检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法

检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法
【专利摘要】本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定法。本发明用于在对象接受生物制剂疗法时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体随时间的形成。本发明也用于预测和/或确定患者样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制剂治疗的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受使用生物制剂疗法的对象的治疗决定的信息，并改善对生物疗法的优化治疗、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。
【专利说明】检测针对使用TNFa的生物疗法的中和性自体抗体的测定
法
与相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请号61/505，031、2011年8月26日提交的美国临时申请号61/528，072和2011年9月16日提交的美国临时申请号61/535，884的优先权，所述申请的公开在此处为了各种目的以其整体引入作为参考。
发明背景
[0002]自身免疫疾病是重要的且普遍的医学问题。例如，在美国，类风湿性关节炎(RA)是影响两百万以上人群的自身免疫疾病。RA引起关节的慢性炎症，并通常是渐进性疾病，其可能造成关节破坏和功能性病废。尽管遗传素质、感染物和环境因素都涉及该疾病的病因学，但类风湿性关节炎的原因仍是未知的。在活性RA中，症状包括疲乏、缺乏食欲、低热、肌肉和关节疼痛以及僵硬。并且，在疾病突然发作期间，由于滑膜的炎症，关节通常变成红色、肿胀、疼痛和敏感。此外，由于RA是全身疾病，炎症可能会影响关节外的其他器官和身体部位，包括眼和口的腺体、肺内壁、心包膜和血管。
[0003]RA和其他自身免疫病症管理的传统治疗包括快速作用的“一线药物”和较慢作用的“二线药物”。一线药物减轻疼痛和炎症。此类一线药物的实例包括阿司匹林、甲氧萘丙酸、布洛芬依托度酸和其他非留体抗炎性药物(NSJAID)，以及皮质留类，通过口服或直接注射到组织和关节内施用。二线药物促进疾病减轻并防止进行性关节破坏，也称为疾病改变性抗类风湿药物或DMARD。二线药物的实例包括金、hydrochloroquine、柳氮磺胺卩比唳以及免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和环孢霉素。然而，这些药物中许多可能具有有害的副作用。因此，一直在寻找类风湿性关节炎和其他自身免疫病症的额外疗法。
[0004]肿瘤坏死因子a (TNF-a )是由众多细胞类型，包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子，其最初基于其能诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力而鉴定。随后，一种称为恶液质素的因子(与恶病质相关)显示出与TNF-a相同。TNF-a涉及多种其他人类疾病和病症的病理生理学，包括休克、败血病、感染、自身免疫疾病、RA、克罗恩病、移植排斥和移植物抗宿主病。
[0005]由于人TNF-a (hTNF_ a )在多种人类疾病中的有害作用，已经设计了治疗策略，以抑制或者抵消hTNF-a活性。具体而言，已经探寻了与hTNF-a结合并中和其的抗体，作为抑制hTNF-a活性的方法。一些最早的此类抗体是小鼠单克隆抗体(mAb)，其由制备自用hTNF-a免疫的小鼠的淋巴细胞的杂交瘤分泌(参见，例如Moeller等人的美国专利号N0.5，231，024)。尽管这些小鼠抗hTNF-a抗体通常对hTNF-a表现出高亲和力，并且能中和hTNF- a活性，但由于与将小鼠抗体施用给人相关的问题，其体内用途受到了限制，所述问题例如短的血清半寿期、不能引发某些人效应子功能，以及在人中引起针对小鼠抗体的不想要的免疫应答(“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)。
[0006]最近，已经将生物治疗用于自身免疫疾病如类风湿性关节炎的治疗。例如，FDA已经批准将4种TNFa抑制剂:REMICADE? (英夫利昔单抗(infliximab))、嵌合的抗Fe融合蛋白、HUMIRA?(阿达木单抗(adalimumab))、人抗-TNF a mAb,和 CTTVTZTA⑧(赛妥珠单抗(certolizumab pegol))、聚乙二醇化Fab片段用于治疗类风湿性关节炎。还将GIMZIA?用于治疗中度至重度克罗恩病(⑶)。尽管已经显示，此类生物学治疗在治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病如CD中是成功的，但并非全部经治疗的对象都应答或者良好应答此类疗法。此外，TNF α抑制剂的施用能诱导对药物的免疫应答，并导致产生自体抗体如人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(ΗΑΜΑ)。此类HACA、HAHA或HAMA免疫应答能够与超敏反应和免疫治疗性TNF α抑制剂的药物动力学和生物分布的急剧改变相关，后者阻碍了用药物的进一步治疗。因此，本领域存在对用于检测患者样品中针对生物制剂例如抗TNFa药物的自体抗体的存在的测定法的需求，以监测生物疗法并指导治疗决定。本发明满足了该需求，并还提供了相关的优点。
发明概述
[0007]本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFa药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定法。本发明用于当对象接受生物疗法(例如抗TNFa药物疗法)时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体随时间的形成。本发明也用于预测和/或确定对象样品中中和性抗药物抗体与备选生物疗法(例如备选抗TNF α疗法)的交叉反应性。同样地，本发明提供用于指导接受使用生物制剂疗法的对象的治疗决定的信息，以及改善对生物疗法的优化疗法、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。
[0008]在一方面，本发明提供用于检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括:
Ca)将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成:
(i)经标记的生物制剂和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分，和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的生物制剂结合部分、游离的经标记的生物制剂，和/或经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如，通过测量只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC)，从而确定中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。
[0009]在某些实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比降低(例如实质上降低)或不存在(例如不可检测)时，检测到非中和性形式的自体抗体。
[0010]另一方面，本发明提供用于测量样品中针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成:
(i)经标记的生物制剂和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分，和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的生物制剂结合部分、游离的经标记的生物制剂，和/或经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比(例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC以计算游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比)，其中对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0011]在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比与步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0012]在另一方面，本发明提供用于确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同)生物制剂具有交叉反应性的方法，所述方法包括:
(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和
如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则:
(b)将样品与经标记的第二生物制剂接触，以形成经标记的第二生物制剂和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物(即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(C)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物(即与游离的经标记的第二生物制剂分离)；和
(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二生物制剂具有交叉反应性。
[0013]在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二生物药物的活性。
[0014]在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体不与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不抑制第二生物药物的活性。[0015]在一些实施方式中，生物制剂包括抗体(例如抗TNFa单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子诸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。
[0016]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物制剂疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
[0017]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括，但不限于，人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0018]在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。
[0019]在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。
[0020]在一个特别的方面，本发明提供检测样品中针对抗TNF α药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的抗TNFa药物和经标记的TNFa接触，以形成:
(i)经标记的抗TNFa药物和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的抗TNF α药物、经标记的TNF a，和自体抗体的第二经标记的复合物(SP免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的TNF a、游离的经标记的抗TNF α药物，和/或经标记的抗TNF a药物和经标记的TNF α的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFa的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中游离的经标记的TNF α的水平(例如，通过测量只含游离的经标记的TNF α的参考样品在SEC后游离的经标记的TNF α峰的AUC)，从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。
[0021]在某些实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFa的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFa的水平相比降低(例如实质上降低)或不存在(例如不可检测)时，检测到非中和性形式的自体抗体。
[0022]另一方面，本发明提供用于测量样品中针对抗TNFa药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的抗TNF α药物和经标记的TNF α接触，以形成:
(i)经标记的抗TNF α药物和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或(?)经标记的抗TNF α药物、经标记的TNF α，和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的TNF α、游离的经标记的抗TNF α药物，和/或经标记的抗TNF α药物和经标记的TNFa的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFa的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比(例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的TNF α的参考样品在SEC后游离的经标记的TNF α峰的AUC’以计算游离的经标记的TNF a的水平或百分比)，其中对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0023]在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比与步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0024]在另一个特别的方面，本发明提供确定针对第一抗TNFa药物的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同)抗TNF α药物具有交叉反应性的方法，所述方法包括:
(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和
如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则:
(b)将样品与经标记的第二抗TNFa药物接触，以形成经标记的第二抗TNFα药物和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物(即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(C)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物(即与游离的经标记的第二抗TNF α药物分离)；和
(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一抗TNF α药物的中和性形式的自体抗体是否与第二抗TNF α药物具有交叉反应性。
[0025]在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一抗TNF α药物的中和性自体抗体与第二抗TNF α药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二抗TNFa药物的活性。
[0026]在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一抗TNF α药物的中和性自体抗体不与第二抗TNF α药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不抑制第二抗TNF α药物的活性。
[0027]在一些实施方式中，抗 TNF α药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿达木单抗)、CIMZIA? (赛妥珠单抗)、SIMPONI? (戈利木单抗(golimumab) ；CNT0148)及其组合。
[0028]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFa药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有TNFa介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(⑶)或溃疡性结肠炎(UC))。
[0029]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFa药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNF α药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0030]在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的抗TNF α药物和经标记的TNF α接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。
[0031]在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对抗TNFa药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。
[0032]在其他方面，本发明提供用于在接受使用生物制剂的疗程的对象中对生物制剂进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括:
(a)根据本文所说明的测定法在疗程中的多个时间点检测或测量针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比；
(b)检测中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变；和
(C)基于中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。
[0033]在一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用生物制剂的疗程的对象中对生物制剂进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括:
(a)在时间点h如本文所述测量来自对象的第一样品中针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；
(b)在时间At1如本文所述测量来自对象的第二样品中的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；
(c)在时间点tn+1任选地对来自对象的η个额外的样品重复步骤(b),其中η是从I至约 25 的整数(例如 η 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范围)；
(d)检测中和性形式的自体抗体的水平或百分比从时间点h至h或从时间点h至tn+1的改变；和
(e)基于中和性形式的自体抗体的水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。
[0034]在额外的方面，本发明提供用于在接受使用第一生物制剂的疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法，所述方法包括:
(a)通过根据本文说明的测定法检测或测量来自对象的样品中中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同的)生物制剂具有交叉反应性；和
(b)如果中和性形式的自体抗体与第二生物制剂具有交叉反应性，确定应当向对象施用不同的疗程。
[0035]在一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用抗TNFa药物的疗程的对象中对抗TNF α药物进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括:
(a)根据本文所说明的测定法在疗程中的多个时间点检测或测量针对抗TNFa药物的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比；(b)检测中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变；和(C)基于中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。
[0036]在另一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用抗TNFa药物的疗程的对象中对抗TNF α药物进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括:
(a)在时间点h如本文所述测量来自对象的第一样品中针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比； (b)在时间At1如本文所述测量来自对象的第二样品中的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；
(c)在时间点tn+1任选地对来自对象的η个额外的样品重复步骤(b),其中η是从I至约 25 的整数(例如 η 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范围)；
(d)检测中和性形式的自体抗体的水平或百分比从时间点h至h或从时间点h至tn+1的改变；和
(e)基于中和性形式的自体抗体的水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。
[0037]在另一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用第一抗TNFa药物的疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法，所述方法包括:
(a)通过根据本文说明的测定检测或测量来自对象的样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一抗TNFa药物的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同的)抗TNFa药物具有交叉反应性；和
(b)如果中和性形式的自体抗体与第二抗TNFa药物具有交叉反应性，确定应当向对象施用不同的疗程。
[0038]从以下的详细说明和附图中，本发明的其他目的、特征和优势对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
[0039]图1说明了 Nab百分比(y轴)和ATI水平之间存在明显的关系。
[0040]图2说明了≥60U/ml的ATI浓度预示着Nab+。
[0041 ]图 3 说明了 ATI 预测 Nab 的 ROC AUC 为 0.931。
[0042]图4说明了用本发明的液相迁移率变动测定法检测ATI。
[0043]图5说明了本发明的示例性ATI/IFX液相迁移率变动测定法。
[0044]图6说明了本发明的非中和性抗药物抗体(ADA)测定法。
[0045]图7说明了本发明的中和性ADA测定法。
[0046]图8说明了间隔1、2或3个月取自UC患者的5个样品中IFX和ATI水平随时间过程的变化。
[0047]图9显示了确定UC患者中随时间的游离TNF α的百分比的峰分析。
[0048]图10说明了在间隔2或3个月取自UC患者的并掺有IFX的3个样品中从非中和性自体抗体到中和性自体抗体的存在的转变。
[0049]图11显示了确定取自UC患者的掺有IFX的样品中随时间的游离TNF α的百分比的峰分析。
[0050]图12显示了使用兔抗人IgGlFc作为非中和性抗体(Ab)对照。
[0051]图13显示了使用ATI阳性血清作为混合的中和性抗体(NAb)/非中和性抗体(Ab)对照。
[0052]图14显示了从ATI阳性血清纯化ATI导致较弱亲和性Nab的损失。
[0053]图15说明了对UC患者案例研究的峰分析，以确定游离TNF α在多种对照中的百分比。
[0054]图16说明了对CD患者案例研究的峰分析，以确定在30周的期间间隔7或8周取得的4个样品中随时间过程的游离TNFa的百分比。
[0055]图17说明了对另一个CD患者案例研究的峰分析，以确定在50周的期间取得的3个样品中随时间过程的游离TNFa的百分比。
[0056]图18说明了来自4个额外的CD患者案例研究中的峰分析，以确定在诱导或维持疗法期间或之后的特别周时的样品中的游离TNFa的百分比。
[0057]图19说明了通过迁移率变动测定法检测非中和性抗体活性。
[0058]图20描述了 ADA对IFX和ADL的交叉反应性，其中ADA的结合位点模拟TNF α的结合位点，因而可以结合多种抗TNFa药物。
[0059]图21说明了 2个患者样品(患者I和2)，其中确定了应答一种抗TNF药物产生的Nab对于其他抗TNF药物的交叉反应性。特别地，针对Humira(ADL)对患者接受Remicade(IFX)治疗时产生的Nab进行测试。
[0060]图22说明了检测针对药物例如IFX或ADL的非中和性抗体(非NAb)(顶部)或中和性抗体(NAb)(底部)的存在的本发明的测定法的示例性实施方式。
[0061]图23说明了 Nab标准曲线的产生和使用。
[0062]图24提供了用IFX治疗，但失去了对IFX的应答的患者3的案例研究的结果，以确定针对IFX产生的Nab对ADL的交叉反应性。
[0063]图25提供了用IFX治疗，但失去了对IFX的应答的患者4的案例研究的结果，以确定针对IFX产生的Nab对ADL的交叉反应性。
[0064]图26说明了证明ATI亲和性成熟和交叉反应性ATI产生的患者研究的非限制性实例。
发明详述 I.引目
[0065]本发明部分基于下述发现:使用大小排阻层析和任选地酸解离以使得能够平衡免疫复合物的同质迁移率变动测定法对于测量针对生物制剂例如抗TNFa药物产生的中和性和非中和性形式的自身抗体(例如，HACA、HAHA等)的存在或水平是特别有利的。此类自身抗体也被称为抗药物抗体或ADA，并且其中和性和非中和性形式也被分别称为NAb和非NAb。
[0066]在特别的实施方式中，本发明的同质迁移率变动测定法是通过将对象的样品与(例如荧光)经标记的生物制剂(例如抗TNF α药物)和(例如荧光)经标记的生物制剂结合部分(例如TNFa )接触进行的。至少由于以下原因，本文说明的测定法是有优势的:它们避免了对移除低亲和力ADA的洗脱步骤的需求；它们使用不同的标记例如荧光团，所述荧光团允许在可见、IR和/或近IR (NIR)光谱检测，降低背景和血清干扰问题；它们由于荧光标记检测的高灵敏度，增加了检测对象中的低滴度的中和性或非中和性ADA的能力；并且它们以液相反应进行，从而减少通过附着到固体表面例如ELISA板导致表位的任何改变的机会。
[0067]在示例性实施方式中，本发明的测定法是有优势的，因为它们使得能够进行接受抗TNFa药物疗法的IBD对象的时间过程案例研究，用于监测不同时间点的多个样品中的中和性和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明的测定法也是有优势的，因为它们使得能够确定在对象接受抗TNFa药物疗法期间是否存在随着时间的从非中和性抗药物抗体至中和性抗药物抗体的转变。不限于任何特别理论，中和性抗药物抗体可具有显著的负面临床结果，因为它们干扰抗TNF α药物与TNF α之间的结合，从而导致效力损失。
[0068]在额外的示例性实施方式中，本发明的测定法用于预测和/或确定对象的样品中的中和性抗药物抗体与备选生物药物例如其他抗TNFa药物的交叉反应性。仅用于说明目的，如果样品含有针对一种抗TNF α药物的中和性ADA，这些中和性ADA将可能与其他抗TNFa药物交叉反应并中和，使得对象的推荐的治疗调整将为转变为具有不同作用机制的药物(例如非抗TNF剂)。然而，如果样品含有针对一种抗TNF α药物的非中和性ADA，对象的推荐的治疗调整可为转变为另一抗TNF α药物。
[0069]因此，本发明通过提供用于指导接受抗TNFa药物疗法的对象的治疗决定的信息，部分地解决并克服了现有的与抗TNF α药物，例如英夫利昔单抗和阿达木单抗的施用相关的限制。本发明的方法特别用于监测接受抗TNF α药物疗法的那些对象以检测或测量中和性ADA的形成和/或发展(例如在抗TNF α药物疗法过程中随时间)，并且也用于检测或测量当对象接受抗TNF α药物疗法时中和性ADA的量、百分比或比率与非中和性ADA相比随时间的改变(例如增加)。
[0070]因此，本发明提供了这样的方法，所述方法用于确定何时和/或如何(I)根据中和性ADA的存在、水平或百分比调整或修改(例如增加或减少)抗TNF α药物随后的剂量以优化治疗效力和/或降低毒性，(2)根据中和性ADA的存在、水平或百分比组合抗TNF α药物(例如以起始、增加的、减少的或相同的剂量)与一种或多种免疫抑制剂例如甲氨蝶呤(MTX)或硫唑嘌呤(AZA)，和/或(3)根据中和性ADA的存在、水平或百分比改变现有疗程(例如转变为不同的抗TNF α药物或转变为靶向不同机制的药物)。此类方法用于确保接受抗TNF a药物的对象获得正确的剂量，即他们不发展出针对药物的免疫应答，以及他们由于起始药物的失败(例如发展出针对起始抗TNFa药物的交叉反应性中和性ADA)应当转变为不同的药物。
I1.定义
[0071]如本文所用，除非另有说明，以下术语具有给定的含义。
[0072]如本文所用的术语“生物制剂”或“生物活性剂”或“生物药物”包含从生物系统(例如活生物体)生产或提取的产品和物质。生物制剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多价结合蛋白(例如DVD Ig),抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。
[0073]术语“生物制剂结合部分”包括(例如特异性地)与生物制剂结合或相互作用的任何分子、活性剂或物质。在某些情况下，中和性形式的自体抗体干扰生物制剂结合部分和生物制剂之间的结合。在某些其他情况下，非中和性形式的自体抗体不干扰生物制剂结合部分和生物制剂之间的结合。作为一个非限制性实例，当生物制剂包含抗TNFa药物时，生物制剂结合部分包含TNF α。作为另一个非限制性实例，当生物制剂包含白介素例如IL-2时，生物制剂结合部分包含白介素受体(例如白介素受体的可溶性细胞外片段)。
[0074]如本文所用的术语“抗TNFa药物”或“TNFa抑制剂”意欲包含通过例如抑制TNFa与TNFa的细胞表面受体的相互作用、抑制TNF α蛋白生产、抑制TNFa基因表达、抑制TNFa从细胞分泌、抑制TNF α受体发信号或导致对象中TNF α活性降低的任何其他方法直接或间接抑制TNFa活性的活性剂，包括蛋白、抗体、抗体片段、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多价结合蛋白(例如DVD Ig)、小分子TNFa拮抗剂和类似的天然或非天然存在分子，和/或其重组和/或改造的形式。术语“抗TNFa药物”或“TNFa抑制剂”优选地包括干扰TNF α活性的活性剂。抗TNF α药物的实例包括但不限于英夫利昔单抗(REMICADE?, Johnson and Johnson)、人抗TNF单克隆抗体阿达木单抗(D2E7/HUMIRA?, Abbott Laboratories)、依那西普(ENBREL?, Amgen)、CDP571 (Celltech)，⑶P870 (Celltech)，以及其他抑制TNFa活性的化合物，使得当施用于罹患或有风险罹患TNFa活性有害的病症(例如RA)的对象中时，病症被治疗。
[0075]术语“TNFa ”意欲包括以17kDa分泌形式和26kDa膜缔合形式存在的人细胞因子，其生物学活性形式由非共价结合的17kDa分子的三聚体组成。TNFa的结构还描述于，例如Jones 等人，Nature，338:225-228 (1989)中。术语 TNF α 意欲包括人 TNF α、重组人 TNF α(rhTNF- α )或与人TNF α蛋白质具有至少约80%同一性的TNF α。人TNF α由35个氨基酸(aa)的胞质结构域、21个氨基酸的跨膜区段，以及177个氨基酸胞外结构域(ECD)组成(Pennica, D.等人(1984) Nature312:724)。在 ECD 内，人 TNFa 与恒河猴 TNF α 共有 97%的氨基酸序列同一性，并且与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠TNFa共有71%至92%的氨基酸序列同一性。可以通过标准重组表达方法或商业购买(R&D Systems，货号210-TA，Minneapolis, Minn.)制备 TNF α。
[0076]在某些实施方式中，“TNFa ”是抗原，其包括能被抗TNF-α药物结合的分子或者该分子的一部分。TNFa可以具有一个或一个以上的表位。在某些实例中，TNFa将以高选择性方式与抗TNFa抗体反应。与抗体、抗TNFa抗体的片段和区域结合的优选的抗原包括人TNF α的至少5个氨基酸。在某些实例中，TNF α具有足够长度以具有TNF α的表位，所述表位能结合抗TNF α抗体、其片段和区域。
[0077]术语“大小排阻色谱”或“SEC”包括其中溶液中的分子基于其大小和/或流体动力学体积分离的色谱方法。它用于大分子或大分子复合物例如蛋白质及其缀合物。通常，当用水性溶液运送样品通过柱时，技术称为凝胶过滤色谱。
[0078]术语“复合物”、“免疫复合物”、“缀合物”和“免疫缀合物”包括但不限于，结合于(例如通过非共价方式)抗TNF α药物的TNF α、结合于(例如通过非共价方式)针对抗TNF a药物的自体抗体(例如中和性或非中和性抗药物抗体)的抗TNF α药物，和结合于(例如通过非共价方式)TNFa和针对抗TNFa药物的自体抗体(例如中和性或非中和性抗药物抗体)的抗TNF α药物。
[0079]如本文中所用，受术语“经标记的”修饰的实体包括与在经验上可检测到的另一分子或化学实体缀合的任何实体、分子、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关种类。适合作为用于经标记的实体的标记的化学种类包括但不限于，荧光染料，例如Alexa Fluor?
染料如Alexa Fluor? 647、量子点(quantum dot)、光学染料、发光染料和放射性核素如
12510
[0080]短语“荧光标记检测”包括检测荧光标记的工具。用于检测的工具包括但不限于分光光度计、荧光光度计、光度计以及通常与色谱设备，例如但不限于大小排阻高效液相色谱，例如但不限于Agilent-1200HPLC系统整合的检测装置。
[0081]短语“优化疗法”包括优化特定疗法的剂量(例如有效量或水平)和/或类型。例如，优化抗TNFa药物的剂量包括增加或减少随后施用给对象的抗TNF α药物的量。在某些情况下，优化抗TNF α药物的类型包括将施用的抗TNF α药物从一种药物改为不同的药物(例如，不同的抗TNFa药物或靶向不同机制的药物)。在其他情况下，优化疗法包括将一定剂量的抗TNFa药物(例如，以增加的、减少的或者与以前的剂量相同的剂量)与一种或多种免疫抑制药物组合共同施用。
[0082]术语“共同施用”包括施用一种以上的活性剂，以使一种活性剂的生理作用的持续时间与第二种活性剂的生理作用重叠。
[0083]术语“对象”、“患者”或“个体”通常指人，但也指其他动物，包括例如其他灵长类、
啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。
[0084]术语“疗程”包括用于缓解或预防与疾病或病症相关的一种或多种症状的治疗方法。该术语包括施用用于改善患疾病或病症的个体的健康的任何化合物、药物、方法和/或方案，并包括本文中所述的任意治疗剂。作为非限制性的实例，基于TNFa、抗TNF α药物和/或抗药物抗体的存在或浓度水平(例如，使用本发明方法确定的中和性和/或非中和性抗药物抗体的存在、水平，或百分比)，可以改变(例如，增加或减少)疗程或者当前疗程的剂量。
[0085]术语“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”包括能产生免疫抑制作用(例如防止或减少免疫应答)的任何物质，例如通过辐射或者通过施用药物，如抗代谢物、抗淋巴细胞血清、抗体等。免疫抑制药物的实例包括但不限于，巯基嘌呤药物如硫唑嘌呤(AZA)及其代谢物；抗代谢物如甲氨蝶呤(MTX);西罗莫司(纳巴霉素)；坦罗莫司；依维莫司；他克莫司(FK-506)；FK-778 ;抗淋巴细胞球蛋白抗体、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体和抗体-毒素缀合物；环孢霉素；麦考酹酯(mycophenolate);咪唑立宾单磷酸(mizoribinemonophosphate);蒿属香豆素；格拉默醋酸盐(glatiramer acetate);其代谢物；其制药学上可接受的盐；其衍生物；其前体药物；及其组合。
[0086]术语“巯基嘌呤药物”包括硫唑嘌呤(AZA)、6_巯基嘌呤(6-MP)或者具有治疗作用的其任意代谢物，并且包括但不限于，6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-甲基巯基嘌呤核苷、6-硫代肌苷核苷酸(例如，6-硫代肌苷单磷酸(thioinosine monophosphate )>6-硫代肌苷二磷酸(6-thioinosine diphosphate)、6_ 硫代肌苷三憐酸(6_thioinosine triphosphate))、6-硫鸟嘌呤核苷酸(例如，6-硫代鸟嘌呤单磷酸、6-硫鸟嘌呤二磷酸、6-硫鸟嘌呤三磷酸)、6-硫代黄苷(thioxanthosine)核苷酸(例如,6-硫代黄苷单磷酸、6-硫黄苷二磷酸、6-硫黄苷三磷酸)，其衍生物、其类似物及其组合。
[0087]术语“样品”包括获自个体的任何生物样本。样品包括但不限于，全血、血浆、血清、红血细胞、白血细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC)、多形核(PMN)细胞)、导管灌洗液、乳头吸出物、淋巴(例如，淋巴结的弥散性肿瘤细胞)、骨髓吸出物、唾液、尿液、粪便(即，大便)、痰、支气管灌洗液、泪液、细针吸出物(例如，通过随机的乳晕细针吸出获取)、任意其他体液、组织样品如炎症位点的活检(例如，穿刺活检)、其细胞提取物，以及来源于一种或多种这些体液或组织的免疫球蛋白富集级分。在一些实施方式中，样品是全血、其分级组分，如血浆、血清或细胞沉淀，或者其免疫球蛋白富集级分。本领域技术人员应当理解，可以在分析前稀释样品，如血清样品。在某些实施方式中，使用本领域已知的任何技术，可以通过分离PBMC和/或PMN细胞获得样品。在某些其他实施方式中，样品是例如来自炎症位点(如胃肠道或滑膜组织的一部分)的组织活检。
[0088]本发明方法的步骤不需要必须以它们所显示的特定顺序进行。本领域技术人员应当理解，本发明方法的步骤的其他顺序包括在本发明范围内。
[0089]括号，“[]”表示括号内的种类以其浓度提及。
II1.实施方式说明
[0090]本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFa药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定。本发明用于当对象接受生物制剂疗法(例如抗TNFa药物疗法)时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明也用于预测和/或确定对象样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制剂疗法(例如备选抗TNFa疗法)的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受使用生物活性剂疗法的对象的治疗决定的信息，以及改善对生物疗法的优化疗法、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。
[0091]在一方面，本发明提供用于检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成:
(i)经标记的生物制剂和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分，和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的生物制剂结合部分、游离的经标记的生物制剂，和/或经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如，通过测量只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC)，从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。
[0092]在一些实施方式中，中和性形式的自体抗体干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。在其他实施方式中，非中和性形式的自体抗体不干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。
[0093]在一些情况下，游离的经标记的生物制剂结合部分由实质上不含结合的生物制剂(例如经标记的和/或未标记的生物制剂)的经标记的生物制剂结合部分组成。
[0094]在某些实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比降低(例如实质上降低)或不存在(例如不可检测)时，检测到非中和性形式的自体抗体。
[0095]在特别的实施方式中，当步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是对照样品中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%时，它被认为与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平实质上相同。在特别的实施方式中，当步骤(c)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平比对照样品中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的低至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时，它被认为与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比实质上降低。
[0096]在一些实施方式中，游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC)进行积分测量的。
[0097]在一些实施方式中，生物制剂包括抗体(例如抗TNFa单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子诸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。
[0098]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物制剂疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
[0099]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)，和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0100]另一方面，本发明提供用于测量样品中针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成:
(i)经标记的生物制剂和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)； (b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的生物制剂结合部分、游离的经标记的生物制剂，和/或经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的生物制剂结合部分的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC));和 (d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比(例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC，以计算游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比)，其中对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0101]在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比与步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平之间的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0102]在一些情况下，游离的经标记的生物制剂结合部分由实质上不含结合的生物制剂(例如经标记的和/或未标记的生物制剂)的经标记的生物制剂结合部分组成。
[0103]在特别的实施方式中，对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比是通过测量经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分之间形成的复合物(例如“经标记的复合物”)的峰面积(例如通过测量AUC)，并然后从游离的经标记的生物制剂结合部分的峰面积(例如通过测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC)减去经标记的复合物的测量的峰面积而标准化的。
[0104]在某些实施方式中，游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积(AUC)进行积分测量的。在其他实施方式中，在经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分之间形成的复合物的水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC进行积分测量的。
[0105]在某些实施方式中，针对生物制剂(例如ADA)的自体抗体的亚群是中和性形式的自体抗体(例如NAb)。在一些实施方式中，样品中针对生物制剂的自体抗体的总水平可通过将根据本发明的方法测量的中和性和非中和性形式的自体抗体的水平相加而计算。
[0106]在一些实施方式中，步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平还与阴性对照、阳性对照或其组合比较。在其他实施方式中，步骤(d)中确定的中和性形式的自体抗体(例如NAb)的百分比与从健康对照(例如正常人血清)建立的截断值或参考范围相比较。在一些实施方式中，截断值或参考范围表示为样品为了被认为是NAb阳性所必须具有的NAb的阈值百分比。在此类实施方式中，当步骤(d)中确定的NAb的百分比大于或等于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品被认为是NAb阳性。在其他实施方式中，当步骤(d)中确定的NAb的百分比小于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品被认为是NAb阴性。截断值或参考范围的非限制性的实例包括例如至少约0.25%,0.50%,0.75%、
1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、2.60%、2.70%、2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、
3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、
4.50%,5.00%,5.50%,6.00%,6.50%,7.00%,7.50%,8.00%,8.50%,9.00%,9.50%、10.00%NAb,或其中任何范围。
[0107]在一些实施方式中，所有的针对生物制剂的自体抗体都是中和性抗体，且样品被定义为含有100%的中和性抗药物抗体(NAb)和/或0%非中和性抗药物抗体(非NAb)。在此类实施方式中，步骤(C)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相同，并且自体抗体被预测完全阻断或干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。
[0108]在其他实施方式中，没有自体抗体是中和性自体抗体，且样品被定义为含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此类实施方式中，与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比，步骤(c)中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平通常为不存在，并且自体抗体被预测不完全阻断或干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。
[0109]在其他实施方式中，当中和性和非中和性形式的自体抗体均存在于样品中时，两类抗体的百分比可以它们本身表示(例如50%NAb或50%非NAb被定义为样品中相等比例的NAb和非NAb)或以比例表示。在某些情况下，比例是通过NAb的百分比除以非NAb的百分比计算的，或者反之亦然。在其他情况下，比例是通过NAb的水平除以非NAb的水平计算的，或者反之亦然。
[0110]在一些实施方式中，生物制剂包括抗体(例如抗TNFa单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子诸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。
[0111]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
[0112]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0113]在另一方面，本发明提供用于确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同)生物制剂具有交叉反应性的方法，所述方法包括:
(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和
如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则:
(b)将样品与经标记的第二生物制剂接触，以形成经标记的第二生物制剂和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物(即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；
(C)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物(即与游离的经标记的第二生物制剂分离)；和
(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二生物制剂具有交叉反应性。
[0114]在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二生物药物的活性。
[0115]在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体不与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不会抑制第二生物药物的活性。[0116]在一些实施方式中，第一和第二生物制剂独立地选自抗体(例如抗TNFa单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子诸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。
[0117]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
[0118]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0119]在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。
[0120]在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。
[0121]在一个特别的方面，本发明提供用于检测样品中针对抗TNFa药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的抗TNFa药物和经标记的TNFα接触，以形成:
(i)经标记的抗TNF α药物和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的抗TNFa药物、经标记的TNFa和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的TNF a、游离的经标记的抗TNF α药物，和/或经标记的抗TNF a药物和经标记的TNF α的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFa的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中游离的经标记的TNF α的水平(例如，通过测量只含游离的经标记的TNF α的参考样品在SEC后游离的经标记的TNF α峰的AUC)，从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。
[0122]在一些实施方式中，中和性形式的自体抗体干扰抗TNFa药物和TNFa之间的结合。在其他实施方式中，非中和性形式的自体抗体不干扰抗TNFa药物和TNFa之间的结
合ο
[0123]在一些情况下，游离的经标记的TNF α由实质上不含结合的抗TNF α药物(例如经标记的和/或未标记的抗TNF α药物)的经标记的TNF α组成。
[0124]在某些实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFa的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFa的水平相比降低(例如实质上降低)或不存在(例如不可检测)时，检测到非中和性形式的自体抗体。[0125]在特别的实施方式中，当步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平是对照样品中测量的游离的经标记的TNFa的水平的至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 时，它被认为与对照样品中游离的经标记的TNFa的水平实质上相同。在特别的实施方式中，当步骤(C)中测量的游离的经标记的TNF α的水平比对照样品中测量的游离的经标记的TNF α水平低至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时，它被认为与对照样品中游离的经标记的TNFa的水平相比实质上降低。
[0126]在某些实施方式中，游离的经标记的TNFa水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC)进行积分测量的。
[0127]在一些实施方式中，抗TNF α药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA? (阿达木单抗)、CIMZIA? (赛妥珠单抗)、SIMPONI? (戈利木单抗；CNT0148)及其组合。
[0128]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFa药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有TNFa介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(⑶)或溃疡性结肠炎(UC))。
[0129]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFa药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNF α药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)，和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0130]在另一方面，本发明提供用于测量样品中针对抗TNF α药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)将样品与经标记的抗TNFα药物和经标记的TNF α接触，以形成:
(i)经标记的抗TNF α药物和自体抗体的第一经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着)；和/或
(?)经标记的抗TNFa药物、经标记的TNFa和自体抗体的第二经标记的复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离(即未结合)的经标记的TNF α、游离的经标记的抗TNF α药物和/或经标记的抗TNF a药物和经标记的TNF α的复合物分离；
(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFa的水平(例如通过在大小排阻色谱(SEC)后测量游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC));和
(d)比较在步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平与对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比(例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的TNF α的参考样品在SEC后游离的经标记的TNF α峰的AUC’以计算游离的经标记的TNF a的水平或百分比)，其中对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0131]在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的TNFa的经标准化的水平或百分比与步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。
[0132]在一些情况下，游离的经标记的TNFa由实质上不含结合的抗TNF α药物(例如经标记的和/或未标记的抗TNF α药物)的经标记的TNF α组成。
[0133]在特别的实施方式中，对照样品中游离的经标记的TNFa水平或百分比是通过测量经标记的抗TNF α药物和经标记的TNF α之间形成的复合物(例如“经标记的复合物”)的峰面积(例如通过测量AUC)，然后从游离的经标记的TNF α的峰面积(例如通过测量游离的经标记的TNF α峰的AUC)减去经标记的复合物的测量的峰面积而标准化的。
[0134]在某些实施方式中，游离的经标记的TNFa的水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFa峰的曲线下面积(AUC)进行积分测量的。在其他实施方式中，在经标记的抗TNFa药物和经标记的TNFa之间形成的复合物的水平是通过对来自大小排阻色谱(例如SEC-HPLC)的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFa峰的AUC积分测量的。
[0135]在某些实施方式中，针对抗TNFa药物(例如ADA)的自体抗体的亚群是中和性形式的自体抗体(例如NAb)。在一些实施方式中，样品中针对抗TNFa药物的自体抗体的总水平可通过将根据本发明的方法测量的中和性和非中和性形式的自体抗体的水平相加而计笪
[0136]在一些实施方式中，步骤(C)中测量的游离的经标记的TNFa的水平还与阴性对照、阳性对照或其组合比较。阴性对照的非限制性实例包括小鼠单克隆抗人IgG1Fc样品和/或兔单克隆抗人IgG1Fc样品。阳性对照的非限制性实例包括混合的ADA阳性患者血清样品和/或针对抗TNFa药物的F(ab’)2片段的兔多克隆抗体的样品。
[0137]在其他实施方式中，步骤(d)中确定的中和性形式的自体抗体(例如NAb)的百分比与从健康对照(例如正常人血清)建立的截断值或参考范围相比较。在特别的实施方式中，截断值或参考范围表示为样品为了被认为是NAb阳性所必须具有的NAb的阈值百分比。在此类实施方式中，当步骤(d)中确定的NAb的百分比大于或等于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方式中，当步骤(d)中确定的NAb的百分比小于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品是NAb阴性。截断值或参考范围的非限制性的实例包括例如至少约 0.25%,0.50%,0.75%、1.00%、1.50%,2.00%,2.50%,2.60%,2.70%、
2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、
3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%、6.00%、6.50%、7.00%、
7.50%、8.00%、8.50%、9.00%、9.50%、10.00%NAb,或其中任何范围。在一些情况下,截断值或参考范围是约3.00%NAb 或约3.06%NAb或在3.00%-3.10%NAb之间。
[0138]在一些实施方式中，所有的针对抗TNFa药物的自体抗体都是中和性抗体，并且样品被定义为含有100%中和性抗药物抗体(NAb)和/或0%非中和性抗药物抗体(非NAb)。在此类实施方式中，步骤(c)中测量的游离的经标记的TNFa的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的TNFa水平的相同，并且自体抗体被预测完全阻断或干扰抗TNFa药物和TNF α之间的结合。
[0139]在某些实施方式中，没有针对抗TNF α药物的自体抗体是中和性抗体，并且样品被定义为含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此类实施方式中，步骤(C)中测量的游离的经标记的TNF α的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的TNF α水平相比是不存在(例如不可检测)，并且自体抗体被预测不完全阻断或干扰抗TNFa药物和TNFa之间的结
口 O
[0140]在其他实施方式中，当中和性和非中和性形式的自体抗体均存在于样品中时，两类抗体的百分比可以其本身表示(例如50%NAb或50%非NAb被定义为样品中相等比例的NAb和非NAb)或以比例表示。在某些情况下，比例是通过NAb的百分比除以非NAb的百分比计算的，或者反之亦然。在其他情况下，比例是通过NAb的水平除以非NAb的水平计算的，或者反之亦然。
[0141]在一些实施方式中，抗TNFa药物选自REMICADE?(英夫利昔单抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿达木单抗)、CIMZIA? (赛妥珠单抗)、SIMPONI? (戈利木单抗；CNT0148)及其组合。
[0142]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFa药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有TNFa介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(⑶)或溃疡性结肠炎(UC))。
[0143]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFa药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNF α药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0144]在另一个特别的方面，本发明提供用于确定针对第一抗TNFa药物的中和性形式的自体抗体是否与第二(即不同)抗TNFa药物具有交叉反应性的方法，所述方法包括:
(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和
如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则:
(b)将样品与经标记的第二抗TNFa药物接触，以形成经标记的第二抗TNFα药物和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物(即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着);
(C)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物(即与游离的经标记的第二抗TNF α药物分离)；和
(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一抗TNF α药物的中和性形式的自体抗体是否与第二抗TNF α药物具有交叉反应性。
[0145]在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一抗TNFa药物的中和性自体抗体与第二抗TNF α药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二抗TNFa药物的活性。
[0146]在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一抗TNFa药物的中和性自体抗体不与第二抗TNFa药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不抑制第二抗TNF α药物的活性。
[0147]在特别的实施方式中，第一和第二抗TNFa药物独立地选自REMICADE?(英夫利昔单抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿达木单抗)、CIMZIA? (赛妥珠单抗)、
SIMPONI? (戈利木单抗；CNT0148)及其组合。[0148]在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFa药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在【具体实施方式】中，对象患有TNF α介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(⑶)或溃疡性结肠炎(UC))。
[0149]在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFa药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNF α药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)及其组合。
[0150]在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的抗TNF α药物和经标记的TNF α接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。
[0151]使用酸解检测抗药物抗体的方法在本文和2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437中说明，出于全部目的将其公开内容在此以整体并入作为参考。
[0152]在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对抗TNFa药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。作为非限制性实例，本发明的测定法能够用于确定来自接受抗TNF α药物例如REMICADE? (英夫利昔单抗)或HUMIRA?(阿达木单抗)的ADA阳性患者的样品中不同的中和性和/或非中和性ADA同种型。在某些实施方式中，所述一种或多种同种型包含至少两种、三种、四种、五种或更多的同种型。在其他实施方式中，所述一种或多种同种型选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型、其亚类及其组合。在某些实施方式中，每个自体抗体同种型通过其保留时间表征、鉴定，和/或检测。在其他实施方式中，每个自体抗体同种型是根据信号表征、鉴定，和/或检测的，所述信号由检测器部分例如经标记的抗TNFa药物和不同抗体同种型特异性的经标记的抗Ig抗体的临近结合产生。在一些情况下，信号包含荧光信号，所述荧光信号可用荧光共振能量转移(FRET)检测。
[0153]检测抗药物抗体(ADA)同种型的方法在PCT
【发明者】S·豪恩施泰因, L·奥尔穆德, S·辛格, S·L·王 申请人:雀巢产品技术援助有限公司