用于对抗体的糖基化进行测定的方法
【专利摘要】本发明涉及用于对抗体与存在于细胞表面上的Fc受体的结合进行检测的方法，并涉及用于对抗体的糖基化水平进行测定的方法。本发明还涉及用于实施所述方法的试剂盒。
【专利说明】用于对抗体的糖基化进行测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于对抗体与存在于细胞表面上的可结晶片段Fe的受体(以下称为“Fe受体”或FcR)的结合进行检测的方法，并涉及用于对抗体的糖基化水平进行测定的方法。
【背景技术】
[0002]多年来，重组单克隆抗体使得得以发生治疗革命。虽然其临床效力不再需要任何证明，然而对于重组单克隆抗体在患者中的作用方式仍知之甚少。靶向膜抗原的抗体的疗效特别涉及募集表达抗体可结晶片段的受体(以下称为“Fe受体”)的效应细胞。
[0003]Fe受体是存在于对免疫系统的功能有贡献的特定细胞表面上的蛋白，所述细胞特别是NK( “自然杀伤”)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞。Fe受体的名字来自于它们与抗体的Fe (可结晶片段)区域结合的能力。存在多种类型的Fe受体，根据Fe受体识别的抗体类型将其分类=Fc Y受体(Fe Y R)与IgG结合；Fc α受体(Fe a R)与IgA结合；以及Fe ε受体(Fe ε R)与IgE结合。
[0004]Fe受体与抗体的结合触发多种机制，这取决于表达该受体的细胞的性质。表I为不同Fe受体的细胞分布以及由该受体与抗体结合所触发的机制的概要。
[0005]表I
【权利要求】
1.一种用于对抗体与存在于测量介质中的细胞膜或完整细胞表达的Fe受体的结合进行测定的体外方法，所述方法包括如下步骤: (i)用FRET伴侣对的第一成员对所述Fe受体进行直接或间接标记，或者向所述介质中引入其Fe受体已预先被所述FRET伴侣对的第一成员直接标记的细胞膜或完整细胞； (?)向所述测量介质中加入用所述FRET伴侣对的第二成员直接或间接标记的所述抗体； (iii)对FRET信号进行测量，所述FRET信号的存在表示所述抗体与所述Fe受体的结合
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用不同的抗体浓度重复所述方法；并且，所述方法包括对抗体-Fe受体键的解离常数进行测定的附加步骤(iv)。
3.—种通过与参比抗体进行竞争，对竞争性抗体与存在于测量介质中的细胞膜或完整细胞表达的Fe受体的结合进行测定的体外方法，所述方法包括如下步骤: (i)用FRET伴侣对的第一成员对所述Fe受体进行直接或间接标记，或者向所述介质中引入其Fe受体已预先被所述FRET伴侣对的第一成员直接标记的细胞膜或完整细胞； (?)向所述测量介质中加入所述竞争性抗体； (iii)向所述测量介质中加入用所述FRET伴侣对的第二成员直接或间接标记的所述参比抗体； (iv)对FRET信号进行测量，与不存在所述竞争性抗体时测得的信号相比，在存在所述竞争性抗体的情况下测得的信号的降低表示所述竞争性抗体与所述Fe受体的结合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，用不同量的竞争性抗体重复步骤(ii)，步骤(iii)中加入的参比抗体的量是固定的；其特征还在于，所述方法包括对所述竞争性抗体的EC50进行测定并将其与所述参比抗体的EC50进行比较的附加步骤(V)。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述参比抗体和所述竞争性抗体在以下方面明显不同:所述竞争性抗体由目的在于改变其Fe片段的糖基化水平的方法生产，或者经过目的在于改变其Fe片段的糖基化水平的处理。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述参比抗体和测试抗体在以下方面明显不同:所述测试抗体由目的在于改变其Fe片段的岩藻糖基化水平的方法生产，或经过目的在于改变其Fe片段的岩藻糖基化水平的处理。
7.一种用于对抗体的糖基化水平进行测定的方法，所述方法包括如下步骤: -实施如权利要求4所述的方法，在所述步骤(ii)中使用糖基化或去糖基化水平已知的数种竞争性抗体；然后 -实施如权利要求4所述的方法，在所述步骤(ii)中使用糖基化水平待测定的抗体；以及 -通过将测试抗体的EC50与所述糖基化或去糖基化水平已知的竞争性抗体的EC50相比较，测定所述测试抗体的糖基化水平。
8.一种用于对抗体的岩藻糖基化水平进行测定的方法，所述方法包括如下步骤: -实施如权利要求4所述的方法，在所述步骤(ii)中使用数种岩藻糖基化或去岩藻糖基化水平已知的竞争性抗体；然后 -实施如权利要求4所述的方法，在所述步骤(ii)中使用岩藻糖基化或去岩藻糖基化水平待测定的抗体；以及 -通过将测试抗体的EC50与所述岩藻糖基化或去岩藻糖基化水平已知的竞争性抗体的EC50相比较，测定所述测试抗体的岩藻糖基化水平。
9.如在先权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述Fe受体是YFc受体。
10.如在先权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述Fe受体是CD16a受体或其变体。
11.如在先权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述Fe受体经由自杀酶直接进行标记，即，其特征在于，所述Fe受体以包含所述Fe受体和所述自杀酶的融合蛋白的形式表达；其特征还在于，通过向所述测量介质中加入缀合有FRET伴侣之一的所述酶的底物实施标记。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述自杀酶选自:06-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体、脱卤素酶突变体或酰基载体蛋白片段。
13.如在先权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，用完整细胞实施所述方法。
14.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含编码Fe受体的DNA序列和编码自杀酶的DNA序列。
15.如权利要求14的表达载体，其特征在于，所述自杀酶选自:脱卤素酶突变体、酰基载体蛋白片段或06-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体。
16.如权利要求14或15所述的表达载体,其特征在于,所述Fe受体是CD16a受体。
17.哺乳动物细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞含有如权利要求14-16中任一项所述的表达载体。
18.如权利要求17所述的细胞，其特征在于，所述细胞已在所述自杀酶的底物存在的情况下进行了孵育，所述自杀酶的底物缀合有FRET伴侣对的成员，该处理导致所述细胞表达的所述Fe受体被所述FRET伴侣对的成员标记。
19.如权利要求17或18所述的细胞，其特征在于，所述细胞处于冷冻形式。
20.用于实施如权利要求1-13中任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求14-16中任一项所述的表达载体、或如权利要求17-19中任一项所述的细胞；以及FRET伴侣对的至少一个成员。
【文档编号】G01N33/542GK103959063SQ201280056607
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月13日 优先权日:2011年9月16日
【发明者】德尔菲娜·贾加, 哈米德·莫克安娜, 斯特凡娜·马丁内斯, 米歇尔·芬克 申请人:Cisbio生物试验公司