥后检测系统包括一排蓝色发光二极管(LED)，从桥(在液桥与热循环仪之间)照明输出线路。三个相机(Basler)用于监测由蓝色LED激发的三个荧光波长。这些组分是加至样本中做为参照的第三染料(即，ALEXA)、原始物-探针中的FAM/VIC、以及优质混合物物中的R0X。如果检测系统从微滴识别全部三个波长，那么该微滴被视为混合且有效的微滴。但是，在一些情况下，桥不会正确混合微滴。这一点通过确定主要微滴中缺少一个或多个组分。在单一微滴(或编组)发生错误的情况下，那么该微滴(或者整个编组)将再次采样。
[0164]热循环仪
[0165]热循环仪包括4个24线路热循环仪。在每个块之前具有预热块。每个块采用比例积分微分(PID)控制保持在其设定点。
[0166]终点检测和分析
[0167]终点检测包括自由空间光谱仪系统。采集硬件是滨松Orca相机。96个热循环仪线路由488nm激光线示出。该激光线由光谱仪/相机成像并且转变为其组成波长。适当的波长根据微滴的内容测量。微滴根据由桥后检测模块产生的时间戳确定，而原始荧光数据为微滴产生。然后施加光谱补偿从而为渗滤染料进行补偿。
[0168]文件输入/输出
[0169]PCR仪器采用两个不同的ASCII, csv文件驱动。该命令文件以BARC0DETRAY1_BARC0DETRAY2_cmds.csv 的格式命名，而体积文件(volume file)命名为 BARC0DETRAY1_vols.csv0命令文件包括一系列由该仪器采样的孔组合。体积文件包括关于板上每个孔的内容(体积和组分)的信息。在收到RUN命令后，该仪器读取每个存在板的条形码。该仪器搜索匹配的命令和体积文件，并且如果存在，处理该项目。结果以BARC0DETRAY1_BARC0DETRAY2_rslts.csv 的格式输出。
[0170]图30是示出根据各种实施方式的托盘和定位路径点的示意图。在图30中，示出液体路径点PI至P6。托盘Tl和T2 二者能够进入全部6个路径点。例如，PI和P6未使用。P2用于条形码阅读。P3用于上堆叠/下堆叠至板更换装置上的栈I中。P4以与栈2类似的方式使用。P5由机器人使用进行加载以及卸载板。
[0171]图形用户界面(⑶I)
[0172]例如，样本和试剂孔的矩阵由实验室信息管理系统提供至连续流PCR仪器。在各种实施方式中，样本和试剂孔的矩阵通过Gn输入。CTI和该仪器互相作用以控制板堆叠装置，还用于传输文件。为了传输文件，使用文件传输协议(FTP)设置。有用于存储文件以及等待客户端连接的FTP服务器。⑶I作为客户端以连接至FTP服务器并传输文件。该仪器也能够连接至同一 FTP服务器并传输文件。
[0173]为了控制板堆叠装置，使用传输控制协议(TCP)界面。该仪器充当服务器并且等待⑶I连接至该仪器。在建立连接后，预先定义的TCP命令发出并由该仪器接收以控制该仪器。
[0174]图31是示出根据各种实施方式文件如何在图形用户界面(GUI)与仪器之间传输的示意图。命令文件和体积文件能够使用⑶I生成和修改。然后这些文件传输至该仪器。文件使用FTP服务器进行传输。
[0175]图32是示出根据各种实施方式用于使用文件传输协议(FTP)服务器上传文件的方法的流程图。为了上传文件，⑶I发送TCP命令至仪器，要FTP服务器的地址。一旦仪器已回应该信息，⑶I连接至仪器并上传文件。如果该文件已经存在于FTP服务器上，那么将询问使用者是否想保存该文件或者覆盖该文件。
[0176]为了下载文件，⑶I发送TCP命令至仪器，要FTP服务器的地址。一旦仪器已回应该信息，⑶I连接至仪器并显示可以下载文件的列表。使用者旋转文件，然后⑶I将其下载至本地计算机的预定义位置。
[0177]板堆叠装置允许仪器使用者同时加载多个板，并且在不必单独明确地加载和运行每个板组合的情况下运行这些板。该堆叠装置分为两个隔间。每个隔间都装满板。在运行时间，使用者告知⑶I运行哪个组合。Gn不知道哪些板在堆叠装置中。通过一系列TCP命令指示仪器在堆叠装置和仪器之间适当的传输并且为板编制条形码，GUI能够指示仪器运行所有选择的组合。
[0178]在各种实施方式中，命令文件例如是定义板之间孔组合的文件。FTP服务器是文件储存库。FTP服务器能够与⑶I和仪器通讯。⑶I向仪器发送命令并且生成能够存储在FTP服务器上的文件。仪器运行板、从⑶I接收命令、以及与FTP服务器互动。板堆叠装置是仪器保存将在仪器上运行的板的组件。TCP允许在网络上发送信息的协议。TCP在⑶I与仪器之间使用。体积文件是定义板的文件。体积文件包括板条形码、板类型、和孔的体积。
[0179]终点检测系统
[0180]为了维持连续流PCR系统的高生产能力，PCR系统需要能够同时检测两个或更多微通道内的荧光。跨两个或更多微通道测量荧光对终点检测系统施加了许多限制。
[0181]例如，因为微通道的数量增加，检测器的视野也需要增大。这些微通道能够紧密地捆绑或者对齐在仪器在一排透明的微通道或管中。但是必须在管之间保持一定厚度的壁以防止相邻微通道之间的串扰。结果，检测器的视野是管直径以及管阵列壁厚的函数。为了保持在管阵列边缘上的管的高荧光采集效率，能够采用增大的束长度。但是，增大从管阵列至检测器的束长度增大了终点检测系统的整体外形尺寸。
[0182]另外，激光器是用于荧光测量的典型照度源。激光器梁的功率分布是高度不均匀的。该功率分布通常服从高斯分布，并以指数方式落下轴线。但是，连续流PCR系统的扩增系统需要具有均匀功率分布的照度源，从而照亮管阵列的全部宽度。
[0183]最后，因为样本流在管阵列中是连续的，PCR系统必须能在单个时间步骤中从两个或更多微通道检测光谱信息。但是，为了将那个光谱信息分配至正确的样本，发出那个光谱信息的具体管需位于该管阵列中。结果，除光谱信息之外，终点检测系统需要提供空间信肩、O
[0184]图33是根据各种实施方式的用于在连续流PCR系统中检测光谱和空间信息的系统3300的侧视图的示意图。系统3300包括激光器3310、直线发生器3320、管阵列3330、成像透镜3340、光谱仪3350、和成像器3360。激光器3310发出电磁辐射3311的入射束。
[0185]直线发生器3320从激光器3310接收入射束3311。直线发生器3320将入射束3311转换至电磁辐射3321的入射直线。换言之，直线发生器3320将入射束3311的功率分布从不均匀分布转换为均匀分布。例如，直线发生器3320是鲍威尔透镜(Powell lens)。在各种实施方式中，直线发生器3320是衍射直线发生器。
[0186]管阵列3330从直线发生器3320接收入射直线3321。管阵列3330包括与PCR系统的一个或多个微通道流体相通的一个或多个透明管。在各种实施方式中，一个或多个光学元件3322置于直线发生器3320与管阵列3320之间，从而将入射直线3321从直线发生器3320引导至管阵列3330。如图33所示，例如，一个或多个光学元件3322允许将系统3300包装在总体较小的体积中。在各种实施方式中，镜3325也置于直线发生器3320与管阵列3330之间从而将入射直线3321从直线发生器3320引导至管阵列3330。例如，镜3325允许管阵列3330在系统3300中水平放置。
[0187]成像透镜3340从管阵列3330接收反射的电磁辐射3331并且聚焦反射的电磁辐射3331。在各种实施方式中，一个或多个光学兀件(未不出)置于管阵列3330与成像透镜3340之间以将反射的电磁辐射3331从管阵列3330引导至成像透镜3340。在各种实施方式中，镜3325置于管阵列3330与成像透镜3340之间以将反射的电磁福射3331从管阵列3330引导至成像透镜3340。例如，成像透镜3340是具有可变孔径的宽光圈透镜。在各种实施方式中，成像透镜3340包括一个或多个滤光器(未不出)。例如，该一个或多个滤光器从反射的电磁辐射3331去除入射直线3321的反射。
[0188]光谱仪3350从成像透镜3340接收聚焦的反射的电磁辐射(未示出)。光谱仪3350从聚焦的反射的电磁辐射检测光谱强度。例如，光谱仪3350能够检测在400纳米与800纳米之间的光谱波长。
[0189]成像器3360从成像透镜3340接收聚焦的反射的电磁辐射。成像器3360检测光谱强度的位置。例如，成像器3360是CXD相机。
[0190]在各种实施方式中，系统3300还包括处理器(未示出)。该处理器从光谱仪3350接收光谱强度并从成像器3360接收位置。该处理器从光谱强度和位置为移动穿过管阵列3330的样本确定强度值。
[0191]图34是根据各种实施方式的用于检测连续流PCR系统中光谱和空间信息的系统3400的俯视图的不意图。
[0192]图35是根据各种实施方式的管阵列板的三维视图的示意图。
[0193]图36是根据各种实施方式的管阵列板的俯视图的示意图。
[0194]图37是根据各种实施方式的管阵列板的侧视图的示意图。
[0195]图38是示出根据各种实施方式的用于检测连续流PCR系统中光谱和空间信息的方法3800的流程图。
[0196]在方法3800的步骤3810中，使用激光器发出电磁辐射的入射束。
[0197]在步骤3820中，使用直线发生器从激光器接收入射束，并且将入射束转换为电磁辐射的入射直线。
[0198]在步骤3830中，使用包括与PCR系统的一个或多个微通道流体相通的一个或多个透明管的管阵列从直线发生器接收入射直线。
[0199]在步骤3840中，使用成像透镜从管阵列接收反射的电磁辐射，并且聚焦反射的电磁辐射。
[0200]在步骤3850中，使用光谱仪从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射，并且从聚焦的反射的电磁辐射检测光谱强度。
[0201]在步骤3860中，使用成像器从成像透镜接收聚焦的反射的电磁辐射，并且检测光谱强度的位置。
[0202]连续流PCR系统的软件模块
[0203]图39是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的软件模块的示意图。
[0204]图40是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的液体处理分系统管理程序软件模块的示意图。
[0205]图41是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的预扩增管理程序软件模块的示意图。
[0206]图42是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的桥后检测分系统软件模块的示意图。
[0207]图43是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的扩增后管理程序软件模块的示意图。
[0208]图44是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的终点检测分系统软件模块的示意图。
[0209]图45是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的初级分析分系统软件模块的示意图。
[0210]图46是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的文件系统管理程序软件模块的示意图。
[0211]图47是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的流控制分系统管理程序软件模块的示意图。
[0212]图48是示出根据各种实施方式用于高生产能力PCR扩增和分析的系统中由系统控制器执行的辅助分系统管理程序软件模块的示意图。
[0213]虽然本教导连同各种实施方式进行了描述，但是目的不是将本教导限制在这种实施方式上。相反,本教导包含将由本领域技术人员理解的各种替代物、修改、和等同物。
[0214]而且，在描述各种实施方式时，该说明书可能已经提供了作为具体步骤顺序的方法和/或过程。但是，所提供的程度是该方法或过程不依赖本文中提出的具体步骤顺序，该方法或过程不应限于所述的具体步骤顺序。因为本领域的技术人员会理解，其它的步骤是可能的。因此，在本说明书中提出的具体步骤顺序不应解释为对权利要求的限制。另外，关于方法和/或过程的权利要求不应限于以所写顺序对其步骤的执行，而且本领域的技术人员能容易地理解的是，顺序可以转换并且依然落在各种实施方式的精神和范围内。
【权利要求】
1.用于检测连续流聚合酶链反应(PCR)系统中的光谱和空间信息的系统，包括: 激光器，用于发射电磁福射的入射束； 直线发生器，从所述激光器接收所述入射束并将所述入射束转换为电磁辐射的入射直线.管阵列，包括与所述PCR系统的一个或多个微通道流体联通的一个或多个透明管并且从所述直线发生器接收所述入射直线； 成像透镜，从所述管阵列接收反射的电磁辐射并且聚焦被反射的电磁辐射； 光谱仪，从所述成像透镜接收被聚焦的被反射的电磁辐射并且从被聚焦的被反射的电磁辐射检测光谱强度；以及 成像器，从所述成像透镜接收被聚焦的被反射的电磁辐射并且检测所述光谱强度的位置。
2.如权利要求1所述的系统，还包括处理器，所述处理器从所述光谱仪接收所述光谱强度，从所述成像器接收所述位置，并从所述光谱强度和所述位置为移动穿过所述管阵列的样本确定强度值。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述直线发生器包括鲍威尔透镜。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述直线发生器包括衍射直线发生器。
5.如权利要求1所述的系统，还包括位于所述直线发生器与所述管阵列之间的一个或多个光学元件，所述一个或多个光学元件用于将所述入射直线从所述直线发生器引导至所述管阵列。
6.如权利要求1所述的系统，还包括位于所述管阵列与所述成像透镜之间的一个或多个光学元件，所述一个或多个光学元件用于将被反射的电磁辐射从所述管阵列引导至所述成像透镜。
7.如权利要求1所述的系统，还包括镜子，所述镜子用于将所述入射直线从所述直线发生器引导至所述管阵列以及将被反射的电磁辐射从所述管阵列引导至所述成像透镜。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述成像透镜包括具有可变孔径的宽光圈透镜。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述成像透镜包括一个或多个滤光器。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述一个或多个滤光器从被反射的电磁辐射中去除所述入射直线的反射。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述成像器包括电荷耦合装置(CXD)相机。
12.用于检测连续流聚合酶链反应(PCR)系统中的光谱和空间信息的方法，所述方法包括: 使用激光器发出电磁辐射的入射束； 使用直线发生器从所述激光器接收所述入射束并且将所述入射束转换为电磁辐射的入射直线； 使用包括与PCR系统的一个或多个微通道流体联通的一个或多个透明管的管阵列从所述直线发生器接收所述入射直线； 使用成像透镜从所述管阵列接收被反射的电磁辐射并且聚焦被反射的电磁辐射；使用光谱仪从所述成像透镜接收被聚焦的被反射的电磁辐射并且从被聚焦的被反射的电磁辐射检测光谱强度；以及使用成像器从所述成像透镜接收被聚焦的被反射的电磁辐射并且检测所述光谱强度的位置。
13.如权利要求12所述的系统，还包括处理器，所述处理器从所述光谱仪接收所述光谱强度，从所述成像器接收所述位置，并从所述光谱强度和所述位置为移动穿过所述管阵列的样本确定强度值。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述直线发生器包括鲍威尔透镜。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述直线发生器包括衍射直线发生器。
16.如权利要求12所述的方法，还包括在所述直线发生器与所述管阵列之间的一个或多个光学元件，所述一个或多个光学元件将所述入射直线从所述直线发生器引导至所述管阵列。
17.如权利要求12所述的方法，还包括在所述管阵列与所述成像透镜之间的一个或多个光学元件，所述一个或多个光学元件用于将被反射的电磁辐射从所述管阵列引导至所述成像透镜。
18.如权利要求12所述的方法，还包括镜子，所述镜子用于将所述入射直线从所述直线发生器引导至所述管阵列以及将被反射的电磁辐射从所述管阵列引导至所述成像透镜。
19.如权利要求12所述的方法，其中所述成像透镜包括具有可变孔径的宽光圈透镜。
20.如权利要求12所述的方法，其中所述成像透镜包括一个或多个滤光器。
21.如权利要求20所述的系统，其中所述一个或多个滤光器从被反射的电磁辐射中去除所述入射直线的反射。
22.如权利要求12所述 的系统，其中所述成像器包括电荷耦合装置(CXD)相机。
【文档编号】G01N21/64GK103748453SQ201280027985
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年4月6日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】毛罗·阿关诺, 达米安·柯廷, 达米安·金 申请人:斯多克斯生物有限公司