纯化核酸的方法、提取核酸的方法和用于纯化核酸的试剂盒的制作方法

纯化核酸的方法、提取核酸的方法和用于纯化核酸的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供了一种操作简单且短时间内能够高效地提取核酸的纯化核酸的方法。本发明的纯化核酸的方法包括用包含阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的离子交换树脂10来吸附含核酸的样品中的物质的步骤。可以使用第一阳离子交换树脂和排阻极限分子量小于第一阳离子交换树脂的第二阳离子交换树脂作为阳离子交换树脂。
【专利说明】纯化核酸的方法、提取核酸的方法和用于纯化核酸的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及纯化核酸的方法、提取核酸的方法和用于纯化核酸的试剂盒(kit)，并且更加具体地涉及一种通过用离子交换树脂吸附外源物质(foreign substance)来纯化核酸的方法。
【背景技术】
[0002]核酸扩增反应，例如PCR (聚合酶链式反应)和LAMP (环介导等温扩增反应)，应用于各种生物【技术领域】。例如，在医学领域，诊断是基于DNA和RNA的碱基序列进行的。在农业领域，DNA分析用于检测基因重组体植物。
[0003]核酸扩增反应能够有效地扩增和检测少量样品中的核酸。然而，如果极其少量的核酸包含于样品中，那么核酸可能在检测下限以下。此外，若样品中核酸的浓度极其低，则可能无法检测核酸，这是因为待扩增的核酸没有包含于具有能够进样至反应位点的容积的样品中。在这些情形下，将事先通过纯化、浓缩等方式所提取的核酸进样至反应位点是有效的。
[0004]本文通过聚焦纯化核酸，使用苯酚/氯仿/乙醇的常规方法是已知的。同样，使用具有核酸吸附能力的多孔载体来纯化核酸的方法是已知的(参见专利文件I)。
[0005]专利文件1:日本特开2005-080555公报
[0006]专利文件2:国际公开第2009/060847号
[0007]发明简述
[0008]本发明所解决的问题
[0009]然而，在使用苯酚/氯仿/乙醇的常规方法中，毒性有机溶剂的使用是必然的且离心操作是额外工作。在使用具有核酸吸附能力的多孔载体来纯化核酸的方法中，多个步骤是必然的且简单操作是不可行的。相应地，强烈需要一种短时间内高效率地纯化核酸的简单方法。
[0010]本技术的主要目的是提供一种短时间内有效率地纯化核酸的简单方法。
[0011 ] 用于解决该问题的方法:
[0012]为了解决上述问题，本技术提供一种纯化核酸的方法，包括用离子交换树脂吸附包含于含核酸样品中的物质的步骤，该离子交换树脂是阳离子交换树脂和阴离子交换树月旨。阳离子交换树脂允许吸附包含于待吸附的样品中的带正电的蛋白质或金属盐的阳离子。阴离子交换树脂允许吸附包含在样品中的除核酸以外的带负电的阴离子。
[0013]优选使用第一阳离子交换树脂和具有的排阻极限分子量(exclustion limitmolecular weight)小于第一阳离子交换树脂的排阻极限分子量的第二阳离子树脂作为所述阳离子交换树脂。本文中，排阻极限分子量表示待由离子交换树脂吸附的难于进入离子交换树脂的孔道(即难于吸附于离子交换树脂的孔道内)的化合物的最小分子量。换言之，具有分子量大于排阻极限分子量的化合物难于被离子交换树脂吸附。[0014]在阳离子交换树脂中，具有较大排阻极限分子量的第一阳离子交换树脂可易于选择性吸附蛋白质。此外，在阳离子交换树脂中，具有较小排阻极限分子量的第二阳离子交换树脂可易于选择性吸附主要的阳离子，例如金属盐。
[0015]优选的是所述物质被第一阳离子交换树脂吸附之后，物质再被阴离子交换树脂和第二离子交换树脂吸附。在这种情形下，柱子(column)包括上层的第一阳离子交换树脂和下层的阴离子交换树脂和第二阳离子交换树脂。样品可以从上层一侧流入柱子。对于样品中的物质，通过这种方式样品中的蛋白质主要由第一阳离子交换树脂选择性地吸附，而样品中的金属盐主要由第二阳离子交换树脂和阴离子交换树脂选择性吸附，从而提高了样品中物质的吸附效率。
[0016]同样，该步骤可以由离子交换树脂吸附包含于用缓冲溶液稀释的样品中的物质。优选地，缓冲溶液具有4.0~8.0的pH。
[0017]优选地，该阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。优选地，第一阳离子交换树脂的反荷离子(抗衡离子，counter ion)为Na+(钠离子)。优选地，第二阳离子交换树脂的反荷离子为H+(质子)。
[0018]优选地，阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。优选地，阴离子交换树脂的反荷离子为OF (氢氧离子)。
[0019]同样，优选地，阴离子交换树脂比第二阳离子交换树脂的离子交换容量的百分比为50~150%。本文中，离子交换容量表示每单位数量的离子交换树脂的可交换基团(exchange groups)的总数量。例如，当第二阳离子交换树脂的反荷离子为H+时,离子交换容量表示包含于Iml的第二阳离子交换树脂中的H+的总数量。当阴离子交换树脂比第二阳离子交换树脂的离子交换容量的百分比为50~150%时，在由离子交换树脂吸附包含于样品中的物质前后，可能更稳定地抑制PH变化。
[0020]在纯化核酸的方法中，更加优选的是向样品中加入非离子表面活性剂和/或非离子亲水聚合物化合物以吸附物质。通过加入非离子表面活性剂和/或非离子亲水聚合物化合物至样品中，可能抑制核酸物理吸附于树脂。
[0021]上述的物质为例如外源物质。外源物质包括例如蛋白质和金属盐。外源物质可以包括以下物质，例如多种肽、糖、盐和低分子量的阴离子(例如延胡索酸、酞酸、腐殖酸和灰黄霉酸)，除蛋白质和金属盐外它们对分析样品中的核酸来说不是必须的。
[0022]为了解决上述问题，本技术提供一种包括以下步骤的纯化核酸的方法:超声处理包含核酸的样品，用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附包含于样品中的物质，以及通过阻断利用电泳迁移的核酸来浓缩核酸。
[0023]电泳可以在嵌入具有阴离子官能团的嵌入剂(intercalator)的核酸上进行。同样，电泳可以在通过混合:样品、具有通过脱水缩合与包含于样品中的物质的羧基进行反应的官能团的化合物以及脱水缩合反应的缩合剂所得到的核酸上进行。
[0024]此外，本技术提供一种用于纯化核酸的试剂盒，该试剂盒包括:阳离子交换树脂、阴离子交换树脂的试剂盒、以及一种用于分布(能够流通)包含核酸的样品的内部盛有(保持有)阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的核酸纯化仪器。
[0025]发明效果
[0026]本技术提供了一种短时间内有效率地纯化核酸的简单方法。【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1:用于解释根据本技术的第一实施方式的纯化核酸方法的各步骤的示意图。
[0028]图2:用于概念性解释根据本技术的第一实施方式的由第一阳离子交换树脂所吸附的外源物质的状态的示意图。
[0029]图3:用于概念性解释根据本技术第一实施方式的由第二阳离子交换树脂和阴离子交换树脂所吸附的外源物质的状态的示意图。
[0030]图4:用于解释根据本技术的第二实施方式的纯化核酸方法的各步骤的示意图。
[0031]图5:显示了由阳离子交换树脂吸附处理后的核酸回收率的图(测试实施例1)。
[0032]图6:显示了由阳离子交换树脂吸附处理后的样品的LAMP反应结果的图(测试实施例I)。
[0033]图7:显示了考查阳离子交换树脂对反荷离子种类(Na+、H+)回收率的影响结果的图(测试实施例2)。
[0034]图8:显示了由离子交换树脂吸附处理后的样品的LAMP反应结果的图(实施例4和5)。
[0035]图9:显示了由阳离子交换树脂的吸附处理后的样品的LAMP反应和RT-LAMP反应(Tf值)的结果的图(实施例4和5)。
[0036]图10:显示了由阳离子交换树脂的吸附处理后的LAMP反应和RT-LAMP反应(Tt值)的结果的图(实施例6)。
[0037]图11:显示了由离子交换树脂的吸附处理后的LAMP反应和RT-LAMP反应(Tt值)的结果的图(实施例7)。
[0038]图12:显示了样品的LAMP反应结果的图(实施例12)。
[0039]图13:显示了样品的RT-LAMP反应结果的图(实施例12)。
[0040]参照数字说明
[0041]1、101:用于纯化核酸的试剂盒
[0042]3:核酸纯化仪器
[0043]10:离子交换树脂
[0044]20:第一阳离子交换树脂
[0045]30:阴离子交换树脂
[0046]40:第二阳离子交换树脂
【具体实施方式】
[0047]下面将参照附图描述本公开的【具体实施方式】。以下描述的实施方式仅描述本公开的典型实施方式，且本公开的范围不应该被解释为范围变窄。这些实施方式将按如下顺序描述:
[0048]1.本技术第一实施方式的用于纯化核酸的试剂盒和纯化核酸的方法
[0049](1)用于纯化核酸的试剂盒
[0050](2)纯化核酸的方法
[0051]2.本技术第二实施方式中纯化核酸的试剂盒和纯化核酸的方法[0052]3.提取核酸的方法
[0053]1.本技术第一实施方式中用于纯化核酸的试剂盒和纯化核酸的方法
[0054](I)用于纯化核酸的试剂盒
[0055]首先，参照图1(A)，本文将描述根据本技术的第一实施方式的用在纯化核酸的方法中的用于纯化核酸的试剂盒。图1(A)~(C)是用于解释根据本技术第一实施方式的纯化核酸的方法的各步骤的示意图。
[0056]在图1 (A)中，用于纯化核酸的试剂盒I吸附包含于样品中的除核酸外的物质(以下表示为“外源物质”)，且纯化该核酸。用于纯化核酸的试剂盒I主要包括离子交换树脂10和核酸纯化仪器3，该核酸纯化仪器3内部盛有离子交换树脂10且其能够分布含核酸的样品。本技术中所使用的样品不是特别受限制，可以是生物样品，例如拭子、口腔拭子、唾液、血清、血衆、外周血单核细胞、脑脊液、粪便、尿、培养细胞和活检组织(biopsy tissue)。除生物样品外，该样品也可以是河流水、海水、土壤等。
[0057]该核酸纯化仪器3内部盛有离子交换树脂10且分布样品。核酸纯化仪器3的形状、材质等不是特别受限制，只要核酸纯化仪器3能够内部盛有离子交换树脂10且分布样品。例如，正如图1(A)所示的，上部具有开口的商业可得的样品管、枪头(chip)等。任选地，核酸纯化仪器3可具有在上部和下部具有开口的试管。在该情形下，样品经核酸纯化仪器3分布且被离子交换树脂10吸附后，能够使用单独的枪头等来回收从下部流过的样品。
[0058]根据本技术的离子交换树脂10吸附包含于样品中的外源物质。该离子交换树脂10包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。例如，外源物质包括蛋白质和金属盐。外源物质可以包括多种肽、糖、盐、低 分子量的阴离子(例如，延胡索酸、酞酸、腐殖酸和灰黄霉酸)，除蛋白质和金属盐外它们对分析样品中的核酸来说不是必须的。
[0059]上述的阳离子交换树脂主要吸附阳离子外源物质。优选地，阳离子交换树脂包括第一阳离子交换树脂和第二阳离子交换树脂，第二阳离子交换树脂具有小于第一阳离子交换树脂的排阻极限分子量的排阻极限分子量。第一阳离子交换树脂主要用于吸附包含于样品中的蛋白质。第二阳离子交换树脂主要用于吸附包含于样品中的例如金属离子的正离子(阳离子)。
[0060]只要样品中存在蛋白质就能够使用第一阳离子交换树脂的非限定性实例。优选地，第一阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂。第一阳离子交换树脂的固定离子优选为SO'反荷离子的非限定性实例包括钙离子(Ca2+)、铜离子(Cu2+)、锌离子(Zn2+)、镁离子(Mg2+)、钾离子(K+)、铵离子(NH4+)、钠离子(Na+)、质子(H+)等。在这方面上，这些离子的离子交换强度(离子选择性)的顺序为Ca2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+>K+>NH4+>Na+>H+。相应地，就离子交换强度而言，反荷离子优选为H+。另一方面，当反荷离子为H+时，样品的pH可能转变为酸性侦U。相反地，反荷离子为Na+时，吸附金属盐的功能弱于反荷离子为H+时。然而，抑制样品PH的变化是可能的。尽管反荷离子为Na+，第一阳离子交换树脂能够完全吸附蛋白质。因此，第一阳离子交换树脂优选为具有Na+作为反荷离子的强酸性阳离子交换树脂(Na+型强酸性尚子交换树脂)。
[0061]第二阳离子交换树脂不是特别受限制，只要包含于样品中的例如金属盐的阳离子能够被吸附，但是第二阳离子交换树脂优选为强酸性阳离子交换树脂。第二阳离子交换树脂的固定离子优选为so3-。反荷离子不是特别受限制。然而，就上述离子交换强度(离子选择性)而言，第二阳离子交换树脂的反荷离子优选为质子(H+)。
[0062]阴离子交换树脂吸附包含于样品中的负离子(阴离子)。只要样品中包含例如金属盐的阴离子就能够使用阴离子交换树脂的非限定性实例。优选地，阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。阴离子交换树脂可以为具有三甲基铵基的I型强碱性阴离子交换树月旨，或者具有二甲基乙醇铵基的II型强碱性阴离子交换树脂。在I型中，这些离子的阴离子交换强度(离子选择性)的顺序为 HS04->N03->Br->Cr>HC03->HC00->CH3C00->F->0H-。在 II型中，这些离子的阴离子交换强度(离子选择性)的顺序为HS04->N03->Br->Cr>HC03->0H->Hcoo->ch3coo_>f-。在这些I型和II型强碱性阴离子交换树脂中，I型强碱性阴离子交换树脂能够更加准确地吸附氯离子(Cl—)等。因此，阴离子交换树脂优选为I型的且包含氢氧离子(0H_)作为反荷离子。
[0063]用于纯化核酸的试剂盒I可能包括添加剂，例如包含非离子表面活性剂的非离子化合物、非离子亲水性聚合物化合物等，从而使得核酸不和外源物质一起吸附。非离子化合物的实例包括非离子表面活性剂，例如Brij35、吐温20和TritonXlOO。同样，非离子亲水性聚合物化合物的实例包括聚乙二醇、多羟基乙基纤维素等。这些例举的非离子化合物可以单独或组合使用。此外，用于纯化核酸的试剂盒I可以包含螯合添加剂，例如EDTA。
[0064]用于纯化核酸的试剂盒I可以包含缓冲溶液。用于缓冲溶液的缓冲剂实例包括HomoPIPES (pH: 3.9 ~5.1，pKa:4.55) ,MES (pH: 5.5 ~7.0，pKa:6.15) ,Bis-Tris (pH: 5.7 ~
7.3, pKa:6.46) , ADA (pH: 5.8 ~7.4，pKa: 6.60)、PIPES (pH: 6.1 ~7.5，pKa: 6.80)、ACES (pH: 6.0 ~7.5，pKa:6.90)、M0PS0(pH:6.2 ~7.4，pKa: 6.95)、BES (pH: 6.6 ~
8.0，pKa:7.15)、M0PS(pH:6.5 ~7.9，pKa: 7.20)、TES (pH: 6.8 ~8.2，pKa: 7.50)、HEPES (pH: 6.8 ~8.2，pKa: 7.55)、DIPSO (pH: 6.9 ~8.1，pKa: 7.6)、TAPSO (pH: 7.0 ~
8.2，pKa: 7.7)、POPSO (pH: 7.2 ~8.5，pKa: 7.85)、HEPPSO (pH: 7.4 ~8.6，pKa: 7.9)、EPPS (pH:7.5 ~8.5，pKa: 8.0)、Tricine (pH: 7.8 ~8.8，pKa: 8.15)、Bicine (pH: 7.7 ~
9.1，pKa:8.35)、TAPS(pH:7.7 ~9.1，pKa: 8.4)、CHES (pH: 8.6 ~10.0，pKa: 9.5)、CAPSO (pH: 9.3 ~10.7，pKa: 10.0)、CAPS (pH: 9.7 ~11.1, pKa: 10.40)等。前面引用的每种缓冲剂的PH范围表示缓冲剂所加入样品的合适pH范围。除HomoPIPES外(对于HomoPIPES，其pKa是在37°C下)，前面引用的每种缓冲液的pKa表示20°C下的pKa。稀释样品的缓冲溶液的PH优选为4~8。在这方面上，在前面引用的缓冲剂中，用于第一实施方式中的缓冲剂优选为 HomoPIPES、MES、Bis-Tris 和 ADA。
[0065](2)纯化核酸的方法
[0066]然后，参照图1的(A)至(C)，将描述根据本技术第一实施方式的纯化核酸方法的步骤。
[0067]在描述根据本技术第一实施方式的纯化核酸的方法之前，将描述本技术的相关技术中纯化核酸的方法。在相关技术的纯化核酸的方法中，使用沸石(zeolite)吸附样品中的外源物质(例如，参见专利文件2)。
[0068]通过相关技术中的纯化核酸的方法，只有包含于例如生物样品的样品中的阴离子和阳离子中的阳离子能够被除去。因此，在相关技术中纯化核酸的方法中，当纯化样品时，质子会被排出，由此减小含有样品的溶液的PH(更加转移至酸性侧)。在这方面上，样品纯化后，核酸扩增反应可以在pH为7~9下进行。有必要事先设定包含和沸石接触的样品的溶液的pH更大(设定于碱性侧)。用这种方式，相关技术中的纯化核酸的方法可能是复杂的操作。同样，当样品包含RNA时，RNA可能被分解。
[0069]在相关技术中的纯化核酸的方法中，用碱性化合物和表面活性剂(例如SDS)的混合试剂稀释样品后，在高温下加热样品。同样在这方面上，相关技术中的纯化核酸的方法可能是复杂的操作，同样，当样品包含RNA时，RNA可能被分解。
[0070]此外，在相关技术中纯化核酸的方法中，纯化样品后，阴离子可能保留于样品中。此外，阴离子表面活性剂可能包含于样品中。因此，当样品纯化后对核酸进行电泳时，样品可能具有高电解质浓度且易于产生热量。同样在这方面上，当样品包含RNA时，RNA可能被分解。此外，样品的常规流动由热产生引起，由此会降低核酸的电泳浓缩效率。
[0071]相反地，本发明人经过他们的大量研究已经发现以下详细描述的根据本技术的纯化核酸的方法，不需要复杂的操作，极大简化操作，并且该方法是能够短时间内高效地纯化核酸的简单方法。
[0072]在根据本技术第一实施方式的纯化核酸的方法中，放置于容器5中的含核酸的样品A和用于稀释样品A的缓冲溶液装填入附属于移液管50的移液管吸头51 (参见图1 (A))。然后，装填入移液管50的样品A和用于稀释样品A的缓冲溶液注射入核酸纯化仪器3(参见图1 (B))。此时，由于核酸纯化仪器3内部盛有离子交换树脂10，包含于样品A中的外源物质由离子交换树脂10所吸附。
[0073]最后，用离子交换树脂10经过吸附外源物质所纯化的样品A穿过离子交换树脂10，且在核酸纯化仪器3的底部聚集(参见图1 (C))。
[0074]经图1 (A)至(C)中所示的步骤后，能够对样品A实施核酸扩增反应。例如，核酸扩增反应能够通过加入样品A至固化的核酸扩增试剂的方式进行。在第一实施方式中，通过离子交换树脂10可以使样品脱矿物质以改变双螺旋DNA成为单链DNA。因此，在核酸扩增反应之前，可以适当地改性DNA。
[0075]本文中，参照图2和3，将详细描述由离子交换树脂10所吸附的包含于样品A中的外源物质(图1(B)中的(I))的状态。图2是用于概念性解释特别是由图1(B)所示的第一阳离子交换树脂吸附的外源物质的状态的示意图。图3是用于概念性解释特别是由图1 (B)所示的第二阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附的外源物质的状态的示意图。
[0076]参照图2，显示了由包含于离子交换树脂10的第一阳离子交换树脂20所吸附的包含于样品A的外源物质的状态。在图2中，核酸B包含于样品A中，且蛋白质C为包含于样品A的外源物质中的一种。本文中，第一阳离子交换树脂20是具有钠离子(Na+)作为反荷离子的强酸性阳离子交换树脂。
[0077]第一阳离子交换树脂20包含例如S03_的阴离子21和反荷离子Na+22。此外，在第一阳离子交换树脂20上形成用于吸附蛋白质C的区域23。
[0078]正如图2中所 示的，由于包含于流入核酸纯化仪器3的样品A中的蛋白质C是带正电的，蛋白质C被表面上具有阴离子21的第一阳离子交换树脂20所吸附。另一方面，由于核酸B是带负电的，核酸B不会被第一阳离子交换树脂20吸附，并由包含于样品A中的缓冲溶液的流过而引导流过。此外，由于第一阳离子交换树脂20的反荷离子为Na+22，第一阳离子交换树脂20较少地吸附(脱矿物质)金属盐但能够选择性吸附蛋白质C，正如相比于反荷离子为H+的情形。[0079]在该情形下，用于稀释样品A的缓冲溶液优选具有4~8的pH。用于稀释样品A的具有PH为4~8的(酸性)缓冲溶液，只有外源物质(主要是蛋白质C)能够带正电，同时核酸B带负电。用这种方式，只有蛋白质C能够被离子交换树脂20稳定地吸附，且能够高效地纯化核酸B。此外，由于第一阳离子交换树脂20是强酸性阳离子交换树脂，第一阳离子交换树脂20能够在大范围pH条件(例如pH为3~13)下带负电。正如前面描述的，尽管样品是酸性的，第一阳离子交换树脂20能够稳定地吸附蛋白质C。此外，样品A具有4~8的pH(酸性)，能够抑制RNase的活性，从而利于纯化RNA。
[0080]优选第一阳离子交换树脂20的排阻极限分子量能够使得将包含于样品A中的蛋白质C引入至区域23。更具体地，第一阳离子交换树脂20的排阻极限分子量优选为5000或更大。当第一阳离子交换树脂20的排阻极限分子量为5000或更大时，容易地且特别选择性地吸附蛋白质C，并且将其从外源物质中除去。
[0081]第一阳离子交换树脂20的平均体积粒径优选为I~3000 μ m。当第一阳离子交换树脂20的平均体积粒径为I~3000 μ m时，容易地且特别选择性地吸附蛋白质C，并且将其从外源物质中除去。
[0082]第一阳离子交换树脂20中的颗粒本身的比重优选为0.5~2.5。当第一阳离子交换树脂20中的颗粒本身的比重优选为0.5~2.5时，容易地且特别选择性地吸附蛋白质C，并且将其从外源物质中除去。更优选地，颗粒本身的比重为1.0~2.5。当比重为1.0~
2.5时，颗粒在溶液中容易地沉积，从而可能容易地从溶液中除去颗粒。
[0083]然后，图3解释了由包含于离子交换树脂10的阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40吸附的包含于样品A中的外源物质的状态。
[0084]在图3中，每个指定符号Dl、D2或D3为包含于金属盐的阳离子或阴离子，该金属盐为包含于样品A中的外源物质的实例。尽管在第一实施方式中不是特别加以限定，但是Dl表示例如氯离子的阴离子，D2表示例如钠离子的阳离子，且D3表示例如镁离子的阳离子。
[0085]参照图3，将描述阴离子交换树脂30吸附外源物质(主要为例如氯离子的阴离子)的状态。在第一实施方式中，阴离子交换树脂30是具有氢氧离子作为反荷离子的I型强碱性阴离子交换树脂。
[0086]阴离子交换树脂30具有例如CH2N(CH3)3+的阳离子31和例如0H_32的反荷离子。此外，用于吸附例如氯离子Dl的阴离子的区域33在阴离子交换树脂30中形成。
[0087]正如图3所示的，包含于流入核酸纯化仪器3的样品A中的氯离子Dl是带负电的，且被表面具有阳离子31的阴离子交换树脂30吸附。例如，氯离子Dl被吸附至区域33。尽管核酸B也是带负电的，但是核酸B具有比例如氯离子Dl的阴离子更大的体积，从而较少地由阴离子交换树脂30所吸附。在这方面上，阴离子交换树脂30的排阻极限分子量优选100~2000。当阴离子交换树脂30的排阻极限分子量为100~2000时，更加准确地抑制核酸B的吸附，且例如氯离子Dl的阳离子被选择性吸附并轻易地除去。 [0088]阴离子交换树脂30的平均体积粒径优选I~3000 μ m。当第一阳离子交换树脂20的平均体积粒径为I~3000 μ m时，例如氯离子Dl的阳离子能够被选择性吸附并轻易地除去。
[0089]阴离子交换树脂30的比重优选为0.5~2.5。当阴离子交换树脂30的比重为0.5~2.5时，例如氯离子Dl的阳离子能够被选择性吸附并轻易地除去，同时具有较高的精确度。更优选地，颗粒本身的比重为1.0~2.5。当比重为1.0~2.5时，颗粒容易地在溶液中沉积，从而可能从溶液中容易地除去颗粒。
[0090]然后，图3解释了外源物质(主要为钠离子D2和镁离子D3的阳离子)由第二阳离子交换树脂40所吸附的状态。在第一实施方式中，第二阳离子交换树脂40为具有H+离子(质子)作为反荷离子的强酸性阳离子交换树脂。
[0091]第二阳离子交换树脂40具有例如S03_的阴离子41和H+42。此外，用于吸附例如钠离子D2和镁离子D3的阳离子的区域43在第二阳离子交换树脂40中形成。
[0092]正如图3所示的，包含于流入核酸纯化仪器3的样品A中的钠离子D2和镁离子D3是带正电的，且由表面上具有阴离子41的第二阳离子交换树脂40所吸附。例如，钠离子D2和镁离子D3吸附于区域43上。另一方面，核酸B是带负电的，因此其不能由第二阳离子交换树脂40吸附，而是被包含于样品A的缓冲溶液的流过而引导流过。
[0093]本文中，第二阳离子交换树脂40具有比第一阳离子交换树脂20更小的排阻极限分子量。相应地，相比于第一阳离子交换树脂20，第二阳离子交换树脂40具有增加的每单位面积表面积，且易于脱矿物质(demineralized)。当第二阳离子交换树脂40具有质子作为反荷离子时，第二阳离子交换树脂40相比于第一阳离子交换树脂20更易于脱矿物质。第二阳离子交换树脂40的排阻极限分子量优选为100~2000。当第二阳离子交换树脂40的排阻极限分子量为100~2000时，例如钠离子D2和镁离子D3的阳离子能够更准确地被吸附。
[0094]第二阳离子交换树脂40的平均体积粒径优选为I~3000 μ m。当第二阳离子交换树脂40的平均体积粒径为I~3000 μ m时，例如钠离子D2和镁离子D3的阳离子能够更准确地被吸附。第二阳离子交换树脂40的平均体积粒径更优选为I~2000 μ m。当第二阳离子交换树脂40的平均体积粒径为I~2000 μ m时，当溶液流过离子交换树脂时可以降低压力。
[0095]第二阳离子交换树脂40的比重优选为0.5~2.5。当第二阳离子交换树脂40的比重为0.5~2.5时，能够更准确地吸附例如钠离子D2和镁离子D3的阳离子。更加优选地,颗粒本身的比重为1.0~2.5。当比重为1.0~2.5时，颗粒容易地在溶液中沉积，从而可能从溶液中容易地除去颗粒。
[0096]同样，优选地，阴离子交换树脂30比第二阳离子交换树脂40的离子交换容量的百分比为50~150%。当离子交换容量的百分比为50~150%时，样品能够被脱矿物质并且更加稳定地抑制PH的变化。
[0097]同样，优选地，阴离子交换树脂30比第二阳离子交换树脂40的含量百分比为50~150%。当含量百分比为50~150%时，样品能够被脱矿物质并且更加稳定地抑制pH的变化。
[0098]尽管未在图2和3中显示，但是适当地向样品中加入非离子表面活性剂，例如Brij35、吐温20和TritonXlOO，以阻止核酸B被离子交换树脂所吸附。同样，优选适当地向样品A中加入非离子亲水性聚合物化合物，例如聚乙二醇、多羟基乙基纤维素。
[0099]根据如前面描述的本技术第一实施方式的纯化核酸的方法，包含阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的离子交换树脂10用作吸附载体，由此吸附包含于样品中的外源物质。例如，当样品为血液样品时，能够直接进行吸附步骤，而不需要复杂的前处理步骤。因此，根据第一实施方式的纯化核酸的方法能够通过非常简单的操作短时间内高效地提取核酸。具体地，在纯化核酸的方法中，进行全部步骤只需要几秒钟。用这种方式能够在如此短的时间内纯化核酸。
[0100]由于不同于娃石固相萃取(silica solid-phase extraction),根据第一实施方式的纯化核酸方法不包括清洗步骤，举例来说，对于该操作只需要少量的样品且还能够降低设备的尺寸。同样，第一实施方式的纯化核酸方法能够吸附外源物质，使得样品保持在酸性条件下(优选PH为4~8)。换言之，根据第一实施方式的纯化核酸方法不需要调整样品为碱性或对其加热。相应地，当样品包含RNA时，能够纯化样品同时抑制RNA分解。此外，在第一实施方式的纯化核酸方法中，当对酸性区域进行超声分散时，能够抑制RNase的功能。
[0101]当通过使用固化核酸扩增试剂进行核酸扩增反应时，不稀释样品且外源物质明显抑制核酸扩增反应。然而，由于经由第一实施方式的纯化核酸方法纯化的样品不包含外源物质，通过向固化核酸方法试剂(solidified nuclear acid amplification reagent)直接加入核酸的方式能够进行核酸扩增反应。
[0102]根据本技术第一实施方式的纯化核酸方法，第一阳离子交换树脂和具有排阻极限分子量小于第一阳离子交换树脂的第二阳离子交换树脂能够用作阳离子交换树脂。相应地，当样品中的外源物质包含金属盐和蛋白质时，两者均能有效地被除去。
[0103]为了通过第一实施方式的纯化核酸方法吸附和除去外源物质，若第一阳离子交换树脂和第二阳离子交换树脂各自为强酸性阳离子交换树脂则更加有效。当第一阳离子交换树脂的反荷离子为Na+或第二阳离子交换树脂的反荷离子为H+时，能够更加有效地除去外源物质。
[0104]在第一实施方式的纯化核酸方法中，当阴离子交换树脂为强碱性阳离子交换树脂时，更加有效地除去外源物质。当阴离子交换树脂的反荷离子为0H—时，更加有效地除去外源物质。
[0105]根据第一实施方式的纯化核酸方法，阴离子交换树脂比第二阳离子交换树脂的离子交换容量的百分比为50~150%，从而能够抑制样品中pH的变化。正如前面所描述的，当样品包含RNA时，能够纯化样品同时抑制RNA分解。
[0106]在第一实施方式的纯化核酸方法中，能够使用非离子化合物，例如非离子表面活性剂和非离子亲水性聚合物化合物。在这种情形下，抑制核酸吸附于离子交换树脂基体，并能够有效地除去外源物质。
[0107]2.本技术第二实施方式的用于纯化核酸的试剂盒和纯化核酸方法
[0108]图4(A)~(C)是用于解释本技术第二实施方式的纯化核酸的方法中各步骤的示意图。
[0109]在图4(A)中，用于纯化核酸的试剂盒101包括离子交换树脂10和核酸纯化仪器3，该核酸纯化仪器3内部盛有离子交换树脂10且能够分布含核酸的样品。离子交换树脂10包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。在第二实施方式的用于纯化核酸的试剂盒101中，阳离子交换树脂包括第一阳离子交换树脂20和第二阳离子交换树脂40。
[0110]第二实施方式的用于纯化核酸的试剂盒、纯化核酸的方法和第一实施方式的用于纯化核酸的试剂盒、纯化核酸的方法的不同点主要在于:在第一阳离子交换树脂20放置于阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40的上层(在注入样品的一侧)的状态下纯化核酸。为了这个目的，在第二实施方式中将主要描述设置于阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40上层的第一阳离子交换树脂20的位置。
[0111]在第二实施方式的纯化核酸的方法中，第一阳离子交换树脂20放置于核酸纯化仪器3内部的阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40的上层。因此，从上层侧注射的样品A首先接触第一阳离子交换树脂20 (参见图4(B))。
[0112]然后，一部分外源物质由第一阳离子交换树脂20除去的样品A接触阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40。包含于样品A的外源物质中的蛋白质被第一阳离子交换树脂20吸附的状态(图4(B)中的区域(II))能够解释成类似于参照图2的由第一阳离子交换树脂20吸附的蛋白质的状态。因此，省略了具体的描述。包含于样品A的外源物质中的金属盐被阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40吸附的状态(图4(B)中的区域
(III))能够解释成类似于参照图3的由阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40吸附的金属盐的状态。因此，省略了具体的描述。阴离子交换树脂30或第二阳离子交换树脂40中的任意可以放置作为上层，或可以混合且放置作为第一阳离子交换树脂20的下层。
[0113]最后，外源物质由离子交换树脂10所吸附后，纯化后的样品在下层聚集。
[0114]根据本技术第二实施方式的纯化核酸的方法，样品A中的外源物质由第一阳离子交换树脂20所吸附，并然后进一步由阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40所吸附。因此，根据本技术第二实施方式的纯化核酸的方法，在除去具有较大体积的蛋白质之后，能够除去具有较小体积的金属盐，从而有效地除去外源物质。
[0115]3.提取核酸的方 法
[0116]然后，下面将描述包括于各个实施方式的纯化核酸方法中的提取核酸的方法。本技术中提取核酸的方法包括以下步骤:超声处理含核酸的样品；用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附包含于样品中的物质；以及通过阻断利用电泳迁移的核酸来浓缩核酸，作为核酸扩增反应的前处理。
[0117]上述步骤不是特别限定。例如，全部步骤能够在同一单元(cell)中进行。当各个步骤在同一单元中进行时，用于超声过程的超声发生器能够设置于单元中。此外，单元能够放置阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。对于阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，能够使用用于本技术各个实施方式中的纯化核酸方法的离子交换树脂10 (第一阳离子交换树脂20、阴离子交换树脂30和第二阳离子交换树脂40)。同样，用于电泳的负极和正极设置于单元中，且用于阻断电泳迁移的核酸的阻断器(blocker)(例如透析膜、聚合物凝胶等)能够设置于单元中。
[0118]在核酸电泳时，能够将具有阴离子官能团的嵌入剂嵌入核酸中。嵌入剂的实例包括具有磺基官能团的化合物。具体实例包括9，10-蒽醌-2，6-二磺酸、蒽醌-1-磺酸钠、蒽醌_2，7-磺酸二钠、蒽醌-1，5-磺酸二钠、蒽醌-2-磺酸钠等。用这种方式，当具有阴离子官能团的嵌入剂嵌入核酸时，能够调整在核酸电泳中的核酸的等电点。换言之，能够浓缩和纯化核酸，并且控制核酸的电泳速度。
[0119]此外，蛋白质(一种包含于样品中的外源物质)的羧基可以脱水，并和以下化合物缩合:例如N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、乙醇胺、乙二胺等。在脱水和缩合反应中，基于碳二亚胺的化合物能够用作缩合剂。基于碳二亚胺的具体实例包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、氯化(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMT-MM)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)等。因此，尽管在核酸电泳时样品中存在蛋白质，但是与蛋白质中的羧基脱水和缩合的核酸的等电点和蛋白质的等电点之间的差别变大，从而高准确地从蛋白质中分离核酸。
[0120]通过实施上述的各步骤，能够非常简单且高效率地回收浓缩后的核酸。特别地，当各步骤在同一单元中进行时，能够降低处理作为样品的感染性试样时对操作员感染的风险，因为不需要转移样品至其它设备。
[0121]本技术可以具有以下的构型:
[0122](1).一种纯化核酸的方法，包括以下步骤:
[0123]用包含阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的离子交换树脂吸附含核酸的样品中的物质。
[0124](2).根据上述(1)所述的纯化核酸的方法，其中，
[0125]阳离子交换树脂包括第一阳离子交换树脂和第二阳离子交换树脂，第二阳离子交换树脂具有的排阻极限分子量小于第一阳离子交换树脂的排阻极限分子量。
[0126](3).根据上述(2)所述的纯化核酸的方法，其中，
[0127]物质由第一阳离子交换树脂吸附，并然后进一步由阴离子交换树脂和第二阳离子交换树脂吸附。
[0128](4).根据上述(2)或(3)所述的纯化核酸的方法，其中，
[0129]样品从在上层包含第一阳离子交换树脂和在下层包含阴离子交换树脂和第二阳离子交换树脂的柱子的上层侧流入。
[0130](5).根据上述(I)~⑷中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0131]所述步骤是通过离子交换树脂来吸附包含于样品中的物质，所述样品用缓冲液稀释，且缓冲液具有4.0~8.0的pH。
[0132](6).根据上述(1)~(5)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0133]阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
[0134](7).根据上述(2)~(6)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0135]第一阳离子交换树脂的反荷离子为Na+。
[0136](8).根据上述(2)~(7)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0137]第二阳离子交换树脂的反荷离子为H+。
[0138](9).根据上述⑴~⑶中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0139]阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。
[0140](10).根据上述(1)~(9)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0141]阴离子交换树脂的反荷离子为0H_。
[0142](11).根据上述⑵~(10)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0143]阴离子交换树脂比第二阳离子交换树脂的离子交换容量的百分比为50~150%。
[0144](12).根据上述(1)~(11)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0145]非离子表面活性剂和/或非离子亲水性聚合物化合物用于吸附物质。
[0146](13).根据上述(1)~(12)中任一项所述的纯化核酸的方法，其中，
[0147]物质为包含至少蛋白质和金属盐的外源物质。[0148](14).一种提取核酸的方法，包括以下步骤:
[0149]超声处理含核酸的样品；
[0150]用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附包含于样品中的物质；以及
[0151]通过阻断利用电泳迁移的核酸来浓缩核酸。
[0152](15).根据上述(14)所述的提取核酸的方法，其中，
[0153]针对嵌入具有阴离子官能团的嵌入剂的核酸实施电泳。
[0154](16).根据上述(14)或(15)所述的提取核酸的方法，其中，
[0155]通过混合样品、具有通过脱水缩合的方式与包含于样品中的物质的羧基反应的官能团的化合物以及脱水缩合反应的缩合剂，针对核酸实施电泳。
[0156]17.一种用于纯化核酸的试剂盒，包括:
[0157]阳离子交换树脂；
[0158]阴离子交换树脂；和
[0159]内部盛有阳离子交换树脂和阴离子交换树脂并用于分布含核酸样品的核酸纯化仪器。
[0160]实施例
[0161]1.强酸性阳离子交换树脂的吸附处理对核酸纯化能力的影响
[0162]〈测试实施例1>
[0163]称量IOOmg强酸性阳离子交换树脂(Nuvia S Na+型(由Bio-RadLaboratories, Inc.制造))并装入旋转过滤柱(spin filter column)(Ultrafree-MC, 0.45 μ m,由 Mi 11 ipore 制造)。然后，制备 50mM 的 MES 缓冲液(pH 为 5)(由Dojindo Molecular Technologies, Inc.制造)。向该缓冲液中加入 0.5 重量 ％ 的 BSA (由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)，并然后加入 5 μ M 的 Cy3 改性后的 20mer 寡聚DNA (由Sigma Aldrich C0.制造)。蛋白质和核酸的混合液在常温下充分搅拌后,将200 μ L的混合液逐滴加入装有强酸性阳离子交换树脂的旋转柱并充分搅拌。然后，离心该混合液并在 12000G 下旋转 2 分钟。使用 NanoDrop D-1000 (由 Thermo Fisher Scientific Inc.制造)测量经旋转的混合液的吸光度。从强酸性阳离子交换树脂的处理前后的吸光度之间的差异来评价核酸的纯化能力。BSA的吸光度在蛋白质A280模式下评价，而核酸的吸光度在微阵列模式下作为Cy3的吸光度来评价。此外，为了接近生物环境，向蛋白质-核酸混合液中加入 0.09 重量 ％(最终浓度计)的 NaCl (由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)。类似地，实施由强酸性阳离子交换树脂的处理。
[0164]评价结果在图5中显示。正如图5中所示的，从经强酸性阳离子交换树脂处理前后的Cy3寡聚DNA和BSA的浓度来看，含NaCl的核酸回收率为约100%，而不含NaCl的核酸的回收率为约72%。另一方面，含NaCl的BSA回收率为约20%，而不含NaCl的BSA回收率为约14%。这些结果揭示了通过实施强酸性阳离子交换树脂的处理，能够增加蛋白质和核酸的混合系统中DNA的存在率(presence ratio)。
[0165]图6显示了由阳离子交换树脂吸附处理外源物质后的样品的LAMP结果和未经吸附处理的样品的LAMP结果。通过混合样品、酶、荧光染料、核酸单体、缓冲液、用于目标核酸链扩增的引物组和用于实时测量的探针。通过Loopamp的DNA扩增试剂盒(由EikenChemical C0., Ltd.制造)和 Loopamp 的 RNA 扩增试剂盒(由 Eiken Chemical C0., Ltd.制造)来测定每个浓度。反应温度为63°C。通过使用能够进行实时测量的热循环仪Chromo4 (由BioRad，US制造)来测量LAMP反应。I个循环设置成I分钟。所使用的探针为是淬灭探针(quenching probe)的QP探针,从而能够观测核酸的扩增和突光强度的降低。更多关于J_bio21的QP探针，参考2011年7月19日的名称为“QP方法”的日本网站http://www.j-bio21.c0.jp/tech/qpmethod.htm。如图6中所示的，由离子交换树脂吸附处理外源物质后，检测样品上的核酸扩增反应。和前面描述的一样，实施如后面描述的LAMP反应。
[0166]2.关于阳离子交换树脂的反荷离子的考察
[0167]〈测试实施例2>
[0168]称量IOOmg 的阳离子交换树脂(Nuvia S Na+型(由 Bio-Rad Laboratories, Inc.制造))并装入旋转过滤柱(Ultrafree-MC, 0.45 μ m)。使上述的阳离子交换树脂(Nuvia S Na+型)流经IM的HCl溶液并用纯净水洗涤至中性以制备阳离子交换树脂(Nuvia S H+型)。称量IOOmg的阳离子交换树脂(Nuvia S H+型)并装入旋转过滤柱(Ultrafree-MC, 0.45 μ m)。然后，制备50mM的MES缓冲液(pH为5)。向该缓冲液中加入0.5重量％的BSA，并然后加入4 μ M的Cy3改性的20mer寡聚DNA。此外，加入0.09重量％的NaCl。各样品在常温下充分搅拌后，将200 μ L的各样品逐滴加入填充Na+型强酸性阳离子交换树脂或H+型强酸性阳离子交换树脂的旋转过滤柱并充分搅拌。然后，离心混合液并在12000G下旋转2分钟。评价各强酸性阳离子交换树脂的核酸纯化能力的结果和测试实施例1的相似。使用 Horiba 小型钠离子计(Horiba Cardy Sodium Compact 1n Meter) (C-122)(由HORIBA Ltd.制造)测量Na+的浓度。使用便携式pH计(由ISFETC0M C0.，Ltd.制造)测量pH。这些评价结果显示在图7中。这些评价结果的汇总显示在表1中。
[0169][表 1]
[0170]
【权利要求】
1.一种纯化核酸的方法，包括以下步骤: 用包含阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的离子交换树脂吸附含核酸的样品中的物质。
2.根据权利要求1所述的纯化核酸的方法，其中， 阳离子交换树脂包括第一阳离子交换树脂和第二阳离子交换树脂，第二阳离子交换树脂具有的排阻极限分子量小于第一阳离子交换树脂的排阻极限分子量。
3.根据权利要求2所述的纯化核酸的方法，其中， 物质由第一阳离子交换树脂吸附，并然后进一步由阴离子交换树脂和第二阳离子交换树脂吸附。
4.根据权利要求3所述的纯化核酸的方法，其中， 样品从在上层包含第一阳离子交换树脂和在下层包含阴离子交换树脂和第二阳离子交换树脂的柱子的上层侧流入。
5.根据权利要求4所述的纯化核酸的方法，其中， 所述步骤是通过离子交换树脂来吸附包含于样品中的物质，所述样品用缓冲液稀释，且缓冲液具有4.0~8.0的pH。
6.根据权利要求5所述的纯化核酸的方法，其中， 阳离子交换树脂为强酸性阳离`子交换树脂。
7.根据权利要求6所述的纯化核酸的方法，其中， 第一阳离子交换树脂的反荷离子为Na+。
8.根据权利要求7所述的纯化核酸的方法，其中， 第二阳离子交换树脂的反荷离子为H+。
9.根据权利要求8所述的纯化核酸的方法，其中， 阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。
10.根据权利要求9所述的纯化核酸的方法，其中， 阴离子交换树脂的反荷离子为OH—。
11.根据权利要求10所述的纯化核酸的方法，其中， 阴离子交换树脂比第二阳离子交换树脂的离子交换容量的百分比为50~150%。
12.根据权利要求11所述的纯化核酸的方法，其中， 非离子表面活性剂和/或非离子亲水性聚合物化合物用于吸附物质。
13.根据权利要求12所述的纯化核酸的方法，其中， 物质为包含至少蛋白质和金属盐的外源物质。
14.一种提取核酸的方法，包括以下步骤: 超声处理含核酸的样品； 用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂吸附包含于样品中的物质；以及 通过阻断利用电泳迁移的核酸来浓缩核酸。
15.根据权利要求14所述的提取核酸的方法，其中， 针对嵌入具有阴离子官能团的嵌入剂的核酸实施电泳。
16.根据权利要求15所述的提取核酸的方法，其中， 通过混合样品、具有通过脱水缩合的方式与包含于样品中的物质的羧基反应的官能团的化合物以及脱水缩合反应的缩合剂，针对核酸实施电泳。
17.一种用于纯化核酸的试剂盒，包括: 阳离子交换树脂； 阴离子交换树脂；和 内部盛有阳离子交换树脂和阴离子交换树脂并用于分布含核酸样品的核酸纯化仪器。
【文档编号】G01N30/88GK103781907SQ201280043107
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年8月28日 优先权日:2011年9月13日
【发明者】中村友彦, 坂本直久, 世取山翼, 伊东和峰 申请人:索尼公司