专利名称：一种能特异结合河豚毒素的dna适配子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子及其应用。
背景技术：
河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一，存在于河豚等多种海洋生物以及蝾螈、火晰蜴、青蛙、蟾蜍等动物体内，某些细菌(如弧菌属、假单胞菌属等)也可分泌TTX。TTX的分子式为C11H17N3O8，相对分子量为319. 271，是一种小分子物质。TTX是钠离子通道阻断剂，直接影响神经肌肉兴奋性的传导，使得神经肌肉呈麻痹状态，甚至引起死亡。河豚毒素性质稳定，可使水源和食物等长期染毒，易经消化道吸收中毒，分散呈气溶胶状态的河豚毒素，亦可通过呼吸道吸入中毒。河豚毒素是一种强神经毒素，毒性大大超过包括有机磷毒剂在内的所有合成毒剂，它比氰化钠的毒性大1000多倍，国内外因食用河豚或织纹螺而导致河豚毒素中毒死亡的案例时有发生。此外，由于TTX已可人工化学合成，存在可能被恐怖分子利用的潜在威胁。这些使得对TTX的检测越来越被人们所重视。河豚毒素检测方法有很多，包括生物法、酶免疫分析法、气相色谱法、液相色谱法、液相-质谱联用法等，但目前还未见分子生物学快速筛选检测方法。适配子(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化(systematic evolution ofligands by exponential enrichment, SELEX)技术从人工合成的 DNA 或 RNA 随机库中筛选出来的，与非核酸靶物质特异结合的高亲和性单链寡核苷酸序列。SELEX技术是利用分子生物学技术，人工合成单链随机寡核苷酸文库(20 - 60个碱基)，将随机寡核苷酸文库与靶物质相互作用，保留结合的寡核苷酸序列，经反复扩增、筛选，即可使与该靶物质特异结合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技术发展非常迅速，已成功应用于许多靶物质如蛋白质、肽、病毒、细菌、有机物，甚至金属离子等的适配子的筛选。适配子包括DNA适配子和RNA适配子，DNA适配子的稳定性较好。适配子与靶物质的结合是由适配子的三维结构通过氢键、范德华力等与靶物质的特定区域结合的。适配子具有亲和力高、特异性强、靶物质范围广、制备及修饰容易、稳定性好、与靶物质的结合条件可调控、应用灵活等特点，在分子生物学、环境检测、食品卫生检验、生物毒素检测、毒理学等研究领域都有广阔的应用前景，凡是涉及抗体的诊断领域几乎都可以用适配子代替，且优于抗体。因此，本发明以河豚毒素为靶物质，采用SELEX技术，结合克隆、测序、亲和力测定等方法制备了能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立了河豚毒素的DNA适配子-染料直接检测法，将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，达到简便、快递筛选河豚毒素的目的。
发明内容
为了提供一种分子生物学快速筛选检测河豚毒素的方法，本发明提供了一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子， 并建立一种简便、快速筛选检测河豚毒素的DNA适配子-染料直接法。
本发明提供了一种DNA适配子，所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA (ssDNA),能特异结合河豚毒素。所述DNA适配子的核苷酸序列为(SEQ ID NO.1)
5 ^-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGCTTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘。 本发明另外还提供了上述DNA适配子的应用，是将所述DNA适配子用于筛选检测
河豚毒素。所述DNA适配子用于筛选检测河豚毒素是采用DNA适配子-染料法，其能在2小时内快速筛选检测河豚毒素。 所述DNA适配子-染料法的具体步骤如下
取5KL浓度为10pmol/L的DNA适配子的dsDNA于1. 5mL离心管中，加入589M-LPH7. 5的O. Olmol/L磷酸缓冲液，再加入6μ 河豚毒素待测样品，同时以1%乙酸溶液代替河豚毒素待测样品作为空白对照，室温下孵育lh。孵育结束后，取孵育后的溶液198PL于酶标微孔中，同时以O. 01mol/L磷酸缓冲液作为背景信号对照，各加入2PL染料Eva Green,充分结合IOmin后，用多功能酶标仪于激发波长为485nm、发射波长为533nm处测定荧光强度值，当对照溶液与待测样品的荧光差值大于背景信号时，可判定为河豚毒素初筛阳性。DNA适配子-染料直接法筛选检测河豚毒素的检出限为10_6mol/L，即为
3.19X104mg/mL。本发明的显著优点
目前，河豚毒素检测方法有生物法、酶免疫分析法、色谱法、液相-质谱联用法等。鼠生物法是测定TTX的传统方法，但该法与小鼠个体差异显著相关，且操作复杂。用酶免疫分析法测定河豚毒素，需要制备河豚毒素的抗体，而河豚毒素是小分子物质，其抗体尤其是单克隆抗体很难制备。色谱法、液相-质谱联用法等虽然特异性强、灵敏度高，但都需要昂贵的仪器。本发明以河豚毒素为靶物质，采用SELEX技术，制备了能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立了河豚毒素的DNA适配子-染料直接检测法，将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，检测限低。本发明的DNA适配子可通过PCR扩增或人工合成的方式制备，易于获得、长期保存。建立的河豚毒素DNA适配子-染料直接检测法，无需昂贵的仪器和复杂的操作，具有操作简便、成本低廉、快速、灵敏等优点。
图1为适配子的二级结构；
图2为应用DNA适配子检测TTX的原理示意 图3为反应体系的pH值对荧光强度检测的影响；
图4为染料结合时间对荧光强度检测的影响；
图5为TTX检出限的测定结果。
具体实施例方式实施例所需的试验材料河豚毒素购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度> 99% (HPLC)，用1%乙酸溶液将河豚毒素稀释至浓度为lmol/L，4°C保存备用。根据体外人工合成的ssDNA文库的两端固定序列，设计并合成以下引物
引物 I (SEQ ID NO. 2) :5，-GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3，，
引物 II (SEQ ID NO. 3) :5，-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3，，
引物III (SEQ ID N0.4) :5，-地高辛-GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3，，
引物IV (SEQ ID N0.5) :5，-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3，。引物用TE溶液(ρΗ8· O)稀释至浓度为10 μ mol/L，_20°C保存备用。染料EvaGreen购自北京美莱博医学有限公司(Biotium,美国)。实施例1 :能特异结合河豚毒素的DNA适配子1、DNA适配子的核苷酸序列
从体外人工合成的两端为固定序列、中间为35个随机序列、全长为78个碱基的ssDNA文库，采用SELEX技术、结合诱变PCR技术，通过克隆、测序、亲和力测定等手段，筛选获得与河豚毒素(TTX)特异结合的单克隆DNA适配子。DNA适配子的核苷酸序列为
权利要求
1.一种DNA适配子，其特征在于所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA，能特异结合河豚毒素。
2.根据权利要求1所述的一种DNA适配子，其特征在于所述DNA适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的DNA适配子的应用，其特征在于将所述DNA适配子用于筛选检测河豚毒素。
4.根据权利要求3所述的DNA适配子的应用，其特征在于将所述DNA适配子用于筛选检测河豚毒素是采用DNA适配子-染料法，能在2小时内快速筛选检测河豚毒素。
5.根据权利要求4所述的DNA适配子的应用，其特征在于DNA适配子-染料法的具体步骤如下取5ML浓度为10pmol/L的DNA适配子的dsDNA于1. 5mL离心管中，加入589MLPH7. 5的0. Olmol/L磷酸缓冲液，再加入6ML河豚毒素待测样品，同时以1%乙酸溶液代替河豚毒素待测样品作为空白对照，室温下孵育Ih ;孵育结束后，取孵育后的溶液198ML于酶标微孔中，同时以0. 01mol/L磷酸缓冲液作为背景信号对照，各加入2ML染料Eva Green,充分结合IOmin后，用多功能酶标仪于激发波长为485nm、发射波长为533nm处测定荧光强度值，当对照溶液与待测样品的荧光差值大于背景信号时，可判定为河豚毒素初筛阳性。
6.根据权利要求5所述的DNA适配子的应用，其特征在于DNA适配子-染料直接法筛选检测河豚毒素的检出限为10_6mol/L,即为3. 19X 10_4mg/mL。
全文摘要
为了提供一种分子生物学快速筛选检测河豚毒素的方法，本发明提供了一种能特异结合河豚毒素的DNA适配子，并建立一种简便、快速筛选检测河豚毒素的DNA适配子-染料直接法。所述适配子是应用SELEX技术，从人工合成的全长为78个碱基的ssDNA文库中筛选获得的单链DNA(ssDNA)，能特异结合河豚毒素。所述DNA适配子的核苷酸序列为如SEQIDNO.1所示；本发明将制备的DNA适配子应用于河豚毒素的分子生物学检测，检测限低。本发明的DNA适配子可通过PCR扩增或人工合成的方式制备，易于获得、长期保存。建立的河豚毒素DNA适配子-染料直接检测法，无需昂贵的仪器和复杂的操作，具有操作简便、成本低廉、快速、灵敏等优点。
文档编号G01N21/64GK103045602SQ20131000734
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月9日 优先权日2013年1月9日
发明者邵碧英, 杨方, 陈文炳, 王云才, 缪婷玉, 彭娟 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心