生物标志物组合物和方法

生物标志物组合物和方法
【专利摘要】可以评估生物标志物用于诊断、治疗相关或预后方法以鉴定表型，如病症或疾病，或者疾病的阶段或进程，选择用于疾病、病症、疾病阶段和病症阶段的候选治疗方案，并且用于确定治疗效果。来自体液的循环生物标志物可以用于生理状态的分型或确定表型。这些包括核酸、蛋白质和循环结构，如囊泡，以及核酸-蛋白质复合物。
【专利说明】生物标志物组合物和方法
[0001]交叉参考
[0002]本申请要求2011年6月16日提交的美国临时专利申请N0.61/497，895 ;2011年6 月 20 日提交的 N0.61/499，138 ；2011 年 6 月 27 日提交的 N0.61/501,680 ；2011 年 7 月8 日提交的 N0.61/506,019 ；2011 年 7 月 11 日提交的 N0.61/506,606 ；2011 年 7 月 11 日提交的N0.61/506，598 ；2011年7月14日提交的N0.61/507,989 ；2011年7月25日提交的N0.61/511,455 ;2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年8月23日提交的N0.61/526，623的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。 [0003]本申请是2012年6月7日提交的国际专利申请PCT/US2012/041387的部分继续，该国际专利申请要求2011年6月7日提交的美国临时专利申请N0.61/494，196;2011年6月7日提交的N0.61/494,355 ;和2011年7月14日提交的N0.61/507，989的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
[0004]本申请还是2012年2月17日提交的国际专利申请PCT/US2012/025741的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2011年2月24日提交的N0.61/446,313 ；2011年6月27日提交的N0.61/501,680 ；2011年4月4日提交的N0.61/471,417 ；2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年2月22日提交的N0.61/445，273的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
[0005]本申请还是2011年8月18日提交的国际专利申请PCT/US2011/048327的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2010年8月18日提交的N0.61/374,951 ；2010年9月2日提交的N0.61/379，670 ;2010年9月9日提交的N0.61/381，305 ;2010年9月15 日提交的 N0.61/383,305 ；2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ；2010 年 10 月 15日提交的 N0.61/393，823 ；2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 ；2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414,870 ;2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560 ;2010 年 12 月 10 日提交的 N0.61/421，851 ;2010 年 12 月 15 日提交的 N0.61/423，557 ;2010 年 12 月 29 日提交的N0.61/428，196的权益；将该申请全部按引用并入本文中作为参考。
[0006]本申请还是2011年3月I日提交的国际专利申请PCT/US2011/026750的部分继续，该申请声称是2009年11月12日提交的美国专利申请系列N0.12/591,226的部分继续申请，其要求美国临时申请2008年11月12日提交的N0.61/114,045 ;2008年11月12 日提交的 N0.61/114，058 ；2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065 ；2009 年 2 月 9 日提交的 N0.61/151,183 ；2009 年 10 月 2 日提交的 N0.61/278,049 ；2009 年 10 月 9 日提交的N0.61/250, 454 ;和2009年10月19日提交的N0.61/253，027的权益；并且该申请还要求美国临时申请2010年3月I日提交的N0.61/274，124 ;2010年6月22日提交的N0.61/357,517 ;2010年7月15日提交的N0.61/364，785的权益；将所有申请全部按引用并入本文中作为参考。
[0007]本申请还是2011年4月6日提交的国际专利申请PCT/US2011/031479的部分继续，该国际专利申请要求美国临时专利申请2010年4月6日提交的N0.61/321,392 ；2010 年 4 月 6 日提交的 N0.61/321，407 ;2010 年 5 月 6 日提交的 N0.61/332，174 ；2010年 5 月 25 日提交的 N0.61/348，214 ;2010 年 5 月 26 日提交的 N0.61/348，685 ;2010 年6 月 11 日提交的 N0.61/354，125 ；2010 年 6 月 16 日提交的 N0.61/355，387 ；2010 年 6月 21 日提交的 N0.61/356，974 ;2010 年 6 月 22 日提交的 N0.61/357，517 ;2010 年 7 月8 日提交的 N0.61/362，674 ；2010 年 11 月 12 日提交的 N0.61/413，377 ；2010 年 4 月 9日提交的 N0.61/322，690 ;2010 年 5 月 13 日提交的 N0.61/334，547 ;2010 年 7 月 15 日提交的 N0.61/364，785 ；2010 年 8 月 2 日提交的 N0.61/370, 088 ；2010 年 9 月 2 日提交的 N0.61/379，670 ；2010 年 9 月 9 日提交的 N0.61/381，305 ；2010 年 9 月 15 日提交的 N0.61/383，305 ;2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ;2010 年 10 月 15 日提交的N0.61/393, 823 ;2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 和 2010 年 11 月 23 日提交的N0.61/416，560的权益；将所有申请全部按引用并入本文中作为参考。
[0008]发明背景
[0009]用于诸如癌症的状况和疾病的生物标志物包括生物分子，如蛋白质、肽、脂质、RNA、DNA和它们的变体及修饰。
[0010]特定生物标志物(例如DNA、RNA和蛋白质)的鉴定可以提供用于诊断、预后或治疗诊断(theranosis)状况或疾病的生物印记。生物标志物可在体液中检测，包括循环DNA、RNA、蛋白质和囊泡。循环生物标志物包括蛋白质(诸如PSA和CA125)以及核酸(诸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循环生物标志物可以与循环囊泡相关。囊泡是从细胞上脱落的膜包封的结构，并且可见于多种体液中，包括血液、血浆、血清、乳汁、腹水、支气管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作为蛋白质、RNA、DNA、病毒和朊病毒的运送载体而参与细胞之间的通讯。微RNA是调控信使RNA转录和降解的短RNA。微RNA已经在体液中发现并且已经观察到其作为从肿瘤细胞上脱落的囊泡内的组分。对与疾病相关的循环生物标志物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助于检测疾病或其严重程度、确定疾病的易感性以及进行治疗决策。·
[0011]生物样品中存在的囊泡提供了生物标志物的来源，例如，所述标志物存在于囊泡内(囊泡有效负载)或存在于囊泡的表面上。囊泡的特征(例如尺寸、表面抗原、细胞源的确定、有效负载)还可提供诊断、预后或治疗诊断的结果输出。仍然存在对可用于检测和治疗疾病的生物标志物进行鉴定的需求。与囊泡相关的微RNA、蛋白质和其它生物标志物以及囊泡的特征可提供诊断、预后或治疗诊断。
[0012]本发明提供了用于通过检测作为疾病或疾病进展的指征的生物标志物而表征表型的方法和系统。所述生物标志物可以是循环生物标志物，包括但不限于囊泡标志物、蛋白质、核酸、mRNA或/和微RNA。生物标志物可以是核酸-蛋白质复合物。
[0013]发明概述
[0014]本文公开了用于通过分析循环生物标志物(诸如生物样品中存在的囊泡、微RNA或蛋白质)来表征表型的方法和组合物。表征受试者或个体的表型可以包括但不限于疾病或状况的诊断、疾病或状况的预后、疾病阶段或状况阶段的确定、药物效力、生理状况、器官危困或器官排斥、疾病或状况进展、与疾病或状况的治疗相关关联性或者特定的生理或生物状态。
[0015]在一个方面中，本发明提供了鉴定生物印记的方法，其包括:(a)测定生物样品中一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包含选自表5的一种或多种生物标志物；和(b)鉴定包括所述一种或多种生物标志物的存在或水平的生物印记。该方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中将该比较用于表征癌症。所述参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。参照生物印记可以来自该受试者。例如，参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中的癌症是转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有所改变，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
[0016]在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR_30b*、miR-1179及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可以选自miR-22、let7a、miR_141、miR-920、miR-450a及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌。
[0017]在其他实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括选自由表20-24任一中的基因组成的组的信使RNA(mRNA)及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可以包括选自A2ML1、BAX、C10orf47、Clortl62、CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP 18、SEPWl、SOXl 及其组合的mRNA。所述一种或多种生物标志物还可以选自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、S0X1、EFTB及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌。
[0018]所述一种或多种生物标志物可以选自04-125、0么19-9、(3-反应蛋白、^95、？4?-1、EGFR、EGFRvII1、阿朴脂蛋白Al、阿朴脂蛋白CII1、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白(claudin)-3、封闭蛋白 _4、小窝蛋白-1、凝血因子 II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、桥粒芯胶蛋白(Desmocollin)-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG-E8、HLA_DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、⑶95、FAP-1及其组合。所述生物印记可以用于表征卵巢癌。
[0019]在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-574_3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于检测前列腺癌的存在。所述一种或多种生物标志物还可以选自hsa-miR-582_3p、hsa_miR-20a*、hsa-miR-375、hsa_miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-l7*、hsa_miR-l30b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其组合。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分转移性和非转移性前列腺癌。
[0020]在另一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括miR-497及其组合。所述生物印记可以用于表征肺癌。
[0021]所述一种或多种生物标志物可以是选自由AQP2、BMP5、C16orf86、CXCT13、DST、ERCC1、GNAO1、KIHL5、MA P4K1、NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCML1、SEMGG1、SMAKCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3及其组合组成的组的信使RNA (mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
[0022]在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括选自由ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36, TRPM8及其组合组成的组的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如乳腺癌样品。
[0023]在其他实施方案中，一种或多种生物标志物包括选自由ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF、TRM31、TRM36、ZNF613 及其组合组成的组的信使 RNA (mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如结肠直肠癌样品。
[0024]在再其他的实施方案中，一种或多种生物标志物包括选自由ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613及其组合组成的组的信使RNA (mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非前列腺癌样品，如肺癌样品。
[0025]所述一种或多种生物标志物还可以是识别以上mRNA之一的微RNA。例如，微RNA可以选自 miRs-26a + b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR_216b、miR-519 家族、miR-203 及其组合。
[0026]在另一个方面中，本发明提供了一种方法，其包括:(a)从生物样品分离一种或多种核酸-蛋白质复合物；(b)用所述一种或多种核酸-蛋白质复合物测定一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和(C)鉴定包括所述一种或多种核酸生物标志物的存在或水平的生物印记。所述方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中所述比较用于表征癌症。参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。参照生物印记可以来自该受试者。例如，所述参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。所述表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中的癌症是 转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记相对于参照生物印记是否有所改变，由此提供用于癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
[0027]所述核酸-蛋白质复合物可以包含选自一种或多种Argonaute家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿朴脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白C、apo C-1> apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白 H(ApoH)、阿朴脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、AP0LD1及其组合的一种或多种蛋白质。例如，所述一种或多种蛋白质可以选自一种或多种Argonaute 家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其组合。一种或多种蛋白质还可以选自Ago2、阿朴脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其组合。
[0028]所述核酸-蛋白质复合物可以包含一种或多种微RNA。在一个实施方案中，一种或多种微RNA可以是表5中的一种或多种微RNA。例如，所述一种或多种微RNA可以选自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其组合。在一个实施方案中，所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质；并且所述一种或多种微RNA包括选自miR-16和miR_92a及其组合的一种或多种微RNA。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
[0029]在再另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括:(a)检测来自生物样品的微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物；(b)确定与所检测的微囊泡群体相关的一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和(C)鉴定包括所述一种或多种核酸的存在或水平的生物印记。例如，所述一种或多种核酸生物标志物的水平可以相对于所述一种或多种蛋白质生物标志物的水平标准化。所述方法可以进一步包括将所述生物印记与参照生物印记相比较，其中所述比较用于表征癌症。所述参照生物印记可以来自未患癌症的受试者。所述参照生物印记可以来自该受试者。例如，所述参照生物印记可以来自受试者的非恶性样品，如正常的邻近组织，或在一段时间过程中取自受试者的不同样品。所述表征可以包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。所述比较步骤可以包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有改变，由此提供用于癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
[0030]在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括选自PCSA、Ago2、⑶9及其组合的一种或多种蛋白质。所述一种或多种核酸生物标志物可以是选自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其组合的一种或多种微 RNA。例如，所述一种或多种蛋白质生物标志物可以包括PCSA和Ago2 ;并且所述一种或多种核酸生物标志物可以包括miR-22。作为另一个实例，所述一种或多种蛋白质生物标志物可以包括PCSA和/或⑶9 ;并且所述一种或多种核酸生物标志物可以包括miR-22。在另一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA ;并且所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表22-24的信使RNA(mRNA)。所述生物印记可以用于表征前列腺癌，如用于区分前列腺癌与非癌样品。
[0031]所述生物印记可以包括从一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种核酸生物标志物的水平的比例计算的评分。在一个实施方案中，所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和PSMA，并且一种或多种核酸生物标志物包括miR-22和let7a。在这种情况中，计算评分可以包括取以下的总和:(a)微囊泡亚群中的miR-22有效负载的水平除以与微囊泡亚群相关的PCSA蛋白的水平的第一倍数；(b)微囊泡亚群中let7a有效负载的水平除以与微囊泡亚群相关的PCSA蛋白的水平的第二倍数；和(c)与微囊泡亚群相关的PSMA蛋白的水平的第三倍数。可以选择所述第一、第二和第三倍数来优化确定生物印记。在一个实施方案中，第一倍数和第二倍数可以都是10。第三倍数可以是I。
[0032]在所述系统的方法的实施方案中，所述生物样品包括体液。合适的体液不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’ s fluid)或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。例如，生物样品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0033]在所述系统的方法的一些实施方案中，所述生物样品包括组织样品、来自组织样品的细胞或从这些细胞释放的循环生 物标志物。例如，可以进行本发明的方法来鉴定针对组织样品的生物印记。所述生物样品可以包括细胞培养物样品，例如，所述样品可以包括培养的细胞和/或包含从这些培养的细胞释放的循环生物标志物的培养基。所述组织样品或培养物样品可以是癌样品，或可以包括肿瘤样品或肿瘤细胞。
[0034]在本发明的方法中，生物样品可以含有一种或多种微囊泡。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物与一种或多种微囊泡相关。一种或多种微囊泡可以具有IOnm至2000nm 的直径,例如，20nm 至 1500nm, 20nm 至 1000nm, 20nm 至 500nm,或 20nm 至 200nm。
[0035]可以使用本文中公开的或本领域已知的方法从样品中分离一种或多种微囊泡。在实施方案中，一种或多种微囊泡经受尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、亲和选择、免疫分析、ELISA、微流体分离、流式细胞分析或其组合。
[0036]可以将一种或多种微囊泡接触一种或多种结合剂。在一些实施方案中，所述一种或多种结合剂包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、枝状物、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。例如，结合剂可以是抗体或适体。一种或多种结合剂可以用于捕获和/或检测一种或多种微囊泡。在一个实施方案中，一种或多种结合剂结合一种或多种微囊泡上的一种或多种表面抗原。一种或多种表面抗原可以包含一种或多种蛋白质。
[0037]该一种或多种蛋白质可以是目标囊泡上的任何有用的生物标志物，如本文中公开的那些。在一个实施方案中，一种或多种蛋白质包括一种或多种细胞特异性或癌症特异性的囊泡标志物，例如，CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam或者表4或5中的蛋白质。一种或多种蛋白质还可以包括一般囊泡标志物，例如，四跨膜蛋白(tetraspanin)、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG_E8 或表 3 的蛋白质中的一种或多种。在一个实施方案中，一种或多种蛋白质包括表3-5任一中的一种或多种蛋白质。
[0038]一种或多种结合剂可以用于捕获一种或多种微囊泡。捕获的微囊泡可以用于进一步的评估。例如，可以评价微囊泡内的有效负载。微囊泡有效负载包括一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所述核酸可包含一种或多种DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物包括一种或多种捕获的微囊泡内的有效负载。例如，一种或多种生物标志物可以包括mRNA有效负载。一种或多种生物标志物还可以包括微RNA有效负载。一种或多种生物标志物还可以包括蛋白质有效负载，例如，内膜蛋白质或可溶性蛋白质。
[0039]本发明的方法可以在体外进行，例如，使用体外生物样品或细胞培养物样品。
[0040]在进一步的实施方案中，所分 析的癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰癌(pancreascancer)、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、皮肤癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈鳞状上皮细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
[0041]在实施方案中，通过本发明方法表征的癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明的癌症；类癌瘤；原发部位不明的癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；颉外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽因癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌?’胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstrom巨球蛋白血症；*Wilm’s肿瘤。例如，所述癌症可以是前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。
[0042]本发明的方法可以在体外进行，例如，使用体外生物样品或细胞培养物样品。
·[0043]在一个方面中，本发明提供了进行本发明任一方法的试剂。在一个相关方面中，本发明提供了试剂盒，其包含进行本发明任一方法的试剂。试剂可以是结合剂，包括但不限于一种或多种生物标志物的抗体或适体。例如，试剂可以是能够结合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一个中的至少一种生物标志物的结合剂。在一些实施方案中，将结合剂直接标记或配置成进行间接标记。
[0044]在另一个方面中，本发明提供了分离的PCSA+囊泡。该囊泡可以含有有效负载，其包含一种或多种选自 miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542_5p、miR_30b*、miR-1179 及其组合的微RNA。该囊泡还可以含有有效负载，其包含选自表20-24任一个的一种或多种信使RNA(mRNA)。
[0045]在再另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含:(a)寡核苷酸，其包含栓系于基质上的第一部分、与目标微RNA序列至少75%互补的第二部分和包含标记的第三部分，其中第二部分位于第一部分和第三部分之间；和(b)微RNA。基质可以是本文中公开的基质，例如，平面基质、柱或珠。在一些实施方案中，寡核苷酸的第二部分与目标微RNA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互补。寡核苷酸的第二部分可以与(b)中的微 RNA 至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%互补。
[0046]在一些实施方案中，寡核苷酸的第三部分是直接标记的。在其他实施方案中，寡核苷酸的第三部分是间接标记的。寡核苷酸的第三部分可以生物素化，例如，以促进包含抗生蛋白链菌素的标记(如抗生蛋白链菌素-phycoerytherin(PE) (SAPE))的结合。可以使用任何有用的标记。例如，寡核苷酸的第三部分可以包含荧光标记、放射性标记或酶标记。 [0047]在一个实施方案中，(b)中的微RNA是处于与蛋白质的复合物中。所述蛋白质可以选自 Argonaute 家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白 A、apo A-1、apoA_I1、apo A-1V,apo A-V、阿朴脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白 C、apo C-1>apo C-1I>apo C_II1、apo C-1V、阿朴脂蛋白D(ApoD)、阿朴脂蛋白E(ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。例如，微 RNA 可以被 Agol、Ago2、Ago3 和 Ago4 中的一个或多个结合。蛋白质可以呈现出核溶解活性(nucleolytic activity)。蛋白质可以包含重组蛋白质。作为非限制性实例，蛋白质可以包含重组Ago2(rAgo2)。
[0048]在一些实施方案中，组合物包含生物样品。微RNA也可以从生物样品分离。分离的微RNA可以处于与蛋白质(如以上那些，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4)的核蛋白复合物中。生物样品可以包括体液。有用的体液的非限制性实例包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。例如，生物样品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0049]在相关方面中，本发明提供了一种方法，其包括:(i)提供如以上教导的组合物；
(ii)在允许微RNA结合寡核苷酸的条件下孵育所述组合物；和(iii)检测标记从基质切割的量。在一个实施方案中，检测标记从基质切割的量包括检测在步骤(ii)之前和之后与基质接触的标记的量。在另一个实施方案中，标记从基质切割表示与微RNA复合的蛋白质的存在。蛋白质可以是如以上所述的那些的蛋白质，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4。可以在切割反应发生之前和之后观察标记从基质切割的量。或者，可以实时观察标记从基质切割的量。
[0050]通过引用并入
[0051]本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其引用的程度如同各单个公开、专利或专利申请均特定地且单独地表明以引用的方式并入一般。
[0052]附图简述
[0053]图1A描述了鉴定包含核酸的生物印记以表征表型的方法。图1B描述了鉴定囊泡或囊泡群体的生物印记以表征表型的方法。[0054]图2详细描述了通过评估囊泡生物印记而表征表型的方法。图2A为涂敷有捕获抗体的平面基底的简图，所述的捕获抗体捕获表达该蛋白质的囊泡。所述捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图2B为涂敷有捕获抗体的珠的简图，所述捕获抗体捕获表达该蛋白质的囊泡。所述的捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对于源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图2C为筛选方案的实例，其可以通过使用如图2B中所示的珠以多重方式实施。图2D示出了捕获或检测囊泡以表征表型的说明性示意图。图2E示出了用于评估囊泡有效负载以表征表型的说明性方案。
[0055]图3详细说明了可以在本发明的一些示例性实施方案中使用的计算机系统。
[0056]图4详细说明了使用检测来自受试者的囊泡的基于珠的方法描述结果的方法。在给定强度下捕获的珠的数量为囊泡以怎样的频率在所述强度下表达检测蛋白质的指示。对于给定的珠而言，信号的强度越强，则检测蛋白质的表达越多。该图显示了通过将正常的患者组合到一条曲线中而将癌症患者组合到另一条曲线中，并使用生物统计分析区分所述曲线而得到的归一化的图。对由各个个体得到的数据归一化以考虑由检测仪器所读取的珠的数量的差异，将这些数据加和，然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数。
[0057]图5说明了通过评估TMPRSS2-ERG表达使用EpCam对来自血浆的前列腺癌细胞源囊泡的捕获。将VcaP纯化的囊泡掺入到正常血浆中，然后与涂敷有EpCam或同种型对照抗体的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分离RNA。使用来自各样品的等体积RNA来进行RT-PCR以及随后的Taqman分析。
[0058]图6描述了使用⑶9珠捕获的miR-21或miR-141表达的柱状图。将得自前列腺癌患者的Iml血浆、250ng/ml的LNCaP或正常的纯化囊泡与⑶9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分离 RNA。此外，对一个样品(#6)不进行捕获以用于比较。使用qRT-PCR测量微RNA的表达，并比较各样品的平均CT值。CD9捕获改善了前列腺癌样品中miR-21 和 miR-141 的检测。
[0059]图7详细说明了使用MoFlo XDP进行的囊泡分离和鉴定。
[0060]图8是检测样品中囊泡的示意图，其中使用微球平台评估所希望的囊泡的存在或水平。图8A是使用基于柱的过滤方法从血浆中分离囊泡的示意图，其中所述分离的囊泡随后使用微球平台进行评估。图8B是由于诸如超离心这样的高速离心而导致囊泡膜压缩的示意图。图8C是使用激光检测对结合于微球的囊泡进行检测的示意图。
[0061]图9A详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特异性标志物包括PCSA。PSMA可以与PCSA—样使用。据发现所述测试对于PCa对比正常样品具有96%的灵敏度和95%的特异性。图9B在Y轴上示出了正常和前列腺癌患者中图9A的囊泡标志物的平均荧光强度(MFI)。
[0062]图10是用于囊泡前列腺癌分析的决策树的示意图，以用于确定样品对于前列腺癌是否为阳性。[0063]图11显示了根据所述决策树针对前列腺癌的囊泡检测分析相对于使用提高的PSA水平进行检测的结果。
[0064]图12说明了从对照和PCa样品分离的囊泡中的miR-145的水平。
[0065]图13A-13B详细说明了使用微RNA确认来自基于囊泡的前列腺癌诊断分析的假阴性。图13A详细说明了使用囊泡中的miR分析以将假阴性转换成真阳性的示意图，由此改善了灵敏度。图13B详细说明了使用囊泡中的miR分析以将假阳性转换成为真阴性的示意图，由此改善特异性。miR-107(图13C)和miR-141 (图13D)的归一化水平在Y轴上针对所述囊泡诊断分析所得的真阳性(TP)、所述囊泡诊断分析所得的真阴性(TN)、所述囊泡诊断分析所得的假阳性(FP)和所述囊泡诊断分析所得的假阴性(FN)示出。miR-107和miR-141可以用于图13A和图13B中所示的方案中。
[0066]图14说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系和患者样品中的KRAS测序。样品包括从细胞系(图14B)或从患者的组织样品(图14D)获得的基因组DNA，或从细胞系(图14A)或患者的血浆样品(图14C)脱落的囊泡内的RNA有效负载获得的cDNA。
[0067]图15说明了来自人血浆的微RNA的免疫沉淀。图1SA显示了人血浆的各种部分中检测到的平均miR-16量。“(Beads) ”是使用针对Argonaute2 (Ago2)、阿朴脂蛋白Al (ApoAl)、GW182和IgG对照的抗体共同免疫沉淀的miR-16的含量。“Dyna”是指使用Dynabea d蛋白G的免疫沉淀，而“Magna”是指Magnabind蛋白G珠。“supernt”是免疫沉淀反应的上清液中检测的miR-16的量。对于详细内容，参见实施例。图15B与图15A相同，除了检测了 miR-92a。
[0068]图16说明了用PE标记的抗-PCSA抗体和FITC标记的抗_Ago2抗体染色的复合物的流式分选。
[0069]图17说明了人血浆样品中PCSA/Ago2阳性复合物中微RNA的检测。血浆样品来自患有前列腺癌(PrC)的受试者或正常对照(正常)。图17A显示了来自人血浆的总循环微囊泡群体中的miR-22拷贝数。图17B显示了使用针对PCSA和Argonaute2(Ago2)的抗体来分选血浆源的复合物。分离RNA且miR-22的拷贝数在PCSA/Ago2双阳性事件的群体中测定。图17C显示了对于每个血浆样品通过流式细胞术计数的PCSA/Ago2双阳性事件的数目。图17D对于每个血浆样品显示miR-22拷贝数除以PCSA/Ago2阳性事件总数的结果。这获得了每个PCSA/Ago2双阳性复合物的miR-22拷贝数。
[0070]图18说明了用抗-⑶9和/或抗-PCSA染色的循环微囊泡(cMV)的流式细胞分析。图18A说明了使用⑶9和PCSA的标记抗体分析血浆源的cMV。图18B说明了使用抗-⑶9和抗-PCSA的双重免疫沉淀后双阳性⑶9/PCSA cMV的富集。比较图18A和图18B之间区域R7中的双阳性群体。图18C说明了使用针对PCSA的标记抗体分析血浆源的cMV。图18D说明了使用抗PCSA的抗体的单一免疫沉淀后PCSA阳性事件的富集。比较图18C和图18D之间区域R4中的群体。
[0071]图19说明了各种不同血浆部分中miR-22的水平。图19A说明了如通过ABITaqman检测试剂盒(Assay ID#000398)测定的未改变血浆中的miR-22拷贝数。图19B说明了如通过ABI Taqman检测试剂盒测定的从患者血衆浓缩的总循环微囊泡群体中的miR-22拷贝数。图19C说明了使用从抗-CD9柱释放的起始材料在抗-PCSA柱上保留的miR-22拷贝数。图19D说明了如使用基于珠的分析测定的相对于样品匹配PCSAMFI的miR-22拷贝数。用于双重免疫沉淀的癌症和正常输入血浆的平均PCSA MFI信号分别是161.67和729.17。图19E说明了输入血浆中的miR-22拷贝数。图19F说明了来自图19E的输入血浆的保留在抗-PCSA柱上的cMV的miR-22拷贝数。图19G说明了如使用基于珠的分析测定的相对于样品匹配PCSA MFI的miR-22拷贝数。用于单一 IP的癌症和正常血浆的平均PCSA MFI信号分别是69.17和526.5。
[0072]图20A-C说明了使用源自PCSA和PSMA蛋白的水平以及与分离自血浆的cMV相关的miR-22和let7a微RNA的评分来区分PCa和正常(非PCa)样品。图20A显示了对于正常和癌症样品计算的评分的曲线图。图20B显示了图20A的数据，其中将正常分成正常组(无前列腺病症)、非典型组、炎症组和高等级前列腺上皮内瘤组(高等级PIN，或HGPIN)，并且将癌症分成确定为观察等待(WW)或癌症的组。图20C显示了用该数据产生的ROC曲线。AUC 为 0.77。
[0073]图21显示了用于不同样品群体中miR-920 (图21A)和miR_450a(图21B)的差异表达的曲线图。样品包含从血浆分离的PCSA表达cMV中的微RNA。与前列腺癌(“癌症”)和正常(“正常”)相比，miR-920在混杂疾病(即，高等级PIN( “hgpin”)和炎性疾病(“炎症”))中过表达。与其他相比，miR-450在癌症中下调。
[0074]图22说明了来自囊泡mRNA有效负载水平的微阵列谱分析的选定mRNA的减去原始背景的荧光值的点图。在每个图中，Y轴显示了减去原始背景的荧光值(原始BGsub荧光)。X轴显示了四个正常对照血浆和四个来自前列腺癌患者的血浆的点图。所示的mRNA为 A2ML1 (图 22A)、GABARAPL2(图 22B)、PTMA(图 22C)、RABACl (图 22D)、S0X1 (图 22E)和ETFB (图 22F)。
[0075]图23A-23B说明了从非复发前列腺癌和转移性前列腺癌样品分离的囊泡中miR-141 (图23A)和miR-375 (图23B)的水平，如X轴上所示。使用Taqman分析检测了从囊泡分离的miR。P值显示于·曲线下方。Y轴显示了检测的miR的拷贝数。
[0076]图24A和24B说明了使用患者血样来区分肺癌和正常(非肺癌)的微RNAmiR-497 ο Y-轴显示了 0.1ml样品中的miR-497拷贝数。在图24A中，水平线表示1154个拷贝的拷贝数。在图24B中，水平线表示1356的拷贝数。图24C是用于通过检验循环微囊泡(cMV)中的miR-497水平区分非-小细胞肺癌和正常血浆样品的受试者工作特征(ROC)曲线。数据对应于图24B。
[0077]图25A是结合于载玻片的Vcap-衍生微囊泡的电子显微照片。图25B是Vcap-衍生的微囊泡的扫描电子显微照片，而图25C是结合于用聚-L-赖氨酸涂覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的扫描电子显微照片。图2?说明了按照样品收集实验方案中详细说明的处理成血浆的血液。
[0078]图26说明了微RNA功能分析。图26A显示了标记的合成RNA分子261-266和含有感兴趣的目标微RNA267的核蛋白复合物。图26B证明了在被核蛋白复合物267识别时，在目标识别位点263处的合成RNA分子的切割，由此释放标记265-266。图26C-E说明了来自各种来源的输入核蛋白复合物。
[0079]发明详述
[0080]本文公开了用于表征生物样品(如，来自细胞培养物、生物体或受试者的样品)的表型的方法和系统。可通过评估一种或多种生物标志物表征所述表型。所述生物标志物可与囊泡或囊泡群体关联，其为存在的囊泡表面抗原或囊泡有效负载。如本文所使用的，囊泡有效负载包含封装于囊泡内的实体。囊泡相关的生物标志物可包含膜结合的和可溶的生物标志物。所述生物标志物还可以是循环生物标志物，诸如在体液中评估的核酸(例如，微RNA)或蛋白质/多肽，或其功能性片段。除非另行说明，本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”指的是这些组分从细胞或生物体中部分或完全地纯化和分离。此外，除非另行说明，所称的使用结合剂进行的囊泡分离包括将囊泡与所述结合剂结合，无论该结合是否使得所述囊泡与起始材料中的其它生物实体完全分离。
[0081]通过分析循环生物标志物(如核酸生物标志物)而表征表型的方法描述于图1A的方案6100A中，其为非限制性说明实例。在第一步骤6101中获得生物样品，如体液、组织样品或细胞培养物。从所述样品中分离核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。对这些核酸的评估可提供该表型的生物印记。通过对与目标表型(如疾病对比健康、治疗前和治疗后)相关的核酸取样，可测定作为表型的指示的一种或多种核酸标志物。本发明的各个方面涉及通过评估在所述样品中存在的一种或多种核酸分子(如微RNA)而确定生物印记6105，其中所述生物印记对应于预定的表型6107。图1B详细说明了使用囊泡分离所述核酸分子的方案6100B。在一个实施例中，获得了生物样品6102，并且从所述样品中分离一种或多种囊泡6104，如来自特定细胞源的囊泡和/或与特定疾病状态相关的囊泡。通过表征与所述囊泡关联的表面抗原和/或测定所述囊泡中存在的组分(“有效负载”)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行说明，本文所使用的术语“抗原”通常指的是可被结合剂结合的生物标志物，无论所述结合剂是抗体、适体、凝集素或用于所述生物标志物的其它结合剂，并且无论这些生物标志物是否在宿主中引发免疫应答。囊泡有效负载可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效负载包括信使RNA (mRNA)和微RNA (本文中亦称为miRNA或miR)。根据所述囊泡的生物印记表征表型6108。在本发明的另一个说明性方法中，方案6100A和6100B —起实施以表征表型。在这样的方案中，评估了囊泡和核酸(如微RNA)，从而表征所述表型。
[0082]在一个相关的方面，本文提供了用于发现生物标志物的方法，其包括评估一个样品中的囊泡表面标志物或有效负载标志物以及将所述标志物与另一样品进行比较。在所述样品之间区分的标志物可用作本发明的生物标志物。这些样品可以来自受试者或受试者组。例如，所述组可以是，例如，对于给定疾病或失调的给定治疗的已知反应者和非反应者。发现区分所述已知反应者和非反应者的生物标志物提供了关于患者是否可能对治疗(诸如治疗剂，如药物或生物制品)有反应的生物印记。
[0083]表型
[0084]本文公开了通过分析囊泡(诸如膜囊泡)来表征个体的表型的产品和方法。表型可以为患者的任何可观察的特征或性状，例如疾病或状况、疾病阶段或状况阶段、疾病或状况的易感性、疾病阶段或状况的预后、生理状态或对治疗的反应。表型可以由受试者的基因表达及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起，以及由对核酸序列的外遗传修饰引起。
[0085]受试者中的表型可以通过从受试者获得生物样品并分析所述样品中的一种或多种囊泡来表征。例如，表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或状况(包括症状前的早期阶段检测)，确定疾病或状况的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或状况的阶段或进程。表征表型还可以包括鉴定针对特定疾病、状况、疾病阶段或状况阶段的适当治疗或治疗效力、疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病重新发生、转移扩散或疾病复发。表型还可以为状况或疾病(例如癌症或肿瘤)的临床上独特的类型或亚型。表型的确定还可以为生理状况的确定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的评估。本文所述的产品和方法允许在个体的基础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
[0086]在一个方面，本发明涉及生物样品的分析以鉴定生物印记，从而预测受试者是否可能对疾病或失调的治疗有反应。表征表型包括预测所述受试者的响应者/无响应者状态，其中响应者对疾病的治疗有反应而无响应者对所述治疗无反应。可在所述受试者中分析囊泡并与已知对治疗有反应或没有反应的先前受试者的囊泡分析进行比较。如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗有反应的先前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的响应者。类似地，如果所述受试者中的囊泡生物印记与对所述治疗无反应的此前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的无响应者。所述治疗可以针对任意适当的疾病、失调或其它状况。在与响应者/无响应者状态相关的囊泡生物印记已知的情况下，所述方法可用于任意疾病情况中。
[0087]本发明所使用的术语“表型”可以指贡献于囊泡生物印记的任何性状或特征，该生物印记使用本发明的方法而鉴定。例如，表型可以是患者可能对治疗有反应的标识，或更广义地其可为基于针对获自受试者的样品鉴定的生物印记的诊断、预后或治疗诊断确定。
[0088]在一些实施方案中，所述的表型包括疾病或状况，如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括肿瘤、赘生物或癌症的存在或发生肿瘤、赘生物或癌症的可能性。通过本文所述的产品或方法检测或评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(1Wgradedysplasia)、前列腺增生、前列腺 癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。所述的结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液恶性肿瘤可以为B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
[0089]所述表型可以是恶变前状况，诸如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维症、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成为恶性肿瘤的其它异常组织生长或病灶。诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评估的表型。
[0090]通过本发明的方法表征的癌症可包括但不限于，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限于，上皮肿瘤、鳞状细胞肿瘤鳞状细胞癌、基底细胞肿瘤基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺体)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰岛瘤(linitisplastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(grawitztumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤(warthin' s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒膜细胞瘤、卵巢含睾丸母细胞瘤、支持细胞睾丸间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣与黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端着色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于，Askin’ s肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤，其包括:腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于，慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴衆细胞性淋巴瘤(Iymphoplasmacyticlymphoma)(诸如
Waldenstrom巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、衆细胞骨髓瘤、衆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤⑶30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定、间变性大细胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括但不限于，生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括但不限于，肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症包括但不限于，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、脑肿瘤(·如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、卢页咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
[0091]在进一步的实施方案中，进行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
[0092]在实施方案中，所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病?’肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明癌；类癌瘤；原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstrom巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此，对表型的表征可提供本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
[0093]所述的表型还可以为炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以为炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(⑶)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排 斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
[0094]所述的表型还可以包括心血管疾病，例如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风或局部缺血。所述的心血管疾病或状况可以为高血压、狭窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
[0095]所述的表型还可以包括神经疾病，例如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。所述的表型还可以为诸如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的状况。
[0096]所述的表型还可以包括感染性疾病，例如细菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或状况可以为惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质(例如HIV或HCV样颗粒)从而表征病毒状况。
[0097]所述的表型还可以包括围产期或妊娠相关的状况(例如先兆性子痫或早产)、代谢疾病或状况(例如与铁代谢有关的代谢疾病或状况)。例如，可以测定在囊泡中的铁调素(hepcidin)从而表征铁缺乏。所述的代谢疾病或状况还可以为糖尿病、炎症或围产期状况。
[0098]本发明的方法可以用于表征这些疾病和失调和表征可通过包含一个或多个生物标志物的候选生物印记评价的其他疾病和失调。因此，表征表型可以提供本文中公开的疾病和失调之一的诊断、预后或治疗诊断。
[0099]在本发明的各个实施方案中，用于本文中公开的任何病症或疾病的生物印记可以包含几个不同的标志物类别之一中的一种或多种生物标志物，其中所述类别包括以下的一种或多种:1)疾病特异性标志物；2)细胞-或组织-特异性生物标志物；3)囊泡-特异性标志物(例如，一般囊泡生物标志物)；4.血管生成-特异性生物标志物；和5)免疫调节生物标志物。本文中公开了所有这些标志物的实例，并且它们是本领域普通技术人员已知的。此外，鉴定为在特定疾病或病症中具有作用的本领域已知的生物标志物适于用作本发明的组合物和方法中的靶标。在进一步的实施方案中，这样的生物标志物可以全部是所有囊泡表面标志物，或囊泡表面标志物和囊泡有效负载标志物(即，囊泡包裹的分子)的组合。此外，如本文中所述，所评估的生物样品可以是任何生物流体，或可以包含这样的生物流体内存在的单个组分(例如，囊泡、核酸、蛋白质或其复合物)。
[0100]受试者
[0101]可通过分析从受试者获得的生物样品中的一种或多种囊泡(如多种囊泡)来确定受试者的一种或多种表型。`受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物，例如牛、鸟、犬、马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非人灵长动物)。受试者还可以包括:由于濒危而变得重要的哺乳动物，例如西伯利亚虎；或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物)，或对人类而言具有社会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于:食肉动物，例如猫和狗；猪，包括畜养猪、食用猪和野猪；反刍动物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。此外，还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，和更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内，例如与农业、水产业和其它活动有关的动物，所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全而常规实施疾病监测、诊断和疗法的选择。
[0102]所述的受试者可以患有先前存在的疾病或状况，例如癌症。或者，所述的受试者可以并未患任何已知的先前存在的状况。所述的受试者还可以对现有或过去的治疗是非反应性的，例如对癌症的治疗是非反应性的。
[0103]样品
[0104]得自所述受试者的生物样品可以为任何体液或生物流体。例如，所述的生物样品可以为任何生物流体包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。所述的生物样品还可以为组织样品或组织活检样品，从中可获得囊泡和其它循环生物标志物。例如，可以培养得自样品的细胞，并且从所述培养物中分离囊泡(例如参见实施例1)。在各个实施方案中，可由这些生物样品直接评估本发明公开的生物标志物和/或生物印记(如，对核酸或者多肽生物标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定)，其使用各种方法，诸如，从血液、血浆、血清或任意前述生物样品中提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物，以及本领域中已知用于鉴定和评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组技术。此外，可以首先分离或富集这些样品中存在的一种或多种成分，并且进一步处理以评估选定生物标志物的存在或水平，例如，评估给定的生物印记。例如，可以在针对蛋白质和/或核酸生物标志物对微囊泡进行分型之前，从样品分离微囊泡。
[0105]表1列出了疾病、状况或生物学状态的说明性实例，以及可以对其中的囊泡进行分析的生物样品的相应列表。
[0106]表1:针对各种疾病、状况或生物学状态，用于囊泡分析的生物样品的实例
[0107]
[0108]
【权利要求】
1.一种方法，其包括: (a)测定生物样品中一种或多种生物标志物的存在或水平，其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种选自表5的生物标志物；和 (b)鉴定包括所述一种或多种生物标志物的存在或水平的生物印记。
2.权利要求1的方法,其中所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179 及其组合。
3.权利要求1的方法,其中所述一种或多种生物标志物选自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a 及其组合。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自表20-24任一个中的基因组成的组的信使RNA (mRNA)及其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自A2ML1、ΒΑΧ、C10orf47、Clorfl62, CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A,HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA, RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPffU SOXl 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自A2ML1、GABARAPL2、PTMA, RABACl、SOXl、EFTB 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
7.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9、c-反应蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvII1、阿朴脂蛋白Al、阿朴脂蛋白CII1、肌红蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封闭蛋白-3、封闭蛋白-4、小窝蛋白-1、凝血因子II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、桥粒芯胶蛋白-1、EMP_2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG-E8、HLA-DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其组合。
8.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自CA-125、CA19-9, c_反应蛋白、CD95、FAP-1及其组合。
9.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625* 及其组合。
10.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自hsa-miR-582-3p、hsa-miR_20a*、 hsa-miR-375、 hsa_miR-200b、 hsa-miR-379、 hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa_miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其组合。
11.权利要求1的方法,其中所述一种或多种生物标志物包括miR-497。
12.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自AQP2、BMP5、C16orf86、CXCLl3、DST、ERCC1、GNA01、KLHL5、MAP4KU NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCMLl、SEMGl、SMARCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
13.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19 、TR頂36、TRPM8 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
14.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF, TRIM3U TRIM36, ZNF613 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
15.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6、ZNF613 及其组合的信使 RNA (mRNA)。
16.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括选自miRs-26a+b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342_5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519 家族、miR-203 及其组合的微 RNA。
17.—种方法,其包括: (a)从生物样品分离一种或多种核酸-蛋白质复合物； (b)用所述一种或多种核酸-蛋白质复合物确定一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和 (C)鉴定包括所述一种或多种核酸生物标志物的存在或水平的生物印记。
18.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含括选自一种或多种Argonaute 家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1 (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白A、apo A_1、apo A_I1、apo A_IV、apo A_V、阿朴脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白 C、apo C-1、 apo C_I1、apo C-III、 apo C_IV、阿朴脂蛋白D (ApoD)、阿朴脂蛋白E (ApoE)、阿朴脂蛋白H(ApoH)、阿朴脂蛋白L、APOLl、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、APOLDl及其组合的一种或多种蛋白质。
19.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含选自一种或多种Argonaute家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其组合的一种或多种蛋白质。
20.权利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质。
21.权利要求17的方法,其中所述一种或多种核酸包括一种或多种微RNA。
22.权利要求21的方法，其中所述一种或多种微RNA包括表5中的微RNA。
23.权利要求21的方法,其中所述一种或多种微RNA包括一种或多种选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其组合的微 RNA。
24.权利要求21的方法，其中所述核酸-蛋白质复合物包含一种或多种选自Ago2、阿朴脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其组合的蛋白质；并且所述一种或多种微RNA包括一种或多种选自miR-16和miR-92a及其组合的微RNA。
25.—种方法,其包括: (a)检测来自生物样品的微囊泡群体中的一种或多种蛋白质生物标志物； (b)确定与所检测的微囊泡群体相关的一种或多种核酸生物标志物的存在或水平；和 (C)鉴定包括所述一种或多种核酸的存在或水平的生物印记。
26.权利要求25的方法，其中将所述一种或多种核酸生物标志物的水平相对于所述一种或多种蛋白质生物标志物的水平标准化。
27.权利要求25的方法,其中所述一种或多种生物标志物包括一种或多种选自PCSA、Ago2、⑶9及其组合的蛋白质。
28.权利要求25的方法,其中所述一种或多种核酸生物标志物包括一种或多种选自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其组合的微 RNA。
29.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和Ago2;并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。
30.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和/或⑶9；并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22。
31.权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA;并且所述一种或多种核酸生物标志物包括选自表22-24任一个中的信使RNA (mRNA)。
32.权利要求25的方法，其中所述生物印记包括从所述一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种核酸生物标志物的水平的比率计算的评分。
33.权利 要求32的方法，其中所述一种或多种蛋白质生物标志物包括PCSA和PSMA，并且所述一种或多种核酸生物标志物包括miR-22和let7a。
34.权利要求32的方法，其中计算评分包括取以下的总和: (a)微囊泡亚群体中miR-22有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第一倍数； (b)微囊泡亚群体中let7a有效负载的水平除以与微囊泡亚群体相关的PCSA蛋白质的水平的第二倍数；和 (c)与微囊泡亚群体相关的PSMA蛋白的水平的第三倍数。
35.权利要求34的方法，其中计算评分包括所述总和的单调变换。
36.权利要求34的方法，其中第一倍数是10。
37.权利要求34的方法，其中第二倍数是10。
38.权利要求34的方法，其中第三倍数是I。
39.前述任一项权利要求的方法，进一步包括将所述生物印记与参照生物印记进行比较，其中所述比较用于表征癌症。
40.权利要求39的方法，其中所述参照生物印记来自未患癌症的受试者。
41.权利要求39的方法，其中所述表征包括鉴定受试者中癌症的存在或风险，或鉴定受试者中癌症是转移性的或侵袭性的。
42.权利要求39的方法，其中所述比较步骤包括确定生物印记是否相对于参照生物印记有改变，由此提供癌症的预后、诊断或治疗诊断确定。
43.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品包括体液。
44.权利要求43的方法，其中体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
45.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品包括尿液、血液或血液衍生物。
46.权利要求1-43任一项的方法，其中所述生物样品包括细胞培养物。
47.权利要求1-43任一项的方法，其中所述生物样品包括组织样品。
48.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品含有一种或多种微囊泡。
49.权利要求48的方法，其中所述一种或多种生物标志物与所述一种或多种微囊泡相关。
50.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡具有20nm至2000nm的直径。
51.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡具有20nm至200nm的直径。
52.权利要求48的方法，其中所述一种或多种微囊泡经受尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、免疫分析、微流体分离、流式细胞分析或其组合。
53.权利要求48的方法，其中将所述一种或多种微囊泡接触一种或多种结合剂。
54.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂包括核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PM)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、枝状物、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。
55.权利要求53的方法,其中所述一种或多种结合剂用于捕获和/或检测一种或多种微囊泡。
56.权利要求53的方法，其中所述一种或多种结合剂结合一种或多种微囊泡上的一种或多种表面抗原。
57.权利要求56的方法,`其中所述一种或多种表面抗原包括一种或多种蛋白质。
58.权利要求57的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括⑶9、⑶63、⑶81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam中的一种或多种。
59.权利要求57的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括四跨膜蛋白、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG_E8 或表 3 中的蛋白质中的一种或多种。
60.权利要求57的方法,其中所述一种或多种蛋白质包括表3-5任一个中的一种或多种蛋白质。
61.权利要求53的方法,其中所述一种或多种结合剂用于捕获所述一种或多种微囊泡。
62.权利要求61的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括所述一种或多种捕获的微囊泡内的有效负载。
63.权利要求62的方法，其中所述有效负载包含一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
64.权利要求63的方法，其中所述核酸包括一种或多种DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
65.权利要求62的方法，其中所述一种或多种生物标志物包括mRNA。
66.权利要求39的方法，其中所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明的癌症；类癌瘤；原发部位不明的癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性肿瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症jwilm’ s肿瘤。
67.从属于权利要求1-6、9-10或12-38任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括前列腺癌。
68.从属于权利要求1、11、15、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括肺癌。`
69.从属于权利要求1、13、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括乳腺癌。
70.从属于权利要求1、14、17-22,25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括结肠直肠癌。
71.从属于权利要求1、7-8、17-22、25或26任一项的权利要求39的方法，其中所述癌症包括卵巢癌。
72.前述任一项权利要求的方法，其中所述方法在体外进行。
73.用于实施前述任一项权利要求的方法的试剂的用途。
74.—种包含配置为实施权利要求1-72任一项的方法的试剂的试剂盒。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述试剂是能够结合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一个中的至少一种生物标志物的结合剂。
76.分离的PCSA+囊泡。
77.权利要求76的囊泡，包含一种或多种选自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa_miR-619、miR_1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR-376a、miR-542_5p、miR-30b*、miR-1179 及其组合的微 RNA。
78.权利要求76的囊泡，包含一种或多种选自表20-24任一个中的信使RNA(mRNA)。
79.一种组合物，其包含: (a)寡核苷酸，其包含栓系于基底的第一部分，与目标微RNA序列至少75%互补的第二部分，和包含标记的第三部分，其中第二部分位于第一和第三部分之间；和
(b)微RNA。
80.权利要求79的方法，其中所述基底包括平面基底、柱或珠。
81.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分与(b)中的微RNA至少75%、80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互补。
82.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分与目标微RNA序列至少80%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互补。
83.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是间接标记的。
84.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是生物素化的。
85.权利要求83的方法，其中所述标记包括抗生蛋白链菌素。
86.权利要求79的方法,其中所述寡核苷酸的第三部分的标记包括突光标记、放射性标记或酶标记。
87.权利要求79的方法，其中所述标记包括藻红蛋白(PE)。
88.权利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是间接标记的。
89.权利要求79的方法，其中(b)中的所述微RNA处于与蛋白质的复合物中。
90.权利要求89的方法,其中所述蛋白质选自Argonaute家族成员、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿朴脂蛋白、阿朴脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿朴脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿朴脂蛋白 C、apo C-1、apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿朴脂蛋白 D(ApoD)、阿朴脂蛋白 E(ApoE)、阿朴脂蛋白 H(ApoH)、阿朴脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。
91.权利要求89的方法,其中所述蛋白质选自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
92.权利要求89的方法，其中所述蛋白质包括重组蛋白质。
93.权利要求92的方法，其中所述蛋白质包括Ago2。
94.权利要求79的方法，其中所述组合物包括生物样品。
95.权利要求79的方法，其中所述微RNA从生物样品分离。
96.权利要求94或95的方法，其中所述生物样品包括体液。
97.权利要求96的方法，其中所述体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
98.权利要求96的方法，其中所述体液包括尿液、血液或血液衍生物。
99.权利要求95的方法，其中所述微RNA在与蛋白质的复合物中分离。
100.—种方法，其包括: (i)提供权利要求79-99任一项的组合物； (?)在允许所述微RNA结合所述寡核苷酸的条件下孵育所述组合物；和 (iii)检测标记从基底切割的量。
101.权利要求100的方法，其中检测标记从基底切割的量包括检测在步骤(ii)之前和之后接触基底的标记的量。
102.权利要求100的方法，其中标记从基底切割指示与微RNA复合的蛋白质的存在。
103.权利要求102的方法,其中所述蛋白质选自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
104.权 利要求100的方法，其中实时观察标记从基底切割的量。
【文档编号】G01N33/53GK103797131SQ201280039945
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年6月14日 优先权日:2011年6月16日
【发明者】K·布朗, T·保罗斯基, D·斯佩特茨勒 申请人:卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司