用于治疗和诊断结直肠癌的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供与结直肠癌的检测、诊断和治疗相关的方法、组合物和试剂盒。将包括抗体的蛋白试剂或包括DNA的核酸试剂用于检测包括SPINK4、L1TDI、LY6G6D、APOBEC1、LOC729669、COL10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU和WNT10A在内的组中的一种或多种特异性生物标记物的表达水平。将受试样品中的一种或多种生物标记物的表达水平相对于包含非癌性细胞的参照样品中的表达水平进行比较。相对于所述非癌性细胞而言所述受试样品中的表达水平更高表明所述样品具有结直肠癌细胞。
【专利说明】用于治疗和诊断结直肠癌的方法和组合物
[0001]本申请要求2011年8月31日提交的美国临时申请61/529，525的优先权，该临时申请的整个内容据此以引用方式并入。
【技术领域】
[0002]【技术领域】涉及癌症以及癌症的诊断和治疗。
[0003]发明背景
[0004]癌症的早期检测可影响治疗结果和疾病进展。通常，癌症检测依赖于得自活组织检查、X光、CAT扫描、NMR等的诊断信息。这些程序可能是侵入性、耗时而又昂贵的。此外，它们就灵敏性和特异性而言存在局限。在癌症诊断领域存在对高特异性、高灵敏性、快速、低成本和相对非侵入性的癌症诊断方法的需要。在下文所述的本发明的各种实施方案满足此需要以及在癌症诊断和治疗领域存在的其他需要。
发明概要
[0005]本公开的实施方案提供例如结直肠癌的癌症的诊断、预后和治疗方法。其他实施方案提供与诸如结直肠癌的癌症的诊断、预后和治疗相关的组合物。
[0006]在某些实施方案中，本发明提供检测受试者中的结直肠癌的方法，其包括:a)从受试者获得样品山)将得自受试者的样品与检测由结直肠癌细胞表达的一种或多种标记物的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)将得自受试者的样品中的标记物表达水平与非癌性细胞中的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比样品中标记物的表达水平更高表明受试者患有结直肠癌。
[0007]在某些实施方案中，本发明提供检测受试者中的结直肠癌的方法，其包括:a)从受试者获得样品山)将得自受试者的样品与检测表I中所列标记物中的至少一种的表达的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)将得自受试者的样品中表I所列标记物中的一种或多种的表达水平与非癌性细胞中表I所列标记物中的一种或多种的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比得自受试者的样品中表I所列标记物中的一种或多种的表达水平更高表明受试者患有结直肠癌。
[0008]在一些实施方案中，本发明提供检测受试者中的结直肠癌的方法，其包括:a)从受试者中获得样品；b)将得自受试者的样品与检测由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达的一种或多种试剂接触:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶 11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5 (DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (Ν0Χ01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20 (KRT20)或其补体；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)比较非癌性细胞中由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE =6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669(L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导的)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体，其中与非癌性细胞相比在得自受试者的样品中由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明受试者患有结直肠癌:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物
4(非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923
5(BU536065)、人KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17 (MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (NOXOl)、人脂质运载蛋白15 (LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24 (CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2 (CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体。
[0009]在其他实施方案中，本发明提供检测受试者中的结直肠癌的方法，其包括:a)从受试者获得样品山)将得自受试者的样品与检测由基因SPINK4、LlTDU LY6G6D、APOBEC1、L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 或其补体编码的一组标记物的表达的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及 d)将得自受试者的样品中由基因 SPINK4、LlTDl、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A或其补体编码的所述一组标记物的表达水平与非癌性细胞中由基因 SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A或其补体编码的所述一组标记物的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比样品中由基因 SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBEC1、L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A或其补体编码的所述一组标记物的表达水平更高表明受试者患有癌症。
[0010]在一些实施方案中，本发明提供检测受试者中的结直肠癌的方法，其包括:a)从受试者获得样品山)将得自受试者的样品与检测由选自SPINK4、LlTDl、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 或其补体的基因编码的标记物中的一种或多种的表达的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)将得自受试者的样品中由选自SPINK4、LlTDl、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 或其补体编码的标记物中的一种或多种的表达水平与非癌性细胞中由选自SPINK4、L1TD1、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA或其补体编码的标记物中的一种或多种的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比得自受试者的样品中由选自SPINK4、LlTDULY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 或其补体的基因表达的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明受试者患有结直肠癌。
[0011]在另外的实施方案中，本发明提供检测样品中的结直肠癌的方法，其包括:a)获得样品山)将a)中得到的样品与检测由选自人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶 11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43(RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型α I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5 (DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (Ν0Χ01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20 (KRT20)或其补体的基因编码的标记物中的一种或多种的表达的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)将在a)中得到的样品中由选自人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶 11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5 (DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (Ν0Χ01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20 (KRT20)或其补体的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平与非癌性细胞中由选自人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆IMAGE:65639235 (BU536065)、人KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物1(果蝇属)(NKD1)、预测的:人假想L0C729669(L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I(NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比由选自人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE =6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669(L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I(NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明样品含有结直肠癌细胞。样品可以为体外样品或体内样品，或衍生自体内样品。
[0012]在某些实施方案中，本发明提供检测样品中的结直肠癌的方法，其包括:a)将样品与检测选自 SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBECK L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA的标记物中的至少一种的表达的一种或多种试剂接触；c)将非癌性细胞与得自b)的一种或多种试剂接触；以及d)将样品中选自SPINK4、LlTDU LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 的标记物中的一种或多种的表达水平与非癌性细胞中选自SPINK4、L1TD1、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA的标记物中的一种或多种的表达水平进行比较，其中与非癌性细胞相比样品中选自SPINK4、LlTDU LY6G6D、APOBECK L0C729669、COL10A,SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明样品具有结直肠癌细胞。
[0013]至于在前述段落中所述的实施方案，样品可以为下文所述的任何样品，例如体液，诸如血液、血清或尿液。样品可以为细胞样品或细胞样品的提取物。样品可以为组织样品。可从样品中分离核酸和/或蛋白。诸如RNA的核酸可转录成cDNA。试剂可以为特异性结合到由癌细胞表达的一种或多种蛋白或由细胞表达的一种或多种核酸的一种或多种分子。例如，试剂可以为特异性结合到由下文确定的标记基因之一表达的蛋白的蛋白，诸如抗体。试剂可以为杂交到由癌细胞表达的核酸的一种或多种核酸。由癌细胞表达的核酸可以为RNA分子，例如mRNA分子。杂交到由癌细胞表达的核酸的核酸分子可以为DNA分子,诸如DNA探针。[0014]在另外其他实施方案中，本发明提供可用于从非癌性细胞中区分结直肠癌细胞的物质组合物，其包含特异性结合到与非癌细胞相比在结直肠癌细胞上以较高水平表达的分子的一种或多种分子。例如，该组合物可包含结合到与非癌细胞相比由结直肠癌细胞以较高水平表达的一种或多种分子的蛋白。又如，该组合物可包含结合到与非癌细胞相比由结直肠癌细胞以较高水平表达的一种或多种分子的核酸。
[0015]在一些实施方案中，本发明提供包含诸如抗体的蛋白的物质组合物，该蛋白特异性结合到由结直肠癌细胞表达的分子，该分子选自由表I所列的序列编码的标记物。由结直肠癌细胞表达的分子可由癌细胞以比非癌性细胞所表达的水平更高的水平表达。
[0016]在另外的实施方案中，本发明提供包含诸如多种抗体的多种蛋白的物质组合物，这些蛋白特异性结合到一组由结直肠癌细胞表达的分子，其中该组标记物包括由基因SPINK4、LlTDU LY6G6D、APOBECK L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA或其补体编码的分子。该组标记物可按比非癌性细胞中该组标记物的水平更高的水平表达。
[0017]在某些实施方案中，本发明提供包含诸如抗体的蛋白的物质组合物，该蛋白特异性结合到由结直肠癌细胞表达的分子，该分子选自由选自以下的基因中的一种或多种编码的分子:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D (LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物
4(非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923
5(BU536065)、人KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17 (MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15 (LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24 (CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2 (CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23(组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体。由结直肠癌细胞表达的分子可由结直肠癌细胞以比非癌性细胞所表达的水平更高的水平表达。
[0018]在其他实施方案中，本发明提供包含核酸的物质组合物，该核酸特异性结合到由结直肠癌细胞表达的分子，诸如mRNA分子，其中该分子选自由表I所列的基因编码的标记物。由结直肠癌细胞表达的分子可由癌细胞以比非癌性细胞所表达的水平更高的水平表达。
[0019]在其他实施方案中，本发明提供包含核酸的物质组合物，该核酸特异性结合到由结直肠癌细胞表达的分子，诸如mRNA分子，其中该分子由下文所公开的基因编码，例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因，或其补体。由结直肠癌细胞表达的分子可由癌细胞以比非癌性细胞所表达的水平更高的水平表达。
[0020]在另外其他实施方案中，本发明提供确定受试者中的结直肠癌是否进展的方法，其包括:a)在第一时间点测量与结直肠癌相关的一种或多种标记物的表达水平；b)在第二时间点测量在a)中测量的所述一种或多种标记物的表达水平，其中第二时间点在第一时间点之后；以及c)对在a)和b)中测量的表达水平进行比较，其中与a)相比在b)中所述一种或多种标记物的表达水平升高表明受试者的结直肠癌正在进展。
[0021]在一些实施方案中，本发明提供确定受试者中的结直肠癌是否进展的方法，其包括:a)在第一时间点测量表I中所列的一种或多种标记物的表达水平；b)在第二时间点测量在a)中测量的所述一种或多种标记物的表达水平，其中第二时间点在第一时间点之后；以及c)对在a)和b)中测量的表达水平进行比较，其中与第一时间点相比在第二时间点所述一种或多种标记物的表达水平升高表明受试者的结直肠癌正在进展。
[0022]在其他实施方案中，本发明提供确定受试者中的结直肠癌是否进展的方法，其包括:a)在第一时间点测量由选自下文所公开的基因的基因编码的一种或多种标记物的表达水平，例如下文在标题“癌相关序列”下所公开的基因或其补体；b)在第二时间点测量在a)中测量的所述一种或多种标记物的表达水平，其中第二时间点在第一时间点之后；以及c)对在a)和b)中测量的表达水平进行比较，其中与第一时间点相比在第二时间点所述一种或多种标记物的表达水平升高表明受试者的结直肠癌正在进展。
[0023]在一些实施方案中，本发明提供与结直肠癌相关的抗原(即，癌相关多肽)作为诊断性和/或治疗性抗体的靶标。在一些实施方案中，该抗原可选自由表I所列的基因、其片段编码的蛋白，或由表I所列的基因编码的蛋白的组合。
[0024]在一些实施方案中，本发明提供与结直肠癌相关的抗原(即，癌相关多肽)作为诊断性和/或治疗性抗体的靶标。在一些实施方案中，该抗原可选自由选自下文(例如在标题“癌相关序列”下)所公开的基因、其片段的基因编码的蛋白，或由选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的基因(或其片段)编码的蛋白的组合。
[0025]在另外其他实施方案中，本发明提供引起对结直肠癌细胞的免疫反应的方法，其包括将受试者与由癌细胞表达的蛋白或蛋白片段接触，从而引起对结直肠癌细胞的免疫反应。例如，受试者可通过静脉内或肌内接触蛋白或蛋白片段。
[0026]在另外的实施方案中，本发明提供引起对结直肠癌细胞的免疫反应的方法，其包括将受试者与由选自表I所列的基因的基因编码的一种或多种蛋白或蛋白片段接触，从而引起对结直肠癌细胞的免疫反应。例如，受试者可通过静脉内或肌内接触蛋白或蛋白片段。
[0027]在另外其他实施方案中，本发明提供引起对结直肠癌细胞的免疫反应的方法，其包括将受试者与由选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关基因”下所公开的基因)的基因编码的一种或多种蛋白或蛋白片段接触，从而引起对结直肠癌细胞的免疫反应。例如，受试者可通过静脉内或肌内接触蛋白或蛋白片段。
[0028]在还有其他实施方案中，本发明提供检测样品中的结直肠癌细胞的试剂盒。该试剂盒可包含检测下文所公开的任何癌相关序列的表达的一种或多种试剂。该试剂盒可包含为例如蛋白和/或核酸的试剂。在一个实施方案中，试剂盒提供多种试剂。这些试剂可能能够检测由包括 SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA或其补体的基因编码的一组标记物。
[0029]在另外其他实施方案中，本发明提供检测样品中的结直肠癌的试剂盒，其包含特异性结合到由基因 SPINK4、LlTDU LY6G6D、APOBECK L0C729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA编码的分子的多种试剂。
[0030]在其他实施方案中，本发明提供检测得自受试者的样品中的结直肠癌的试剂盒。该试剂盒可包含特异性结合到由结直肠癌细胞特异性表达的分子的一种或多种试剂。该试剂盒可包含一个或多个容器和确定样品是否为癌症阳性的使用说明。该试剂盒可任选地包含一个或多个多孔板、可检测的物质，诸如染料、放射性标记分子、化学发光标记分子等。该试剂盒还可以包含阳性对照(例如，一种或多种癌细胞；或具体已知量的由结直肠癌细胞表达的分子)和阴性对照(例如，非癌性组织或细胞样品)。
[0031]在一些实施方案中，本发明提供检测结直肠癌的试剂盒，其包含特异性结合由选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的基因编码的一种或多种标记物的一种或多种试剂。该试剂可以为蛋白，诸如抗体。作为另外一种选择，该试剂可以为核酸，诸如DNA分子或RNA分子。该试剂盒可包含一个或多个容器和确定样品是否为癌症阳性的使用说明。该试剂盒可任选地包含一个或多个多孔板、可检测的物质，诸如染料、放射性标记分子、化学发光标记分子等。该试剂盒还可以包含阳性对照(例如，一种或多种癌细胞；或具体已知量的由结直肠癌细胞表达的分子)和阴性对照(例如，非癌性组织或细胞样品)。例如，试剂盒可以呈ELISA或DNA微阵列的形式。
[0032]一些实施方案涉及治疗受试者中的结直肠癌的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用调节结直肠癌相关蛋白的活性的治疗剂，其中癌相关蛋白由表I所列的基因、其同源物、其组合或其片段编码。在一些实施方案中，治疗剂结合到癌相关蛋白。在一些实施方案中，治疗剂为抗体。在一些实施方案中，抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化或人类抗体。
[0033]本文的一些实施方案涉及治疗受试者中的结直肠癌的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用调节结直肠癌相关蛋白的活性的治疗剂，其中结直肠癌相关蛋白由选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)和/或其同源物和/或其组合和/或其片段的基因编码。在一些实施方案中，治疗剂结合到癌相关蛋白。在一些实施方案中，治疗剂为抗体。在一些实施方案中，抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化或人类抗体。
[0034]在一些实施方案中，治疗受试者中的结直肠癌的方法可包括向对其有需要的受试者施用调节选自表I所列的那些、其片段、其同源物和/或其补体的一种或多种基因的表达的治疗剂。
[0035]在一些实施方案中，治疗受试者中的结直肠癌的方法可包括向对其有需要的受试者施用调节选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)、其片段、其同源物和/或其补体的一种或多种基因的表达的治疗剂。
[0036]在另外的实施方案中，本发明提供治疗结直肠癌的方法，可包括表I中所列的一种或多种基因、其片段、其同源物和/或其补体的基因敲低。在一些实施方案中，治疗结直肠癌的方法可包括对细胞进行处理以敲低或抑制基因的表达，该基因编码选自表I所列的那些、其片段、其同源物和/或其补体的一种或多种基因的mRNA。[0037]在其他实施方案中，治疗结直肠癌的方法可包括选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的一种或多种基因的基因敲低。在一些实施方案中，治疗癌症的方法可包括对细胞进行处理以敲低或抑制基因的表达，该基因编码选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的一种或多种基因的mRNA。
[0038]在另外其他实施方案中，本发明提供筛选候选药物的抗结直肠癌活性的方法，该方法包括:(a)将表达选自表I所列的那些的一种或多种结直肠癌相关基因的细胞与候选药物接触；(b)检测候选药物对得自a)的细胞中所述一种或多种结直肠癌相关基因的表达的影响；以及(C)将不存在候选药物的情况下在a)中所列的基因中的一种或多种的表达水平与存在候选药物的情况下所述一种或多种基因的表达水平进行比较；其中在存在候选药物的情况下结直肠癌相关基因表达的降低表明候选药物具有抗结直肠癌活性。
[0039]在另外的实施方案中，本发明提供筛选候选药物的抗结直肠癌活性的方法，该方法包括:(a)将表达选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的一种或多种结直肠癌相关基因的细胞与候选药物接触；(b)检测候选药物对得自a)的细胞中所述一种或多种结直肠癌相关基因的表达的影响；以及(C)将不存在候选药物的情况下在a)中所列的基因中的一种或多种的表达水平与存在候选药物的情况下的表达水平进行比较；其中在存在候选药物的情况下结直肠癌相关基因表达的降低表明候选药物具有抗结直肠癌活性。
[0040]在一些实施方案中，本发明提供结直肠癌肿瘤的可视化方法，其包括:a)将一种或多种结直肠癌相关蛋白用特异性结合到癌肿瘤的标记分子靶向，其中结直肠癌相关蛋白选自由选自表I所列的那些的一种或多种基因编码的蛋白；以及b)检测标记分子，其中标记分子使肿瘤可视化。可视化可在体内或体外进行。
[0041]在另外其他实施方案中，本发明提供结直肠癌肿瘤的可视化方法，其包括:a)将一种或多种结直肠癌相关蛋白用特异性结合到结直肠癌肿瘤的标记分子靶向，其中结直肠癌相关蛋白选自由选自下文所公开的基因(例如在标题“癌相关序列”下所公开的基因)的一种或多种基因编码的蛋白；以及b)检测标记分子，其中标记分子使肿瘤可视化。可视化可在体内或体外进行。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]为了进一步理解本发明的实质和优点，应结合附图参考以下详细说明，其中:
[0043]图1显示了正常组织与恶性结直肠肿瘤中SPINK4的表达。
[0044]图2显示了结直肠肿瘤、正常组织和其他恶性肿瘤类型中LlTDl的表达。
[0045]图3显示了正常组织与结直肠肿瘤中LY6G6D的表达。
[0046]图4显示了结直肠肿瘤和其他恶性肿瘤与正常组织中AP0BEC1的表达。
[0047]图5显示了正常组织与结直肠肿瘤中L0C729669的表达。
[0048]图6显示了结直肠肿瘤和其他恶性肿瘤与正常组织中NOTUM的表达。
[0049]图7显示了正常组织与结直肠肿瘤中GRP的表达。
[0050]图8显示了正常组织与结直肠肿瘤中KRT20的表达。
[0051]图9显示了正常组织与结直肠肿瘤中MUC17的表达。
[0052]图10显示了正常组织与结直肠肿瘤中NOTUM的表达。[0053]图11显示了正常组织与结直肠肿瘤和其他癌症中C0L11A1的表达。
[0054]图12显示了正常组织与结直肠肿瘤中MMPll的表达。
[0055]图13显示了正常组织与结直肠肿瘤中MMP12的表达。
[0056]图14显示了正常组织与结直肠肿瘤中MMP7的表达。
[0057]图15显示了正常组织与结直肠肿瘤中DKK4的表达。
[0058]图16显示了通过qRT-PCR测量的正常和结肠癌组织中的LY6G6D mRNA表达。LY6G6D表达水平通过定量PCR(qPCR)测量、针对ACTB表达水平进行标准化并表示为 2~(_ACt)值。输入 cDNA 样品作为 TissueScan? cDNA 阵列(Colon Cancer DiseasePanel II，Origene)而获得。LY6G6D:引物:UPL479_LY6G6D_F 和 UPL480_LY6G6D_R，探针:UPL20 号探针。ACTB:与SYBR? Green I (Applied Biosystems/Life Technologies)结合的 TissueScan 引物(Origene)。
[0059]图17显示了通过qRT-PCR测量的正常和结肠癌组织中的SPINMmRNA表达。SPINK4表达水平通过定量PCR (qPCR)测量、针对ACTB表达水平进行标准化并表示为2~ (_ Δ Ct)值。输入 cDNA 样品作为 TissueScan? cDNA 阵列(Colon Cancer Disease PanelII，Origene)而获得。SPINK4:引物:UPL475_SPINK4_F 和 UPL476_SPINK4_R，探针:UPL18号探针。ACTB:与 SYBR? Green I (Applied Biosystems/Life Technologies)结合的TissueScan 引物(Origene)。
[0060]图18显示了通过qRT-PCR测量的正常和结肠癌组织中的LITDlmRNA。LlTDl表达水平通过定量PCR(qPCR)测量、针对ACTB表达水平进行标准化并表示为2~ (-ACt)值。输入 cDNA 样品作为 TissueScan? cDNA 阵列(Colon Cancer Disease Panel II, Origene)而获得。LlTDl:引物:UPL485-L1TD1-F 和 UPL486-L1TD1-R,探针:UPL42 号探针。ACTB:与 SYBR? Green I (Applied Biosystems/Life Technologies)结合的 TissueScan 引物(Origene)。
[0061]图19显示了通过qRT-PCR测量的正常和结肠癌组织中的DKMmRNA表达。将一个正常组织(NI)和五个结肠癌组织(C1-C5)的DKK4表达水平针对⑶SB表达水平进行标准化，并表示为 2~(-ACt)值。DKK4:引物:UPL495_DKK4-F3 和 UPL496_DKK4-R3，探针:UPL19号探针。⑶SB:引物:UPL081_GUSB-F 和 UPL082_GUSB_R，探针:UPL57 号探针。
[0062]图20显示了通过qRT-PCR测量的正常和结肠癌组织中的NOTUM mRNA表达。将一个正常组织(NI)和三个结肠癌组织(C1-C3)的NOTUM表达水平针对⑶SB表达水平进行标准化，并表示为 2~ (- Δ Ct)值。NOTUM:引物:UPL489_N0TUM-F 和 UPL490_N0TUM-R，探针:UPL34 号探针。⑶SB:引物:UPL081_GUSB-F 和 UPL082_GUSB_R，探针:UPL57 号探针。
[0063]图21显示了正常组织与结直肠肿瘤和其他肿瘤中C0L10A的表达。
[0064]图22显示了正常组织与结直肠肿瘤中SLC3OT3的表达。
[0065]图23显示了正常组织与结直肠肿瘤中C0LX(由C0L10A编码的蛋白)的表达。
[0066]图24显示了正常组织与结直肠肿瘤中MMPll的表达。
[0067]详述
[0068]在描述本发明的组合物和方法前，应当理解，本发明不限于所述的特定过程、组合物或方法学，因为它们可以变化。还应当理解，在说明书中所用的术语仅是为了描述特定的形式或实施方案，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将只由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料均可用于实践或检验本公开的实施方案，但是现在描述优选的方法、装置和材料。本文中的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些揭示。
[0069]如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”也包括复数指代。因此，例如，提及“治疗剂”涉及一种或多种治疗剂以及本领域技术人员已知的其等同形式等等。
[0070]如本文所用，术语“约”意指与其一起使用的数值的加或减10%。因此，约50%意指在45%至55%的范围内。
[0071]“施用”在结合治疗剂使用时意指直接向靶组织中或上施用治疗剂或向患者施用治疗剂，该治疗剂从而对其靶向的组织产生积极影响。因此，如本文所用，术语“施用”在结合治疗剂使用时可包括但不限于:向靶组织中或上提供治疗剂；通过例如静脉注射向患者全身提供治疗剂，由此治疗剂达到靶组织；向靶组织提供其编码序列形式的治疗剂(例如通过所谓的基因疗法技术)。“施用”组合物可通过经口施用、静脉注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射、透皮扩散或电泳、局部注射、诸如可生物侵蚀的或基于贮存器的植入物的延释递送装置(包括局部植入的延释装置)、作为蛋白治疗剂或通过基因疗法载体作为核酸治疗剂、局部施用、或通过与其他已知技术结合的任何这些方法实现。此类组合技术包括但不限于加热、福射和超声。
[0072]如本文所用的“试剂”是指特异性结合到癌相关序列的分子或由癌相关序列编码的分子或结合到由癌相关序列编码的分子的受体。试剂的实例包括诸如DNA的核酸分子和诸如抗体的蛋白。试剂可与如下所述的标记或可检测物质连接。
[0073]如本文所用的术语“扩增”意指形成扩增产物，扩增产物可包括例如另外的靶标分子、靶标类分子或与靶标分子互补的分子，这些分子通过在样品中存在靶标分子而形成。在其中靶标为核酸的情形下，扩增产物可通过DNA或RNA聚合酶或逆转录酶或其任意组合通过酶法制备。
[0074]如本文所用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包括但不限于人、非人灵长类动物和非人脊椎动物，诸如野生、家养或农场动物，包括任何哺乳动物，诸如猫、狗、奶牛、绵羊、猪、马、兔，啮齿类动物，诸如小鼠和大鼠。在一些实施方案中，术语“受试者”、“患者”或“动物”是指雄性。在一些实施方案中，术语“受试者”、“患者”或“动物”是指雌性。
[0075]如本文所用的术语“生物来源”是指可得到靶多核苷酸或蛋白或肽片段的来源。来源可以具有如上所述的任何“样品”形式，包括但不限于细胞、组织或体液。“不同的生物来源”可指同一个体的不同细胞/组织/器官，或来自同一物种的不同个体的细胞/组织/器官，或来自不同物种的细胞/组织/器官。
[0076]术语“捕获试剂”是指能够结合要在样品中进行检测的靶标分子或分析物的试剂，例如抗体或抗原结合蛋白。
[0077]术语“基因表达结果”是指关于基因或基因产物的表达的定性和/或定量结果。基因表达结果可以是基因、基因编码的RNA、基因编码的mRNA、基因编码的蛋白产物或其任意组合的量或拷贝数。基因表达结果也可针对标准进行标准化或与标准进行比较。基因表达结果可用于例如确定基因在两个或更多个样品中是否表达、过表达或差异表达。[0078]如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可以存在部分同源性或完全同源性。词语“同一性”可代替词语“同源性”。至少部分地抑制相同的序列杂交到靶标核酸的部分互补的核酸序列称为“基本上同源的”。完全互补的核酸序列与靶标序列的杂交的抑制可使用杂交阵列(Southern或Northern印迹、液相杂交等)在低严格性条件下进行研究。基本上同源的序列或杂交探针在低严格性条件下将竞争并抑制完全同源的序列与靶标序列的结合。这并非是说，低严格性条件使得允许非特异性结合，因为低严格性条件要求两种序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。不存在非特异性结合可通过使用第二靶标序列加以测试，该序列甚至缺乏部分互补性程度(例如，低于约30%的同源性或同一性)。在不存在非特异性结合的情况下，基本上同源的序列或探针将不会杂交到第二非互补靶标序列。
[0079]如本文所用，术语“杂交”是指形成氢键，它可以是互补核苷或核苷酸碱基之间的Watson_Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺卩密唳是通过形成氢键而配对的互补核碱基。如本文关于核酸分子所用的“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果位于寡核苷酸某一位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子相同位置的核苷酸形成氢键，则可将该寡核苷酸和DNA或RNA视为在该位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此形成氢键的核苷酸占据时，寡核苷酸和DNA或RNA彼此互补。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用于表明足够程度的互补性或精确配对使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶标之间形成稳定而特异性的结合的术语。在本领域中应当理解，核酸序列不需要与其靶标核酸的序列100%互补就可特异性杂交。核酸化合物在以下情况下可特异性杂交:存在分子与靶标的结合并存在足够的互补性程度以避免分子与非靶标序列在需要特异性结合的条件下非特异性结合，即，就体内测定或治疗剂治疗而言在生理条件下，以及就体外测定而言在执行测定所处的条件下。
[0080]术语“抑制”包括施用本公开的化合物以防止症状的发生、缓解症状或消除疾病、病症或障碍。术语“抑制”还可以指降低基因的表达水平，诸如编码癌相关序列的基因。可以降低RNA和/或蛋白的表达水平。
[0081]术语“标记”和/或可检测物质是指能够产生表明在测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物。合适的标记包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁粒、生物发光部分等。因此，标记是能够由装置或方法检测的任意组合物，诸如但不限于光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学、化学检测装置或任何其他合适的装置。在一些实施方案中，标记可无需借助于装置而在视觉上检测。术语“标记”用于指代具有可检测的物理性质的任何化学基团或部分或能够导致化学基团或部分表现出可检测的物理性质的任何化合物，诸如催化底物转化成可检测产物的酶。术语“标记”还涵盖抑制特定物理性质的表现的化合物。标记也可以是作为结合对的成员的化合物，其另一个成员具有可检测的物理性质。
[0082]“微阵列”是例如在固相载体的表面上形成的离散区的线性或二维阵列，每个离散区具有限定的区域。离散区在微阵列上的密度由要在单一固相载体的表面上检测的靶多核苷酸的总数决定，优选至少约50个/cm2，更优选至少约100个/cm2，甚至更优选至少约500个/cm2，还优选至少约1，000个/cm2。如本文所用，DNA微阵列是用于鉴定、扩增、检测或克隆靶多核苷酸的置于芯片或其他表面上的寡核苷酸引物的阵列。由于阵列中每一特定组的引物的位置都是已知的，因此可基于目标多核苷酸与微阵列中特定位置的结合而确定它们的种类。
[0083]如本文所用，术语“天然存在的”是指可以为通常存在于自然界中的形式的序列或结构。“天然存在的”可包括以通常存在于任何动物中的形式的序列。
[0084]在本文使用“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”或其等同形式意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是6、8、10、12、20、30或多达100个核苷酸的低聚物。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少6、8、10、12、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或500个核苷酸的低聚物。“多核苷酸”或“寡核苷酸”可包括DNA、RNA、PNA或通过磷酸二酯键和/或任何替代键连接的核苷酸的聚合物。
[0085]如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指其中随后描述的结构、事件或环境可以存在或可以不存在并且该描述包括事件存在的情况和事件不存在的情况的实施方案。
[0086]短语“百分比同源性”、“ %同源性”、“百分比同一性”或“ ％同一性”是指存在于两种或更多种氨基酸或核酸序列的比较中的序列相似性百分比。百分比同一性可例如通过使用MEGALIGN程序(LASERGENE软件包，DNASTAR)以电子方式测定。MEGALIGN程序可根据不同的方法在两个或更多个序列之间形成比对，例如Clustal方法(Higgins，D.G.和P.M.Sharp (1988) Gene73:237-244)。Clustal算法通过检查所有对之间的距离而将序列分成聚类。对聚类进行成对比对然后分组。两个氨基酸序列(例如序列A与序列B)之间的百分比相似性的计算方式为:将序列A的长度减去序列A中的间隙残基数减去序列B中的间隙残基数除以序列A与序列B之间的残基匹配总和再乘以一百。在确定百分比相似性时，并不将两个氨基酸序列之间低同源性或无同源性的间隙包括在内。核酸序列之间的百分比同一'丨生也可通过Clustal方法或通过本领域已知的其他方法计算,诸如Jotun Hein方法(参见例如Hein, J.(1990)Methods Enzymol.183:626-645)。序列之间的同一性也可通过本领域已知的其他方法确定，例如通过改变杂交条件。
[0087]所谓“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其受体无害。
[0088]如本文所用的“重组蛋白”意指使用重组技术制备的蛋白，例如但不限于通过表达如上所述的重组核酸。重组蛋白可通过至少一种或多种特性而区别于天然存在的蛋白。例如，蛋白可以从与其在野生型宿主中通常相关的蛋白和化合物中的一些或全部分离或纯化，并因而可以为基本上纯的。例如，分离的蛋白不伴有在其自然状态中通常与之相关的材料中的至少一些，优选地在给定的样品中占总蛋白重量的至少约0.5%，更优选地至少约5%。基本上纯的蛋白占约50-75%、约80%或约90%。在一些实施方案中，基本上纯的蛋白占总蛋白重量的约80-99 %、85-99 %、90-99 %、95-99 %或97-99 %。重组蛋白还可以包括在不同的生物体(例如酵母、大肠杆菌等)或宿主细胞中从一种生物体(例如人类)产生癌相关蛋白。作为另外一种选择，蛋白可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以比通常所见的明显更高的浓度制备，使得蛋白以提高的浓度水平制备。作为另外一种选择，蛋白可以为不通常存在于自然界中的形式，如添加表位标签或发生氨基酸取代、插入和缺失，如本文所述。
[0089]如本文所用，术语“样品”是指进行测试或用试剂(诸如但不限于治疗剂、药物或候选试剂)处理的组合物。样品可得自受试者。在一些实施方案中，样品可以为血液、血浆、血清或其任意组合。样品可衍生自血液、血浆、血清或其任意组合。其他典型的样品包括但不限于得自哺乳动物受试者、组织活检、痰、淋巴液、血细胞(例如外周血单核细胞)、组织或细针活检样品、尿液、腹膜液、初乳、母乳、胎液、粪便、泪液、胸膜液的任何体液或其中的细胞。样品可在用于本文所述的方法(例如要将特定的组分根据下文所述的任何方法进行分析或测试)前以一定的方式加以处理。可将一种或多种分子从样品中分离。
[0090]术语“特异性结合”是指其中两种或更多种分子形成可在生理或测定条件下测量的复合物并为选择性的情况。将抗体或抗原结合蛋白或其他分子在以下情况下称为“特异性结合”到蛋白、抗原或表位:在适当选择的条件下，这种结合不受到实质性抑制，而同时非特异性结合受到抑制。特异性结合的特征在于高亲和力以及对化合物、蛋白、表位或抗原的选择性。非特异性结合通常具有较低的亲和力。
[0091]如本文所用，“衍生自”指定序列的多核苷酸是指由对应于指定核苷酸序列的一定区域的大致至少约6个核苷酸、优选至少约8个核苷酸、更优选至少约10-12个核苷酸、甚至更优选至少约15-20个核苷酸的序列构成的多核苷酸序列。“对应”意指与指定序列同源或互补。优选地，衍生出多核苷酸的区域的序列与癌相关基因特有的序列同源或互补。
[0092]如本文所用，术语“标签”、“序列标签”或“引物标签序列”是指具有用于鉴定一批在其中具有此类标签的多核苷酸的特定核酸序列的寡核苷酸。将得自相同生物来源的多核苷酸用特定的序列标签进行共价标记，使得在后续分析中该多核苷酸可根据其起源而加以鉴定。序列标签还充当核酸扩增反应的引物。
[0093]术语“载体”是指常规载体，诸如珠子、粒子、试纸条、纤维、过滤器、膜和硅烷或硅酸盐载体，诸如载玻片。
[0094]如本文所用，术语“治疗剂”意指可用于治疗、抗争、减轻、预防或改善患者的不想要的病症或疾病的药剂。在某种程度上，本公开的实施方案涉及治疗癌症或减少细胞增殖。在一些实施方案中，术语“治疗剂”可以指与靶标记、其表达或其功能相关或影响靶标记、其表达或其功能的任何分子。在多种实施方案中，此类治疗剂可包括与靶标记、其表达或其功能相关或影响靶标记、其表达或其功能的诸如治疗性细胞、治疗性肽、治疗性基因、治疗性化合物等分子。
[0095]组合物的“治疗有效量”或“有效量”是经计算实现所需的效果即抑制、阻断或逆转细胞的活化、迁移或增殖的预定量。在一些实施方案中，有效量是预防量。在一些实施方案中，有效量是用于医治疾病或病症的量。根据本发明施用以获得治疗性和/或预防性效果的组合物的具体剂量将当然由与病例相关的特定情况决定，例如施用的组合物、施用途径和所治疗的病症。应当理解，施用的有效量将由医生根据相关的情况决定，包括待治疗的病症、对将施用的组合物的选择以及所选的施用途径。本发明的组合物的治疗有效量通常为当以生理上可耐受的赋形剂组合物施用时足以实现所需的全身性浓度或靶组织中的局部浓度的量。
[0096]如本文所用的术语“治疗”可指治疗性处理或预防性措施，其中目标是预防或减慢(减轻)非期望的生理状况、障碍或疾病，或获得有益的或所需的临床结果。在一些实施方案中，该术语既可以指代治疗也可以指代预防。出于本公开的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于缓解症状；减轻病症、障碍或疾病的程度；稳定(即，不恶化)病症、障碍或疾病的状态；延迟病症、障碍或疾病的发生或减缓其进展；改善病症、障碍或疾病状态；以及缓解(无论是部分的还是完全的)(无论是可检测的还是不可检测的)或改进或改善病症、障碍或疾病。治疗可包括引起临床上明显的反应，而无过度的副作用。治疗还包括相比未接受治疗时的预期存活期延长的存活期。
[0097]术语“组织”是指在特定功能的表现中联合的相似特化细胞的任何聚集。
[0098]癌相关序列
[0099]在一些实施方案中，本公开提供与癌症相关的核酸和蛋白序列，在本文称为“癌相关”或“CA”序列。在一些实施方案中，本公开提供与诸如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其任意组合的结直肠癌相关的核酸和蛋白序列。在一些实施方案中，本公开提供与结直肠癌或诸如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其组合的癌相关的核酸和蛋白序列。在一些实施方案中，术语“癌相关序列”可指代与正常组织相比核苷酸或蛋白序列在癌症中差异表达、活化、失活或改变。癌相关序列可包括在癌症中上调(即，以较高的水平表达)以及下调(即，以较低的水平表达)的那些。癌相关序列还可以包括已发生改变(即，易位、截短的序列或具有取代、缺失或插入的序列，包括但不限于点突变)并显示出相同的表达谱或改变的表达谱的序列。在一些实施方案中，癌相关序列得自人类；然而，如本领域的技术人员将会认识到，得自其他生物体的癌相关序列也可用于疾病和药物评价模型；因此，其他癌相关序列可能是有用的，诸如但不限于得自以下的序列:脊椎动物，包括哺乳动物，包括啮齿类动物(大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠等)、灵长类动物和农场动物(包括绵羊、山羊、猪、奶牛、马等)。得自其他生物体的癌相关序列可使用本文所述的技术获得。
[0100]在一些实施方案中，癌相关序列既可以包括核酸序列也可以包括氨基酸序列。在一些实施方案中，癌相关序列可包括与所公开的序列具有至少约60%同源性的序列。在一些实施方案中，癌相关序列可与所公开的序列具有至少约65%、约70 %、约75%、约80 %、约85%、约90%、约95%、约97%、约99%、约99.8%的同源性。在一些实施方案中，癌相关序列可以是“突变体核酸”。如本文所用，“突变体核酸”是指缺失突变体、插入、点突变、取代、易位。
[0101]在一些实施方案中，癌相关序列可以是重组核酸。在本文中所谓术语“重组核酸”是指非通常存在于自然界中的形式的一般通过用聚合酶和内切酶操纵核酸而最初在体外形成的核酸分子。因此，重组核酸也可以为线性形式的分离核酸，或在通过连接通常未接合的DNA分子而在体外形成的载体中进行克隆，出于本发明的目的，两者都被视为重组的。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体后，它就可以在体内使用宿主细胞的细胞机器复制，而不是在体外操纵；然而，此类核酸一旦通过重组方式产生后，虽然随后在体内进行复制，但出于本发明的目的仍被视为重组的或分离的。如本文所用，“多核苷酸”或“核酸”是任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。该术语包括双链和单链DNA和RNA。它还包括已知类型的修饰，例如本领域已知的标记；甲基化；“帽”;用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如具有不带电键合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含侧基部分的那些，诸如蛋白(包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚赖氨酸等)；具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些；含螯合剂(例如金属、放射性金属等)的那些；含烷化剂的那些；含修饰键合(例如α异头核酸等)的那些；以及多核苷酸的未修饰形式。
[0102]在一些实施方案中，癌相关序列为核酸。如本领域的技术人员将会认识到并且在本文所述，本文中的实施方案的癌相关序列可用于多种应用，包括检测受试者中的核酸或其表达水平的诊断性应用、治疗性应用或其组合。另外，本文中的实施方案的癌相关序列可用于筛选应用；例如，生成包含癌相关序列的核酸探针的生物芯片。
[0103]本公开的核酸可包含磷酸二酯键，然而在一些情况下，如下文所述(例如，在反义应用中或当核酸为候选试剂时)，核酸类似物可具有包含例如磷酰胺酯(Beaucage等人，Tetrahedron49 (10): 1925 (1993)及其中的参考文献；Letsinger, J.0rg.Chem.35:3800 (1970) ;Sprinzl 等人,Eur.J.Biochem.81:579(1977) ;Letsinger 等人,Nucl.AcidsRes.14:3487 (1986) ；Sawai 等人，Chem.Lett.805 (1984) ；Letsinger 等人，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)和 Pauwels 等人，Chemica Scripta26: 14191986)、硫代憐酸酯(Mag 等人，Nucleic Acids Res.19:1437 (1991)和美国专利 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 等人,J.Am.Chem.Soc.1ll:2321 (1989)、O-甲基亚磷酰胺酯键合(参见 Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach, Oxford University Press)的交替主链，以及肽核酸主链和键合(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier 等人，Chem.1nt.Ed.Engl.31: 1008 (1992) ；Nielsen, Nature, 365:566(1993)；Carlsson等人，Nature380:207(1996))。其他类似核酸包括具有带正电荷主链(Denpcy等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:6097 (1995))、非离子型主链(美国专利 5,386,023、5，637，684,5, 602，240,5, 216，141 和 4，469，863 ；Kiedrowshi 等人，Angew.Chem.1ntl.Ed.English30:423 (1991) ；Letsinger 等人，J.Am.Chem.Soc.110:4470 (1988) ；Letsinger等人，Nucleoside&Nucleotidel3: 1597 (1994);第 2 和 3 章，ASC Symposium Series580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research，，，编者 Y.S.Sanghui 和 P.DanCook ；Mesmaeker 等人，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395 (1994) ；Jeffs 等人，J.Biomolecular NMR34:17(1994) !Tetrahedron Lett.37:743 (1996))和非核糖主链(包括在美国专利 5，235，033 和 5，034，506 以及第 6 和 7 章，ASC Symposium Series580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research，，，编者 Y.S.Sanghui 和 P.DanCook中所述的那些)的那些。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一种定义内(参见 Jenkins 等人，Chem.Soc.Rev.(1995)pp.169-176)。多种核酸在 Rawls, C&ENewsJun.2，1997第35页中进行了描述。对磷酸核糖主链的这些修饰可因多种原因而进行，例如增加此类分子在生理环境下的稳定性和半衰期以用于反义应用或作为生物芯片上的探针。
[0104]如本领域的技术人员将会认识到，此类核酸类似物可用于本公开的一些实施方案。此外，可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；作为另外一种选择，可制备不同核酸类似物的混合物以及天然存在的核酸和类似物的混合物。
[0105] 在一些实施方案中，核酸可以为单链的或双链的，或可以包含双链或单链序列的部分。如本领域的技术人员将会认识到，对单链的描绘也限定了另一条链的序列；因此，本文所述的序列还包含序列的补体。核酸可以为DNA、基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等)的任意组合。如本文所用，术语“核苷”包括核苷酸和核苷及核苷酸类似物，以及修饰的核苷，诸如氨基修饰的核苷。此外，“核苷”包括非天然存在的类似物结构。因此，例如，肽核酸的主题单元(每一个包含碱基)在本文称为核苷。
[0106]本文中的一些实施方案涉及与结直肠癌诸如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其任意组合相关的一种或多种序列。使用基因表达的微阵列分析允许鉴定与结直肠癌相关的宿主序列。然后可将这些序列以多种不同的方式使用，包括诊断、预后、筛选调节剂(包括激动剂和拮抗剂两者)、生成抗体(用于免疫疗法和成像)等。然而，如本领域的技术人员将会认识到，在一种类型的癌症中鉴定的序列可具有也涉及在其他类型的癌症中的高可能性。因此，虽然本文所述的序列最初鉴定为与结直肠癌相关，但是它们也可存在于其他类型的癌症中。
[0107]本文所述的一些实施方案可涉及将癌相关序列用于结直肠癌的诊断和治疗。在一些实施方案中，癌相关序列可选自:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶 11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43(RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型α I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素α 5 (DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (Ν0Χ01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素α 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其组合。在一些实施方案中，这些癌相关序列可与包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其任意组合的结直肠癌相关。
[0108]在一些实施方案中，癌相关序列可以为编码上述mRNA或由上述mRNA或其同源物表达的癌相关蛋白或癌相关多肽的DNA序列。在一些实施方案中，癌相关序列可以为上文所公开的序列的突变体核酸。在一些实施方案中，同源物可具有与所公开的多肽序列至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%的同一性。
[0109]在一些实施方案中，分离的核酸包含选自表I中所公开的癌相关多核苷酸序列的序列的至少10、12、15、20或30个连续核苷酸。
[0110]在一些实施方案中，多核苷酸或其补体或其片段还包含可检测的标记、附接到固相载体、至少部分地通过化学合成而制备、为反义片段、为单链的、为双链的或构成微阵列。[0111]在一些实施方案中，本发明提供在选自表I所示的多核苷酸序列或其补体的癌相关序列的开放阅读框内编码的分离多肽。在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其中所述多肽包含通过选自表I中所公开的序列的多核苷酸编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其中所述多肽包含由癌相关多肽编码的氨基酸序列。
[0112]在一些实施方案中，本发明还提供包含癌相关多肽的氨基酸序列的表位的氨基酸序列的分离多肽，其中该多肽或其片段可附接到固相载体。在一些实施方案中，本发明提供结合到这种多肽的分离抗体(单克隆或多克隆的)或其抗原结合片段。分离的抗体或其抗原结合片段可附接到固相载体，或进一步包含可检测的标记。
[0113]一些实施方案还提供与多种癌症相关的抗原(例如，癌相关多肽)作为诊断性和/或治疗性抗体的靶标。这些抗原也可用于药物发现(例如，小分子)和对细胞调控、生长及分化的进一步表征。
[0114]检测和诊断结直肠癌的方法
[0115]在一些实施方案中，检测或诊断结直肠癌的方法可包括测定对其有需要的受试者的基因表达。在一些实施方案中，检测癌相关序列的水平可包括诸如但不限于PCR、质谱、微阵列或本文所述的其他技术的技术。与受体表达相关的信息也可用于确定目的在于使用激动剂或拮抗剂上调或下调癌相关序列信号转导的疗法。
[0116]在一些实施方案中，诊断结直肠癌的方法可包括检测受试者中癌相关蛋白的水平。在一些实施方案中，筛查癌症的方法可包括检测癌相关蛋白的水平。在一些实施方案中，癌相关蛋白由选自表I中所公开的核苷酸序列、其部分或其互补序列的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，治疗癌症的方法可包括向对其有需要的受试者施用蛋白的抗体。在一些实施方案中，该抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体可以是人源化抗体或重组抗体。可使用已知的方法制备特异性结合到此区域的抗体，并且任何方法均是合适的。在一些实施方案中，该抗体特异性结合到由下文所公开的一种或多种癌相关序列编码的一种或多种分子，诸如蛋白或肽。
[0117]在一些实施方案中，该抗体结合到得自由表I所公开的序列中所公开的核苷酸序列编码的蛋白的表位。在一些实施方案中，该表位是由下文所公开的任何癌相关序列的核苷酸序列编码的蛋白序列的片段。在一些实施方案中，该表位包含癌相关序列的约1-10、1-20、1-30、3-10或3-15个残基。在一些实施方案中，该表位不是线性的。
[0118]在一些实施方案中，该抗体结合到本文所述的区域或与该区域具有至少90%、95%或99%同源性或同一性的肽。在一些实施方案中，本文所述的区域的片段的长度为5-10个残基。在一些实施方案中，本文所述的区域的片段(例如表位)的长度为3-5个残基。这些片段基于所提供的长度进行描述。在一些实施方案中，表位的长度为约3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 20 个残基。
[0119]在一些实施方案中，抗体结合的序列可包括核酸和氨基酸序列两者。在一些实施方案中，抗体结合的序列可包括与所公开的序列具有至少约60%同源性的序列。在一些实施方案中，抗体结合的序列可与所公开的序列具有至少约65%、约70%、约75%、约80%、约85 %、约90 %、约95 %、约97 %、约99 %、约99.8 %的同源性。在一些实施方案中，序列可称为“突变体核酸”或“突变体肽序列”。
[0120]在一些实施方案中，受试者可通过检测存在选自表I中所公开的序列的癌相关序列而诊断为患有结直肠癌。在一些实施方案中，诊断受试者患有结直肠癌的方法包括检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在性，其中存在癌相关序列表明受试者患有结直肠癌。在一些实施方案中，该方法包括检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在与否，其中不存在癌相关序列表明不存在结直肠癌。在一些实施方案中，该方法还包括用下述抗体治疗诊断患有结直肠癌的受试者，该抗体结合到选自表I中所公开的序列的癌相关序列并抑制结直肠癌的生长或进展。如本文所述，可检测任何类型的样品中的结直肠癌，包括但不限于血清、血液、肿瘤等。样品如本文所述可以是任何类型的样品。
[0121]在一些实施方案中，诊断受试者患有结直肠癌的方法包括获得样品并检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在性，其中存在癌相关序列表明受试者患有结直肠癌。在一些实施方案中，检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在性包括将样品与特异性结合到癌相关序列的蛋白的抗体或其他类型的捕获试剂接触，然后检测样品中是否存在与癌相关序列的蛋白的结合。可以使用的测定法的实例包括但不限于ELISA。
[0122]在一些实施方案中，本公开提供诊断受试者中的结直肠癌、癌症或赘生性病况的方法，该方法包括从衍生自受试者的样品中获得选自表I中所公开的序列的癌相关序列的癌相关序列基因表达结果；以及基于癌相关序列基因表达结果诊断受:试者中的结直肠癌或赘生性病况，其中如果癌相关序列过表达则将受试者诊断为患有结直肠癌或赘生性病况。
[0123]在一些实施方案中，如果癌相关序列不过表达则将受试者诊断为不患有结直肠癌、癌症或赘生性病况。在本文所述的和全文中的方法的一些实施方案中，基于癌相关序列基因表达结果或癌相关序列或蛋白的存在与否而诊断的癌症是选自腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其任意组合的癌症。
[0124]在一些实施方案中，本公开提供诊断受试者中的癌症或赘生性病况的方法，该方法包括获得选自下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的癌相关序列的基因表达结果，以及基于基因表达结果诊断受试者中的癌症或赘生性病况，其中如果基因过表达则将受试者诊断为患有癌症或赘生性病况。
[0125]在一些实施方案中，诊断受试者患有癌症的方法包括获得样品并检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在性，其中存在癌相关序列表明受试者患有癌症。在一些实施方案中，检测选自表I中所公开的序列的癌相关序列的存在性包括将样品与特异性结合到癌相关序列的蛋白的抗体或其他类型的捕获试剂接触，然后检测样品中是否存在与癌相关序列的蛋白的结合。在一些实施方案中，癌症为结直肠癌。在一些实施方案中，癌症选自腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其组合。
[0126]一些实施方案涉及包含编码癌相关蛋白的核酸区段的生物芯片。在一些实施方案中，生物芯片包含编码癌相关蛋白的至少一部分的核酸分子。在一些实施方案中，癌相关蛋白由选自表I中所公开的序列、其同源物、其组合或其片段的序列编码。在一些实施方案中，核酸分子与选自表I中所公开的序列的核酸序列特异性杂交。在一些实施方案中，生物芯片包含第一和第二核酸分子，其中第一核酸分子与选自表I中所公开的序列的第一序列特异性杂交并且第二核酸分子与选自表I中所公开的序列的第二序列特异性杂交，其中第一和第二序列不是同一序列。在一些实施方案中，本发明提供检测或诊断诸如结直肠癌的癌症的方法，其包括检测选自表I中所公开的序列的核酸序列的表达，其中将样品与包含选自表I中所公开的序列、其同源物、其组合或其片段的序列的生物芯片接触。
[0127]本文还提供例如通过以下方式诊断或确定患癌症倾向的方法:测量样品中下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的表达水平以及将样品中的所述一种或多种癌相关序列的表达水平与非癌性细胞中相同癌相关序列的表达水平进行比较。与非癌性细胞相比下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的表达水平更高表明存在发生癌症的倾向，例如结直肠癌。
[0128]在一些实施方案中，本发明提供通过供试样品中多肽的表达而检测癌相关序列的方法，其包括检测至少一种多肽诸如但不限于癌相关蛋白或其片段的表达水平。在一些实施方案中，该方法包括将供试样品中多肽的表达水平与正常样品中多肽的表达水平进行比较，其中相对于正常样品中的多肽表达水平而言供试样品中多肽的表达水平发生改变表明供试样品中存在癌症。在一些实施方案中，将多肽表达与癌症样品进行比较，其中表达水平至少与癌症相同表明供试样品中存在癌症。在一些实施方案中，样品为细胞样品。
[0129]在一些实施方案中，本发明提供通过检测供试血清样品中抗体的存在性而检测癌症的方法。在一些实施方案中，抗体识别本文所公开的多肽或其表位。在一些实施方案中，抗体识别由本文所公开的核酸序列编码的多肽或其表位。在一些实施方案中，该方法包括检测针对抗原性多肽(诸如但不限于癌相关蛋白)或其抗原性片段的抗体的水平。在一些实施方案中，该方法包括将供试样品中的抗体水平与对照样品中的抗体水平进行比较，其中相对于对照样品中的抗体水平而言所述供试样品中的抗体水平发生改变表明在供试样品中存在癌症。在一些实施方案中，对照样品是衍生自正常细胞的样品或非癌性样品。在一些实施方案中，对照衍生自癌症样品，并因此而言，在一些实施方案中，该方法包括比较样品中的抗体的结合水平和/或量，其中该水平或量与癌症对照样品相同表明在供试样品中存在癌症。
[0130]在一些实施方案中，诊断癌症或赘生性病况的方法包括:a)在第一个体的第一样品类型(例如组织)中测定包含选自表I中所述的人类基因组和mRNA序列的核酸序列的一种或多种基因的表达；以及b)比较得自所述第一个体或第二未受影响个体的第二正常样品类型的所述基因的所述表达；其中所述表达的差异表明第一个体患有癌症。在一些实施方案中，该表达与正常样品相比升高。在一些实施方案中，该表达与正常样品相比降低。
[0131]在一些实施方案中，本发明还提供检测受试者中的癌细胞的存在与否的方法。在一些实施方案中，该方法包括将得自受试者的一个或多个细胞与本文所述的抗体接触。在一些实施方案中，该方法包括检测癌相关蛋白和抗体的复合物，其中检测到复合物表明受试者中存在癌细胞。在一些实施方案中，本发明提供抑制受试者中的癌细胞生长的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供向受试者中的癌细胞递送治疗剂的方法，该方法包括:向受试者施用有效量的根据本发明的药物组合物。
[0132]在一些实施方案中，本公开提供诊断受试者中的癌症或赘生性病况的方法，该方法包括:a)测定一种或多种基因或基因产物或其同源物的表达；以及b)比较得自所述第一受试者或第二未受影响受试者的第二正常样品的所述一种或多种核酸序列的所述表达，其中所述表达的差异表明第一受试者患有癌症，其中将基因或基因产物称为选自下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的基因。
[0133]在一些实施方案中，本公开提供检测供试样品中的癌症的方法，其包括:(i)检测作为基因产物的至少一种多肽的活性水平；以及(ii)将供试样品中多肽的活性水平与正常样品中多肽的活性水平进行比较，其中相对于正常样品中的多肽活性水平而言供试样品中多肽的活性水平发生改变表明供试样品中存在癌症，其中所述基因产物是选自下文提供的癌相关序列中的一种或多种的基因的产物。
[0134]捕获试剂和特异性结合伴侣
[0135]例如IgG抗体中的结合的特征通常在于至少约10_7M或更高，诸如至少约10_8M或更高，或至少约10_9M或更高，或至少约10_1CI或更高，或至少约10_nM或更高，或至少约10_12M或更高的亲和力。该条件也可适用于以下情况:例如，抗原结合域为不被许多抗原携带的特定表位特异性的时，在该情况下，携带抗原结合域的抗体或抗原结合蛋白通常将不结合其他抗原。在一些实施方案中，捕获试剂对于其结合伴侣(例如抗原)具有等于或小于10_9m、ΙΟ,Μ或10_nM的Kd。在一些实施方案中，捕获试剂对于其结合伴侣具有大于或等于IO9M4的Ka。捕获试剂也可以指例如抗体。也称为免疫球蛋白的完整抗体通常为由两条各自为约25kDa的轻(L)链和两条各自为约50kDa的重(H)链构成的四聚糖基化蛋白。称为λ和K的两种类型的轻链存在于抗体中。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，将免疫球蛋白分成五大类:A、D、E、G和Μ，其中一些可进一步划分成亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。各轻链由一个N端可变(V)结构域(VL)和一个恒定(C)结构域(CL)构成。各重链由一个N端可变结构域(VH)、三个或四个C端结构域(CHs)和一个铰链区构成。将最靠近VH的CH结构域指定为CHl。VH和VL结构域由四个称为骨架区的相对保守的序列的区域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，它们形成三个高变序列区(互补决定区，⑶R)的支架。CDR包含负责抗体或抗原结合蛋白与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR称为⑶R1、⑶R2和⑶R3。因此，将重链上的⑶R组成部分称为H1、H2和H3，而将轻链上的CDR组成部分称为L1、L2和L3。CDR3是抗体或抗原结合蛋白结合位点内最大的分子多样性来源。H3例如可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。免疫球蛋白不同类的亚单元结构和三维构型是本领域中熟知的。有关抗体结构的综述,参见Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,编者 Harlow 等人，1988。本领域的技术人员将认识到各亚单元结构(例如CH、VH、CL、VL、⑶R和/或FR结构)包含活性片段。例如，活性片段可由VH、VL或CDR亚单元结合抗原的部分(即抗原结合片段)或CH亚单元结合和/或活化Fe受体和/或补体的部分组成。
[0136]由本文所用的术语“抗原特异性抗体”涵盖的结合片段的非限制性实例包括:(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii) F (ab' ) 2片段，其为包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V) dAb片段，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的CDR。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可通过合成接头使用重组方法而接合，从而形成单条蛋白链，其中VL和VH结构域配对形成单价分子(称为单链Fv (scFv))。最常用的接头为15个残基的(Gly4Ser) 3肽，但是其他接头也是本领域已知的。单链抗体也旨在由术语”抗体或抗原结合蛋白”或抗体的“抗原结合片段”涵盖。抗体也可以为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗原结合片段、Fe片段、单链抗体或其任何衍生物。
[0137]抗体可用本领域技术人员已知的常规技术获得，且可采用与完整抗体一样的方式筛选片段的实用性。抗体多样性通过编码可变结构域的多个生殖系基因和多种体细胞事件形成。体细胞事件包括具有多样性(D)的可变基因区段与连接(J)基因区段的重组以形成完整的VH结构域，以及可变和连接基因区段的重组以形成完整的VL结构域。重组过程本身是不精确的，从而导致在V(D)J连接处氨基酸的丧失或添加。这些多样性机制在抗原暴露前在发育中的B细胞中存在。在抗原刺激后，在B细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。基于生殖系基因区段的估计数量、这些区段的随机重组以及随机VH-VL配对，可以产生多达 1.6X IO7 种不同的抗体(Fundamental Immunology,第 3 版(1993),编者 Paul, RavenPress, New York，N.Y.)。当考虑到有助于抗体多样性的其他过程(诸如体细胞突变)时，据认为可以产生超过I X 101°种不同的抗体(Immunoglobulin Genes,第2版(1995),编者Jonio等人,Academic Press, San Diego, Calif.)。由于涉及产生抗体多样性的许多过程，具有相同抗原特异性的独立来源的单克隆抗体将具有相同的氨基酸序列是不可能的。
[0138]能够与抗原、表位或本文描述的其他分子发生特异性相互作用的抗体或抗原结合蛋白分子可以通过本领域技术人员熟知的方法产生。例如，单克隆抗体可以根据已知的方法通过生成杂交瘤而产生。以此方式形成的杂交瘤可随后利用标准方法加以筛选，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和Biacore分析，以鉴定产生与所关注的分子或化合物发生特异性相互作用的抗体的一个或多个杂交瘤。作为制备单克隆抗体分泌性杂交瘤的替代形式，本公开的多肽的单克隆抗体可以通过用本公开的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)而鉴定和分离，从而分离结合到该多肽的免疫球蛋白文库成员。用于生成和筛选噬菌体展示文库的技术和市售试剂盒对于本领域的技术人员而言是熟知的。此外，特别适用于生成和筛选抗体或抗原结合蛋白展示文库的方法和试剂的实例可以在文献中找到。
[0139]嵌合抗体的实例包括但不限于人源化抗体。本文所述的抗体也可以是人类抗体。在一些实施方案中，捕获试剂包括检测试剂。检测试剂可以是可用于检测捕获试剂与其特异性结合伴侣的结合的存在性的任何试剂。捕获试剂可直接包括检测试剂，或者捕获试剂可包括含有检测试剂的粒子。在一些实施方案中，捕获试剂和/或粒子包括颜色、胶体金、放射性标签、荧光标签或化学发光底物。粒子可以为例如病毒粒子、乳胶粒子、脂质粒子或荧光粒子。
[0140]本公开的捕获试剂(例如抗体)还可以包括抗抗体，即，识别另一种抗体但非抗原特异性的抗体，诸如但不限于抗IgG、抗IgM或抗IgE抗体。这种非特异性抗体可用作检测样品中是否存在抗原特异性抗体的阳性对照。
[0141]结直肠癌的治疗
[0142]在一些实施方案中，表达癌相关序列之一的结直肠癌可通过拮抗癌相关序列的活性而治疗。在一些实施方案中，治疗结直肠癌的方法可包括施用治疗剂，诸如但不限于拮抗结合到癌相关序列的配体的抗体，抑制癌相关序列的表达或活性的小分子，针对癌相关序列的siRNA等。在一些实施方案中，可将诸如ELISA的技术以及本文所述的其他检测技术用于筛查结直肠癌。
[0143]在一些实施方案中，治疗癌症(例如结直肠癌或其他类型的癌症)的方法包括检测癌相关序列的受体的存在性并施用癌症治疗措施。癌症治疗措施可以是任何癌症治疗措施或抑制癌相关序列的作用特异性的治疗措施。例如，可在给予癌症治疗措施前对各种癌症进行检测以确定是否存在特定的分子。因此，在一些实施方案中，样品将得自患者并如本文所述检测癌相关序列的存在性或癌相关序列的过表达。在一些实施方案中，如果发现癌相关序列过表达，则将结直肠癌治疗措施或治疗剂施用给受试者。结直肠癌治疗措施可以是常规的非特异性治疗措施，诸如化疗，或者治疗措施可包括仅靶向癌相关序列的活性或癌相关序列结合的受体的特异性治疗措施。这些治疗措施可以为例如特异性结合癌相关序列并抑制其活性的抗体。
[0144]本文的一些实施方案描述治疗癌症或赘生性病况的方法,其包括向受试者施用针对癌相关序列的抗体。在一些实施方案中，抗体可以是单克隆或多克隆的。在一些实施方案中，抗体可以是人源化的或重组的。在一些实施方案中，抗体可通过结合和/或干扰癌相关序列的受体而中和癌相关序列的生物活性。在一些实施方案中，施用抗体可以面向生物流体或组织，诸如但不限于血液、尿液、血清、肿瘤组织等。本文的一些实施方案可涉及筛查癌症的方法，其包括检测生物样品中癌相关序列的存在性。在一些实施方案中，样品可以是得自受试者的任何生物流体或组织，诸如但不限于血液、尿液、血清、肿瘤组织等。
[0145]在一些实施方案中，本公开提供治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用抑制选自下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的癌相关序列的活性的剂。在一些实施方案中，该剂包括特异性结合到下文所公开的一种或多种癌相关序列的抗体。
[0146]在一些实施方案中，治疗癌症的方法可包括施用干扰癌相关蛋白或其受体的合成、分泌、受体结合或受体信号转导的药剂。在一些实施方案中，癌症可选自腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其组合。
[0147]在一些实施方案中，可基于差异表达的基因或基因产物将癌细胞用治疗剂特异性靶向。例如，在一些实施方案中，差异表达的基因产物可以是酶，其可以将抗癌前药转化成其活性形式。因此，在正常细胞中，其中差异表达的基因产物不表达或以明显较低的水平表达，前药可以未活化或以较低的量活化，并因此可对正常细胞的毒性较低。因此，癌症前药可在一些实施方案中以较高的剂量给予，使得癌细胞可代谢前药，其将例如杀死癌细胞，而正常细胞将不代谢前药或不同样地代谢，并因此对患者的毒性较低。这样的一个实例是其中肿瘤细胞过表达金属蛋白酶，这在Atkinson等人，British Journal ofPharmacology (2008) 153，1344-1352中有所描述。使用蛋白酶靶向癌细胞还在Carl等人，PNAS,Vol.77，N0.4，第2224-2228页，1980年4月中有所描述。例如，可将多柔比星或其他类型的化疗剂连接到由差异表达的基因产物特异性裂解或识别的肽序列。然后将多柔比星或其他类型的化疗剂从肽序列裂解并活化，使得它可以杀死癌细胞或抑制癌细胞的生长，而在正常细胞中，化疗剂不内化到细胞中或不够有效地代谢并因此毒性较低。
[0148]在一些实施方案中，治疗结直肠癌的方法可包括本文所述的一种或多种癌相关序列的基因敲低。基因敲低是指降低生物体基因中的一种或多种的表达所借助的技术，其通过遗传修饰(生物体染色体之一的DNA中的变化，诸如但不限于编码癌相关序列的染色体)或通过用诸如序列与mRNA转录物或基因互补的短DNA或RNA寡核苷酸的试剂处理而进行。在一些实施方案中，所用的寡核苷酸可选自:RNA酶-H感受态反义寡核苷酸，诸如但不限于ssDNA寡核苷酸、ssRNA寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸或嵌合寡核苷酸；RNA酶非依赖性反义寡核苷酸，诸如吗啉代寡核苷酸、2' -O-甲基硫代磷酸寡核苷酸、锁核酸寡核苷酸或肽核酸寡核苷酸；RNAi寡核苷酸，诸如但不限于siRNA双链寡核苷酸或shRNA寡核苷酸；或其任意组合。在一些实施方案中，可将质粒引入细胞，其中该质粒表达反义RNA转录物或shRNA转录物。引入的寡核苷酸或表达的转录物可通过互补的碱基配对(有义-反义相互作用)而与靶mRNA(例如，表I中所公开的序列)相互作用。
[0149]具体的沉默机制可随寡核苷酸化学而变化。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸的结合以活化基因或其转录物可通过以下机制导致表达降低:阻断转录，降解mRNA转录物(例如，通过小干扰RNA (siRNA)或RNA酶-H依赖性反义寡核苷酸)，或阻断mRNA翻译、前mRNA剪接位点或用于其他功能性RNA诸如miRNA成熟的核酸酶裂解位点(例如，通过吗啉代寡核苷酸或其他RNA酶-H非依赖性反义寡核苷酸)。例如，RNA酶-H感受态反义寡核苷酸(和反义RNA转录物)可与由裂解RNA链的酶RNA酶-H识别的RNA形成双链体。又如，RNA酶非依赖性寡核苷酸可结合到mRNA并阻断翻译过程。在一些实施方案中，寡核苷酸可在5' -UTR中结合并在起始复合物从5'-帽到起始密码子时停止起始复合物，从而防止核糖体组装。RNAi寡核苷酸的单链可被加载到RISC复合物中，该复合物催化裂解互补序列并抑制具有部分互补序列的一些mRNA的翻译。可通过任何技术将寡核苷酸引入细胞，这些技术包括但不限于电穿孔、显微注射、盐应激法(诸如CaC12应激)；通过阳离子脂质诸如Lipofectamine转染阴离子寡核苷酸；通过胞内释放剂诸如Endo-Porter转染不带电的寡核苷酸；或其任意组合。在一些实施方案中，可使用选自以下的技术将寡核苷酸从血液递送到胞液:纳米粒子复合物、病毒介导的转染、连接到八胍鎗盐树枝状聚合物(octaguanidinium dendrimer)的寡核苷酸(吗啉代寡核苷酸)或其任意组合。
[0150]在一些实施方案中，治疗结直肠癌的方法可包括对细胞进行处理以敲低或抑制编码表I中所公开的mRNA的基因的表达。该方法可包括用表达针对癌相关序列的沉默RNA的逆转录病毒对衍生自hES细胞的克隆胚胎祖细胞系CM02和EN13 (参见名称为“Methodsto accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cellsand cells obtained thereby” 的美国专利公布 2008/0070303 和 2009 年 7 月 16 日提交的并且名称为 “Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains fromPluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby”的美国专利申请 12/504，630)进行培养。在一些实施方案中，该方法还可以包括通过qPCR确认下调。在一些实施方案中，该方法还包括对细胞进行冷冻保存。在一些实施方案中，该方法还包括对细胞进行重编程。在一些实施方案中，该方法包括通过外源性施用0CT4、MYC、KLF4和S0X2(参见Takahashi和 Yamanaka2006Aug25 ；126(4):663-76 ;以 US2009/0068742 公布的并且名称为 “NuclearReprogramming Factor” 的美国专利申请 12/086，479)以及通过在以 W0/2007/019398 公布的并且名称为 “Improved Methods of Reprogramming Animal Somatic Cells，，的 PCT/US06/30632中所述的方法在两天内对细胞进行冷冻保存或重编程。在一些实施方案中，该方法可包括在促进ES细胞繁殖的条件下对哺乳动物分化的细胞进行培养。在一些实施方案中，可以使用任何便利的ES细胞繁殖条件，例如，在饲养层上或在能够繁殖ES细胞的无饲养层培养基中。在一些实施方案中，该方法包括从培养物中的ES集落鉴定细胞。然后可对得自鉴定的ES集落的细胞评价ES标记物，例如0ct4、TRA1-60、TRA1-81、SSEA4等，然后可扩增具有ES细胞表型的那些细胞。可平行地对尚未通过敲低而预处理的对照细胞系进行重编程以证实预处理的有效性。
[0151]本文的一些实施方案涉及治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用调节癌相关蛋白的活性的治疗剂，其中癌相关蛋白由包含选自表1中所公开的序列、其同源物、其组合或其片段的核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，治疗剂结合到癌相关蛋白。在一些实施方案中，治疗剂为抗体。在一些实施方案中，抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化或人类抗体。在一些实施方案中，治疗癌症的方法可包括表1中所公开的序列的基因的基因敲低。在一些实施方案中，治疗癌症的方法可包括对细胞进行处理以敲低或抑制编码表1中所公开的mRNA的基因的表达。在一些实施方案中，癌症选自腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、类癌瘤、印戒细胞腺癌、粘液性腺癌、胃肠道间质瘤、鳞状上皮细胞癌或其组合。
[0152]在一些实施方案中，通过调节表1中所公开的序列或其基因产物的活性或表达而治疗的癌症是通过部位或组织学类型而分类的癌症。
[0153]在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向对其有需要的受试者施用调节癌相关蛋白的活性的治疗剂，其中癌相关蛋白由包含选自表1中的人类核酸序列的核酸序列的核酸编码并且其中治疗剂结合到癌相关蛋白。
[0154]在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括施用抗体(例如，单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体等)，该抗体特异性结合到在细胞表面上表达的癌相关蛋白。在一些实施方案中，抗体结合到癌相关蛋白的胞外域。在一些实施方案中，抗体结合到相对于正常细胞表面在癌细胞表面上差异表达的癌相关蛋白，或在一些实施方案中，结合到至少一个人类癌细胞系。在一些实施方案中，抗体连接到治疗剂。
[0155]在一些实施方案中，实施免疫疗法策略以对癌症或赘生物进行治疗、减轻其症状或预防(例如疫苗)可使用技术人员可以获得的许多不同的技术实现。
[0156]免疫疗法或用于治疗性目的的抗体在最近几年中已用于治疗癌症。被动免疫疗法涉及在癌症治疗中使用单克隆抗体。参见例如Cancer principles and Practice ofOncology，第6版(2001)Chapt.20第495-508页。这些抗体的固有治疗性生物活性包括指导对肿瘤细胞生长或存活的抑制以及募集身体免疫系统的自然细胞杀伤活性的能力。这些药可单独地或结合放疗或化疗剂而施用。作为另外一种选择，可将抗体用于制备抗体偶联物，其中抗体被连接到毒性剂并通过特异性结合到肿瘤而将该毒性剂导向肿瘤。
[0157]癌症疗法的筛选
[0158]在一些实施方案中，提供了鉴定抗癌剂的方法，其中该方法包括将候选试剂与样品接触；以及测定样品中癌相关序列的活性。在一些实施方案中，如果样品中癌相关序列的活性在接触后降低，则将该候选试剂鉴定为抗癌剂。在一些实施方案中，候选试剂为候选抗体。在一些实施方案 中，该方法包括将结合到癌相关序列的候选抗体与样品接触，并测定癌相关序列的活性，其中如果样品中癌相关序列活性在接触后降低则将该候选抗体鉴定为抗癌剂。癌相关序列的活性可以是癌相关序列的任何活性。
[0159]在一些实施方案中，本公开提供鉴定抗癌(例如结直肠癌)剂的方法，该方法包括:将候选试剂与细胞样品接触；以及测定细胞样品中选自以下的癌相关序列的活性--人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE:65639235 (BU536065)、人KIAAl 199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17 (MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15 (LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6(DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20 (KRT20)或其组合，其中如果在细胞样品中癌相关序列的活性在接触后降低则将候选试剂鉴定为抗癌剂。在一些实施方案中，本公开提供鉴定抗癌剂的方法，该方法包括:将结合到选自以下的癌相关序列的候选抗体与细胞样品接触:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽I (AP0BEC1)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶 11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141人 cDNA 克隆 IMAGE:6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2(果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型α I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素α 5 (DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (Ν0Χ01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2 (CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素α 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其组合；以及测定癌相关序列的活性，其中如果在细胞样品中癌相关序列的活性在接触后降低则将候选抗体鉴定为抗癌剂。
[0160]在一些实施方案中，筛选候选药物的方法包括将不存在候选药物的情况下癌相关序列的表达水平与存在候选药物的情况下的表达水平进行比较。
[0161]一些实施方案涉及筛选能够结合到癌相关序列(核酸或蛋白)的治疗剂的方法，该方法包括将癌相关序列和候选治疗剂组合，并测定候选试剂与癌相关序列的结合。
[0162]本文还提供了筛选能够调节癌相关序列的活性的治疗剂的方法。在一些实施方案中，该方法包括将癌相关序列和候选治疗剂组合，并测定候选试剂对癌相关序列的生物活性的影响。可将调节癌相关序列的生物活性的剂用作能够调节癌相关序列的活性的治疗剂。
[0163]一种筛选抗癌活性的方法，该方法包括:(a)将表达癌相关基因的细胞与抗癌候选药物接触，该癌相关基因转录选自表I中所公开的序列、其同源物、其组合或其片段的癌相关序列；(b)检测细胞中抗癌候选药物对癌相关多核苷酸的表达的影响；以及(c)将不存在候选药物的情况下的表达水平与存在候选药物的情况下的表达水平进行比较；其中对癌相关多核苷酸的表达的影响表明候选药物具有抗癌活性。
[0164]在一些实施方案中，评价候选抗癌药物的影响的方法可包括向患者施用药物并从患者中取出细胞样品。然后测定细胞的表达谱。在一些实施方案中，该方法还可以包括将患者的表达谱与健康个体的表达谱进行比较。在一些实施方案中，表达谱包括测量本文所公开的序列的一种或多种或其任意组合的表达。在一些实施方案中，如果本文所公开的序列的一种或多种或其任意组合的表达谱发生改变(升高或降低)，则将候选抗癌药物称为是有效的。
[0165]在一些实施方案中，本发明提供筛选抗癌活性的方法，其包括:(a)提供表达癌相关基因的细胞，该癌相关基因编码选自表I中所示的癌相关序列或其片段的核酸序列；(b)将可衍生自癌细胞的细胞与抗癌候选药物接触；(c)监测细胞样品中抗癌候选药物对癌相关序列的表达的影响；以及任选地(d)将不存在所述候选药物的情况下的表达水平与存在候选药物的情况下的表达水平进行比较。候选药物可以是转录抑制剂、G蛋白偶联受体拮抗剂、生长因子拮抗剂、丝氨酸-苏氨酸激酶拮抗剂、酪氨酸激酶拮抗剂。在一些实施方案中，如果候选药物调节癌相关序列的表达，则将候选药物称为具有抗癌活性。在一些实施方案中，抗癌活性通过测量细胞生长而测定。在一些实施方案中，候选药物抑制或阻碍细胞生长，并称为具有抗癌活性。在一些实施方案中，候选药物导致细胞死亡，并因此将候选药物称为具有抗癌活性。
[0166]在一些实施方案中，本发明提供筛选抗结直肠癌活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括将过表达癌相关基因的细胞与结直肠癌候选药物接触，该癌相关基因与选自表I中所公开的序列、其同源物、其组合或其片段的癌相关序列互补。在一些实施方案中，该方法包括检测结直肠癌候选药物对细胞中癌相关多核苷酸的影响或对细胞生长或活力的影响。在一些实施方案中，该方法包括将不存在候选药物的情况下的表达水平、细胞生长或活力与存在候选药物的情况下的表达水平、细胞生长或活力进行比较；其中对癌相关多核苷酸的表达、细胞生长或活力的影响表明候选药物具有对抗过表达癌相关基因的结直肠癌细胞的活性，其中所述基因包含的序列为选自表I中所公开的序列、其互补序列、其同源物、其组合或其片段的序列。在一些实施方案中，候选药物选自转录抑制剂、G蛋白偶联受体拮抗剂、生长因子拮抗剂、丝氨酸-苏氨酸激酶拮抗剂或酪氨酸激酶拮抗剂。
[0167]在一些实施方案中，本发明提供筛选能够调节癌相关序列的活性的治疗剂的方法，其中所述序列可由包含选自表I中所示的多核苷酸序列的核酸序列的核酸编码，所述方法包括:a)将所述癌相关序列和候选治疗剂组合；以及b)测定候选试剂对所述癌相关序列的生物活性的影响。在一些实施方案中，治疗剂影响癌相关序列的表达；影响癌相关序列的活性。在一些实施方案中，癌相关序列是癌相关蛋白。在一些实施方案中，癌相关序列是癌相关核酸分子。
[0168]鉴定结直肠癌标记物的方法
[0169]特定活细胞中的基因表达模式可能是其当前状态所特有的。几乎所有的细胞状态或类型差异都反映在一种或多种基因的RNA水平的差异。比较未表征的基因的表达模式可提供其功能的线索。对成百上千种基因的表达进行高通量分析可有助于(a)鉴定复杂的遗传疾病，(b)分析随着时间的推移组织与疾病状态之间的差异基因表达，以及(C)药物发现和毒理学研究。某些基因的表达水平的升高或降低与癌症生物学相关联。例如，癌基因是肿瘤发生的正调节物，而肿瘤抑制基因是肿瘤发生的负调节物(Marshall，Cell，64:313-326(1991) ；ffeinberg, Science，254:1138-1146 (1991))。因此，本文的一些实施方案提供在癌症中、尤其是在癌发生中涉及的多核苷酸和多肽序列。
[0170]癌基因是可以导致癌症的基因。致癌作用可通过多种多样的机制发生，包括细胞被含有癌基因的病毒感染、宿主基因组中原癌基因的活化以及原癌基因和肿瘤抑制基因的突变。致癌作用从根本上说由体细胞进化(即，生长控制逐步丧失的变体的突变和自然选择)而驱动。将充当这些体细胞突变的靶标的基因根据其突变表型是显性的还是隐性的而分别归为原癌基因或肿瘤抑制基因。
[0171]本发明的一些实施方案涉及癌相关序列(“靶标记物”)。一些实施方案涉及鉴定可用于诊断和治疗癌症的新型靶标记物的方法，其中在五类细胞类型之间对mRNA、miRNA、蛋白的表达水平或包括但不限于磷酰化和SUMO化的蛋白翻译后修饰进行比较:(I)永生化多能干细胞(诸如胚胎干(“ES”)细胞、诱导多能干(“iPS”)细胞和生殖细胞，诸如胚胎癌性(“EC”)细胞)或性腺组织；(2)ES、iPS或EC衍生的克隆胚胎祖(“EP”)细胞系；
(3)有核血细胞，包括但不限于CD34+细胞和CD133+细胞；(4)正常非永生化成体细胞衍生的组织和培养的细胞，包括:皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、正常非淋巴和非癌性组织等；以及(5)恶性癌细胞，包括培养的癌细胞系或人类肿瘤组织。通常在(或不在)第1、3和5类或第I和5类中表达但不在(或在)第2和4类中表达的mRNA、miRNA或蛋白是癌症诊断和疗法的候选靶标。本文的一些实施方案涉及人类应用、非人类兽医应用或其组合。
[0172]在一些实施方案中，鉴定靶标记物的方法包括以下步骤:1)获得以下细胞的mRNA、miRNA、蛋白或蛋白修饰的分子谱:永生化多能干细胞(诸如胚胎干(“ES”)细胞、诱导多能干(“iPS”)细胞和生殖细胞，诸如胚胎癌性(“EC”)细胞)；ES、iPS或EC衍生的克隆胚胎祖(“EP”)细胞系；恶性癌细胞，包括培养的癌细胞系或人类肿瘤组织；以及2)将那些分子与存在于非永生化体细胞类型(诸如培养的克隆人胚胎祖细胞、培养的得自胎儿或成年来源的体细胞、或恶性癌细胞的正常组织对应物)中的那些进行比较。在诸如hES细胞的多能干细胞与恶性癌细胞之间共有但不存在于大部分体细胞类型中的靶标记物可能是候选诊断标记物和治疗祀标。
[0173]本文的实施方案的癌相关序列例如在表I中公开。这些序列从倍数变化和过滤分析KC110729.5中提取。这些癌相关序列在正常和结直肠肿瘤组织中的表达在表2中公开。一旦确定表达后，即对基因序列结果通过考虑以下因素而进一步过滤:癌细胞系与正常组织中的倍数变化、一般特异性、分泌与否、癌细胞系中的表达水平以及信噪比。癌相关多核苷酸序列包括表I中所示的序列或其同源物。在一些实施方案中，多核苷酸序列可以是选自下文所公开的癌相关序列中的一种或多种的mRNA序列。
[0174]在一些实施方案中，这些方法包括靶向与正常体组织相比在结直肠癌组织中以异常水平表达的标记物。在一些实施方案中，该标记物可包含表I中所公开的序列或其任意组合。
[0175]应当理解，存在多种获得表达数据的方法和表达数据的用途。例如，可用于检测或诊断受试者患有癌症的表达数据可通过实验获得。在一些实施方案中，获得表达数据包括获得样品并对样品进行处理以从实验上确定表达数据。表达数据可包括本文所述的癌相关序列中的一种或多种的表达数据。表达数据可通过例如使用微阵列或诸如但不限于本文所述的那些的定量扩增方法从实验上确定。在一些实施方案中，获得与样品相关的表达数据包括从已对样品进行了处理而从实验上确定了表达数据的第三方接收表达数据。
[0176]检测表达水平或本文所述的相似步骤可通过实验进行或由第三方提供，如本文所述。因此，例如，“检测表达水平”可表示从实验上测量数据和/或获得已对样品进行了处理而确定了表达数据并检测了表达水平的另一方所提供的数据。在一些实施方案中，表达数据可通过实验检测并由第三方提供。
[0177]使用杂交到由以下不同类别的细胞类型制备的RNA探针序列(表I所示)的Illumina基因表达微阵列，进行了 mRNA水平上基因表达的比较:1)人胚胎干(“ES”)细胞或性腺组织；2)ES、iPS或EC衍生的克隆胚胎祖(“EP”)细胞系；3)有核血细胞，包括但不限于⑶34+细胞和⑶133+细胞；4)正常非永生化成体细胞衍生的组织和培养的细胞，包括:皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、正常非淋巴和非癌性组织等；以及5)恶性癌细胞，包括培养的癌细胞系或人类肿瘤组织，以检测通常在(或不在)第1、3和5类或第I和5类中表达但不在(或在)第2和4类中表达的基因。基于此观察结果对这些癌症的疗法将基于降低在癌症中上调的上文提及的转录物的表达，或者说是降低基因产物的表达。
[0178]基因表达阵列:测量基因表达水平可通过本领域中任何已知的方法进行，包括但不限于定量PCR、或微阵列基因表达分析、微珠阵列基因表达分析和Northern分析。基因表达水平可表示为对ADPRT (登录号NM_001618.2)、GAPD (登录号NM_002046.2)或本领域已知的其他看豕基因进彳丁标准化的相对表达。就mRNA表达的微阵列化探针而目，基因表达数据也可用中值法的中位值来进行标准化。在该方法中，每个阵列产生不同的总强度。使用中位值是比较实验中的细胞系(阵列)的可靠方式。例如，找出每个细胞系的中位值，随后这些中位值的中位值成为用于标准化的值。相对于其他细胞系的每一个产生来自各细胞系的信号。
[0179]RNA提取:可将本公开的细胞用0.05%的胰蛋白酶和0.5mM的EDTA孵育，然后收集在含有0.5% BSA的DMEM(Gibco，Gaithersburg, MD)中。可使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从细胞中纯化总 RNA。
[0180]从细胞中分离总RNA和miRNA:可从在收获RNA前经历了血清饥饿以接近在许多成熟组织中观察到的细胞生长停滞的细胞培养物中分离总RNA或富集了小RNA物种的样品。细胞生长停滞可通过更换到含有0.5%血清的培养基持续5天(其中在第一次添加低血清培养基后2-3天更换一次培养基)而进行。RNA可根据Qiagen RNEasy试剂盒的供应商说明而收获以分离总RNA,或根据Ambion mirVana试剂盒的供应商说明而收获以分离富集了小RNA物种的RNA。RNA浓度可通过分光光度法测定，RNA质量可通过变性琼脂糖凝胶电泳以显示28S和18S RNA而测定。具有清楚可见的28S和18S条带而无降解迹象并处于约2:1的28S:18S比率的样品可用于随后的miRNA分析。
[0181]从人类细胞分离的样品中的miRNA测定:miRNA可使用得自Applied Biosystems,Inc.的Human Panel TaqMan MicroRNA Assay进行定量。这是一种两步测定法，它将莖环引物用于逆转录(RT)，然后进行实时TaqMan?。测定法包括两个步骤:逆转录(RT)和定量PCR0实时PCR可在Applied Biosystems7500实时PCR系统上进行。每个细胞的拷贝数可基于合成的mir-16miRNA的标准曲线并假定约15pg/细胞的总RNA质量而估计。
[0182]逆转录反应可使用5 μ I最终体积中的Ix cDNA存档缓冲液、3.35单位MMLV逆转录酶、5mM各dNTP、l.3单位AB RNA酶抑制剂、2.5nM330-plex反向引物(RP)、3ng细胞RNA进行。逆转录反应可在BioRad或MJ热循环仪上按以下循环参数进行:20°C 30秒，42°C 30秒，50°C I秒，60个循环，然后是85°C 5min的一个循环。
[0183]实时PCR。两微升桉1: 400稀释的Pre-PCR产物可用于20ul反应。所有反应均一式两份进行。由于方法非常可靠，重复样品可以是足够并且也足够准确以获得miRNA表达水平的值。ABI的TaqMan universal PCR master mix (TaqMan通用PCR扩增预混试剂)可根据制造商的建议使用。简而言之，可将Ix TaqMan Universal Master Mix(ABI) >IuM正向引物、IuM通用反向引物和0.2uM TaqMan探针用于各实时PCR。所用的条件可以如下:950C lOmin，然后是95°C 15s和60°C Imin的40个循环。所有反应均可在ABI Prism7000序列检测系统上运行。
[0184]微阵列杂交和数据处理。可通过体外转录(IVT) (Affymetrix, Santa Clara,CA)或使用Illumina Total Prep RNA Labelling试剂盒使eDNA样品和细胞总RNA(在八根单独的管中各5yg)接受用于生物素标记的单循环靶标记程序。对于Affymetix基因芯片上的分析，可随后使cRNA片段化然后根据制造商的说明杂交到Human GenomeU133Plus2.0Array (Affymetrix)。微阵列数据可通过 GeneChip Scanner3000 (Affymetrix)处理以生成CEL数据。然后可使CEL数据接受dChip软件分析，该软件具有同时标准化和处理多个数据集的优点。从八个得自细胞的未扩增对照、从八个得自稀释的细胞RNA的独立扩增样品以及从得自20个单细胞的扩增cDNA样品获得的数据可根据程序的默认设置在相应的组内单独标准化。基于模型的表达指数(MBEI)可使用PM/MM差模通过信号强度的log-2变换和低值截断到零而计算。绝对结果(存在、临界和不存在)可通过AffymetrixMicroarray Software5.0 (MAS5.0)算法使用dChip默认设置计算。只有“存在”的探针的表达水平可考虑用于下文所述的所有定量分析。微阵列数据的GEO登录号为GSE4309。对于在 Illumina Human HT-12v4Expression Bead Chips 上的分析而言，标记的 cRNA可根据制造商的说明进行杂交。
[0185]覆盖度和准确度的计算。将真阳性定义为结果为在八个未扩增对照的至少六个中“存在”的探针，将真表达水平定义为“存在”的探针的对数平均表达水平。覆盖度的定义为(在扩增样品中检测到的真阳性探针数)/(真阳性探针数)。准确度的定义为(在扩增样品中检测到的真阳性探针数)/(在扩增样品中检测到的探针数)。扩增的和未扩增的样品的表达水平可按20.5(20,20.5，21，21.5...)的组距划分，其中对准确度和覆盖度进行计算。这些表达水平区间也可用于分析所检测的探针的频率分布。[0186]细胞的基因表达谱分析:对得自细胞的微阵列数据的非监督聚类和邻类分析可使用 GenePattern 软件(http://www.broad, mit.edu/cancer/software/genepattern/)进行，该软件结合排列检验进行信噪比分析/T检验以通过高置信度排除任何样本变异性(包括得自方法和/或活组织检查的那些)带来的贡献。这些分析可在14，128个探针上进行，对于这些探针，20个单细胞中至少6个提供“存在”结果，而20个样品中至少I个提供>20个拷贝每个细胞的表达水平。可将结果为不存在/临界的探针所计算的表达水平截断到零。为了计算相对基因表达水平，可将通过Q-PCR分析获得的Ct值用通过人类全基因组(BD Biosciences)或含有基因片段的质粒定量的各个引物对的效率加以校正。相对表达水平可通过用包含在反应混合物中的加标RNA计算的校准曲线而进一步转化成拷贝数(1gltl[表达水平]=1.05X 1gltl[拷贝数]+4.65)。可进行独立性的卡方检验以评价基因表达与Gata4的关联，它表示通过非监督聚类分析确定的聚类I与聚类2之间的差异并在随后的阶段限于PE。通过Q-PCR测量的各个基因的表达水平可分成三类:高(> 100个拷贝每个细胞)、中(10-100个拷贝每个细胞)和低(< 10个拷贝每个细胞)。得自Gata4表达的独立性卡方检验和P值可基于该分类而计算。卡方定义如下:χ2=ΣΣ (nfirfifj)2/n fi fj，其中i和j分别表示参照(Gata4)和靶基因的表达水平类别(高、中或低)；fi> f j和fij分别表示观察到的类别1、j和ij的频率；以及η表示样品数(η = 24)。自由度可定义为(r-1) X (c-1)，其中r和c分别表示Gata4和靶基因的表达水平类别的可用数量。
[0187]生成针对结直肠癌的免疫反应
[0188]在一些实施方案中，可将抗原呈递细胞(APC)用于在体内或离体活化T淋巴细胞，以引起针对表达癌相关序列的细胞的免疫反应。APC是高度特化的细胞并可包括但不限于巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞(DC)。APC可加工抗原并将其肽片段与淋巴细胞活化所需的分子一起展示在细胞表面上。在一些实施方案中，APC可以是树突状细胞。DC可分成亚类，包括例如滤泡树突状细胞、朗格汉斯树突状细胞和表皮树突状细胞。
[0189]一些实施方案涉及癌相关多肽和编码癌相关序列的多核苷酸、其片段或其突变体以及抗原呈递细胞(诸如但不限于树突状细胞)在受试者中引起针对表达癌相关多肽序列的细胞(诸如但不限于癌细胞)的免疫反应的用途。在一些实施方案中，引起针对表达癌相关序列的细胞的免疫反应的方法包括:(I)分离造血干细胞，(2)对细胞进行遗传修饰以表达癌症相关序列，(3)将细胞分化成DC，以及(4)将DC施用给受试者(例如，人类患者)。在一些实施方案中，引起免疫反应的方法包括:(I)分离DC(或分离并分化DC前体细胞)，(2)用癌相关序列对细胞进行冲击，以及(3)将DC施用给受试者。这些途径在下文予以更详细的描述。在一些实施方案中，可将冲击后的DC或表达性DC用于离体活化T淋巴细胞。这些一般技术及其变型形式可在本领域技术人员的知识范围内(参见例如W097/29182、TO97/04802、TO97/22349、TO96/23060、W098/01538 ；Hsu 等人，1996，NatureMed.2:52-58)，并且另外其他变型形式可能在将来发现。在一些实施方案中，将癌相关序列与受试者接触以刺激免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是治疗性免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是预防性免疫反应。例如，可将癌相关序列与受试者在刺激免疫反应有效的条件下接触。癌相关序列可作为例如DNA分子(例如DNA疫苗)、RNA分子或多肽或其任意组合而施用。施用序列以刺激免疫反应是已知的，但是在本公开之前尚不清楚将使用的序列的种类。本文所公开的任何序列或序列组合或其同源物均可施用给受试者以刺激免疫反应。
[0190]在一些实施方案中，将树突状细胞前体细胞分离以通过癌相关序列转导，然后进行诱导以分化成树突状细胞。进行了遗传修饰的DC表达癌相关序列，并可在细胞表面上展示肽片段。
[0191]在一些实施方案中，所表达的癌相关序列包括天然存在的蛋白的序列。在一些实施方案中，癌相关序列不包括天然存在的序列。如前面所述，可以使用天然存在的蛋白的片段；此外，表达的多肽与天然存在的多肽相比可包含突变，诸如缺失、插入或氨基酸取代，只要至少一个肽表位可由DC加工并呈递在MHC I类或II类表面分子上。在一些实施方案中，可能有利的是使用非“野生型”的序列，以便例如增强肽的抗原性或提高肽表达水平。在一些实施方案中，引入的癌相关序列可编码变体，诸如多态变体(例如由特定的人类患者表达的变体)或特定癌症(例如，在特定受试者中的癌症)所特有的变体。
[0192]在一些实施方案中，可通过多种标准方法中的任一种将癌相关表达序列引入(转导进)DC或干细胞，这些方法包括转染、重组牛痘病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒等。
[0193]在一些实施方案中，可将本发明的转化DC引入受试者(例如但不限于人类患者)，其中DC可诱导免疫反应。通常，免疫反应包括针对具有抗原肽(例如，在MHC I类/肽复合物中)的靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。这些靶细胞通常为癌细胞。
[0194]在一些实施方案中，当将DC施用给受试者时，它们可优选地从得自该受试者的前体细胞分离或衍生自该前体细胞(即，可将DC施用给自体受试者)。然而，可将细胞输注进HLA匹配的异体或HLA不匹配的异体受试者。在后一情况中，可向受试者施用免疫抑制药物。
[0195]在一些实施方案中，细胞可按任何合适的方式施用。在一些实施方案中，细胞可通过药学上可接受的载体(例如盐水)施用。在一些实施方案中，细胞可通过静脉内、关节内、肌内、真皮内、腹膜内或皮下途径施用。施用(即，免疫)可按一定的时间间隔重复。DC的输注可与作用于维持DC数量和活性(例如GM-CSF、IL-12)的细胞因子的施用相结合。
[0196]在一些实施方案中，施用给受试者的剂量可以是足以随着时间的推移在患者中诱导通过测量T细胞增殖、T淋巴细胞细胞毒性的测定法所检测的免疫反应和/或实现有益治疗反应的剂量，例如以抑制癌细胞生长或导致癌细胞数量或肿瘤大小的减小。
[0197]在一些实施方案中，获得DC(例如，从患者中或通过前体细胞的体外分化获得)，然后用具有癌相关序列的抗原肽冲击。冲击导致肽呈递到细胞的表面MHC分子上。展示在细胞表面上的肽/MHC复合物可能能够诱导针对表达癌相关多肽的靶细胞(例如但不限于癌细胞)的MHC限制性细胞毒性T淋巴细胞反应。
[0198]在一些实施方案中，用于冲击的癌相关序列的长度可以为至少约6个或8个氨基酸并少于约30个氨基酸或少于约50个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性肽序列可具有约8至约12个氨基酸。在一些实施方案中，可以使用人类蛋白片段的混合物；作为另外一种选择，可以使用限定序列的特定肽。肽抗原可通过以下方式产生:从头肽合成、用酶消化纯化的或重组的人类肽、从天然来源(例如受试者或得自受试者的肿瘤细胞)纯化肽序列、或表达编码人类肽片段的重组多核苷酸。
[0199]在一些实施方案中，用于冲击DC的肽的量可取决于肽或多肽的性质、大小和纯度。在一些实施方案中，可以使用约0.05ug/ml至约lmg/ml、约0.05ug/ml至约500ug/ml、约 0.05ug/ml 至约 250ug/ml、约 0.5ug/ml 至约 lmg/ml、约 0.5ug/ml 至约 500ug/ml、约0.5ug/ml至约250ug/ml或约lug/ml至约100ug/ml量的肽。在向培养的DC添加肽抗原后，然后可允许细胞吸收并加工抗原足够的时间并与I类或II类MHC相连在细胞表面上表达抗原肽。在一些实施方案中，吸收和加工抗原的时间可为约18至约30小时、约20至约30小时或约24小时。
[0200]已经描述了用于预测不同的MHC I类和II类分子的肽结合基序的系统和方法的许多实例。这种预测可用于预测将结合到所需的MHC I类或II类分子的肽基序。此类方法、系统以及本领域的普通技术人员可出于此目的而查阅的数据库的实例包括:
[0201]1.Peptide Binding Motifs for MHC Class I and II Molecules ；WilliamE.Biddison, Roland Martin，Current Protocols in Immunology, UnitlI (D0I:10.1002/0471142735.1ma01is36 ；Online Posting Date:May,2001)。
[0202]上面的参考文献I提供了肽结合基序在预测与特定MHC I或II类等位基因相互作用方面的用途，并给出了 MHC结合基序在预测T细胞识别方面的用途的实例。
[0203]表3 提供了在 NIH Center for Information Technology (美国卫生研究院信息技术中心)网站、BioInformatics和MolecularAnalysis Section进行的HLA妝基序搜索的示例性结果。
[0204]表3:HLA肽基序搜索的示例性结果
[0205]
【权利要求】
1.一种检测样品中的结直肠癌的方法，包括:a)将所述样品与检测由选自SPINK4、L1TD1、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A 的基因编码的标记物中的至少一种的表达的一种或多种试剂接触；b)将非癌性细胞与得自a)的所述一种或多种试剂接触；以及c)将所述样品中由选自SPINK4、LlTDl、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平与所述非癌性细胞中选自SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBECl、LOC729669、COL10A, SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA的标记物中的一种或多种的表达水平进行比较，其中与所述非癌性细胞相比在所述样品中由选自SPINK4、LlTDl、LY6G6D、APOBECKL0C729669、C0L10A、SLC35D_102 4、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明所述样品具有结直肠癌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品得自受试者。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者为人。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品为体液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述体液为血清。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述试剂为抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸为DNA分子。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸分子的长度为约10-500个核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂具有连接到其上的可检测物质。
12.根据权利要求1所述的方法，包括:a)将所述样品与检测由基因SPINK4、LlTDULY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNT10A 编码的标记物的表达的一种或多种试剂接触；b)将非癌性细胞与得自a)的所述一种或多种试剂接触；以及c)将所述样品中所述标记物的表达水平与所述非癌性细胞中所述标记物的表达水平进行比较，其中与所述非癌性细胞相比在所述样品中由基因SPINK4、L1TD1、LY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、C0L10A、SLC3ro_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 编码的标记物中的至少一种的表达水平更高表明所述样品具有癌细胞。
13.一种用于检测样品中的癌症的试剂盒，包含特异性结合到由基因SPINK4、LlTDULY6G6D、AP0BEC1、L0C729669、⑶L10A、SLC35D_1024、MMP7、MMP12、NMU、WNTlOA 编码的分子的多种试剂。
14.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂为核酸分子。
15.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述核酸分子为DNA分子。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂为蛋白。
17.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述蛋白为抗体。
18.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂用可检测物质标记。
19.一种检测受试者中的结直肠癌的方法，包括:a)从受试者中获得样品；b)将得自所述受试者的所述样品与检测由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达的一种或多种试剂接触:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域1 (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3 (SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物4 (非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素 3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE =6563923 5 (BU536065)、人 KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17(MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2(CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体；c)将非癌性细胞与得自b)的所述一种或多种试剂接触；以及d)比较所述非癌性细胞中由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC35D3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物4(非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (NOXl)、人基质金属肽酶11 (溶基质素3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE:65639235(BU536065)、人KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果 蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17 (MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a l(COLllAl)、人潘氏细胞特异性防御素a5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者1(N0X01)、人脂质运载蛋白15(LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白1(?361)、人封闭蛋白2(0^吧)、人潘氏细胞特异性防御素a6(DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23 (组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7 (基质溶解素，子宫)(MMP7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12 (MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体，其中与所述非癌性细胞相比在得自所述受试者的所述样品中由选自以下的基因编码的标记物中的一种或多种的表达水平更高表明所述受试者患有结直肠癌:人丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal4型(SPINK4)、人含LINE-1型转座酶域I (LlTDl)、人溶质运载蛋白家族35成员D3(SLC3?3)、人淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D(LY6G6D)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人基质金属肽酶12 (巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)、人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽l(APOBECl)、人dickkopf同源物4(非洲爪蟾)(DKK4)、人NADPH氧化酶I (N0X1)、人基质金属肽酶11 (溶基质素3) (MMPll)、人环指蛋白 43 (RNF43)、AGENC0URT_10229596NIH_MGC_141 人 cDNA 克隆 IMAGE:65639235 (BU536065)、人KIAA1199 (KIAA1199)、人癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、人无刚毛鳞甲复合体同源物2 (果蝇属)(ASCL2)、人绒毛蛋白I (VILl)、人裸角质膜同源物I (果蝇属)(NKDl)、预测的:人假想L0C729669 (L0C729669)、细胞表面关联的人粘蛋白17 (MUC17)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人胶原XI型a I (C0L11A1)、人潘氏细胞特异性防御素a 5(DEFA5)、人背板胶质乙酰酯酶同源物(果蝇属)(NOTUM)、人磷脂酶抑制剂(L0C646627)、人NADPH氧化酶组织者I (N0X01)、人脂质运载蛋白15 (LCN15)、人趋化因子(C-C基序)配体24 (CCL24)、人胃泌素释放肽(GRP)、人妊娠特异性β I糖蛋白I (PSGl)、人封闭蛋白2 (CLDN2)、人潘氏细胞特异性防御素a 6 (DEFA6)、人神经肽S受体I (NPSRl)、人胱抑素SN(CSTl)、人角蛋白23(组蛋白脱乙酰酶诱导)(KRT23)、人基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫)(ΜΜΡ7)、人跨膜结构域4亚家族A成员12(MS4A12)、人角蛋白20(KRT20)或其补体。
【文档编号】G01N33/48GK103907022SQ201280051848
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2011年8月31日
【发明者】克伦·查普曼, 约瑟夫·瓦格纳, 迈克尔·韦斯特, 詹妮弗·洛丽·基德, 玛丽亚·普伦德斯, 马库斯·拉彻 申请人:昂科赛特公司