一种人体自身抗体联检试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种人体自身抗体联检试纸条及其制备方法，所述试剂条包括顺次搭接的样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸。所述硝酸纤维素膜包括包被有系统性红斑狼疮sm重组抗原和系统性硬化症Scl-70重组抗原的检测区，以及包被有羊抗鼠抗体的控制区；所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记鼠IgG，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原。本发明在双抗原夹心检测体系中，添加了生物素-亲和素微信号放大系统，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检，同时还可同时对系统性红斑狼疮和系统性硬化症进行同步联检，节省检测时间、检测样本和成本。
【专利说明】一种人体自身抗体联检试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种人体自身抗体联检试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]自身抗体指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应。一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。这些自身抗体会攻击机体自身细胞、组织、器官，引起炎症反应，对机体造成伤害。常见的自身免疫疾病包括有结缔组织疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、系统系硬化症、神经肌肉疾病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、内分泌性疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、青少年型糖尿病、消化系统疾病慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎等。
[0003]其中系统性红斑狼疮和系统性硬化症在结缔组织病中分别位居第一位和第二位。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种弥漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮肤粘膜、骨骼肌肉、肾脏及中枢神经系统，同时还会累及肺、心脏、血液等多个器官和系统，出现多种临床表现；血清中可检测到多种自身抗体和免疫学异常。SLE好发于青年女性，发病高峰为15?40岁，男女发病比例为1: 9左右。幼年和老年性SLE的男女之比约为1: 2。全球的患病率约为30?50/10万人，我国的患病率约为70/10万人。尽管SLE的发病受遗传因素的影响，但大多数为散发病例。系统性硬化症(硬皮病)是一种以皮肤各系统胶原纤维硬化为特征的结缔组织疾病。累及内脏器官的系统性硬皮病又称系统性硬化症。本病在结缔组织病中仅次于红斑狼疮而居第二位。患者以女性较多，女性与男性之比约为3: I。发病年龄以20?50岁多见。
[0004]Sm抗体正常参考值为阴性，在临床上是系统性红斑狼疮(SLE)的血清标记抗体。Scl-70抗体正常参考值为阴性，在临床上是全身性硬皮病(PSS)的血清标记性抗体。
[0005]作为自身免疫病的重要血清标志物，人体自身抗体的快速检测对于自身免疫性疾病的诊断、预后和转归判断及理解疾病的病理过程有重要的应用价值和理论意义。
[0006]Sm抗体和Scl-70抗体均属于抗核内可溶性抗原抗体(ENA)范畴，常用的检测方法有凝胶对流电泳、免疫双扩散和免疫印迹法。目前最常用的是免疫印迹法，即采用免疫印迹法技术，通过凝胶电泳对混合抗原进行蛋白分子分离，再将分离出来的蛋白分子转印到膜上，将膜晾干，切成条，制作成检测膜条，再跟试剂盒的其他组成成分配合使用。该方法虽然具有可一次性同时检测多种自身抗体疾病及价格低廉等优点，但制作工艺较为繁杂，耗时长，不利于普及，且背景色复杂，不利于结果的判读。
[0007]如上所述，基于纳米金检测技术，再添加亲和素-生物素信号扩大系统，结合重组抗原制备技术，同时通过调整不同的制备工艺参数，在克服纳米金灵敏度不足的同时也可以实现系统性红斑狼疮和系统性硬化症的同步检测。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于解决现有技术中存在的自身抗体检测膜条制作工艺繁杂，耗时长，不利于普及，且背景色复杂，不利于结果的判读等缺陷，提供了一种人体自身抗体联检试纸条及其制备方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案:
[0010]1.一种人体自身抗体联检试纸条，包括样品垫(I)、与所述样品垫(I) 一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜(2)、与所述玻璃纤维膜(2)另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)、以及与所述硝酸纤维素膜(3)的另一端紧密相连的吸水纸(4)，所述样品垫(I)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸⑷均设置于底板(5)上，所述硝酸纤维素膜(3)包被有系统性红斑狼疮sm重组抗原的检测区(6)和系统性硬化症Scl-70重组抗原的检测区(7)，以及包被有羊抗鼠抗体的控制区(8)，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的鼠IgG，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原。
[0011]优选地，所述系统性红斑狼疮Sm重组抗原用量为0.13-0.27μ g/mm，所述系统性硬化症Scl-70重组蛋白用量为0.13-0.27 μ g/mm,所述胶体金标记有鼠IgG抗体，用量为15-50 μ g/cm2。所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-Sm/SCL-70重组抗原复合物的用量为12.5-68 μ g/cm2。所述羊抗鼠抗体为羊抗鼠IgG抗体，所述羊抗鼠抗体的用量为0.20-0.48 μ g/mm。
[0012]本发明还提供了一种上述试纸条的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)制备系统性红斑狼疮sm重组抗原、系统性硬化症Scl-70重组抗原以及胶体金标记鼠IgG抗体；
[0014](2)制备微信号放大系统
[0015]a、制备胶体金标记亲和素
[0016]将待标记亲和素预先在0.001?0.01mol/L的NaCl溶液中透析过夜，离心，调节胶体金液的pH值至9?10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；
[0017]b、按常规方法制备生物素化sm重组抗原和生物素化Scl-70重组抗原；
[0018]C、完成微信号放大系统
[0019]将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化sm/Scl-70重组抗原混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原复合物，洗涤，即得微信号放大系统；
[0020](3)按稀释参数25?40cm2/ml，将步骤(2)的胶体金-亲和素-生物素-sm重组抗原、以及胶体金-亲和素-生物素-Scl-70重组抗原喷洒到玻璃纤维膜上，干燥12个小时以上，备用；
[0021](4)用包被缓冲液稀释sm重组抗原，使其浓度为1.0?1.5mg/ml，按膜液量0.15?0.2 μ 1/mm,将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上,干燥12个小时以上,备用；
[0022]用包被缓冲液稀释Scl-70重组抗原，使其浓度为1.0?1.5mg/ml,按膜液量
0.15?0.20 μ 1/mm,将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上,干燥12个小时以上,备用；
[0023]用包被缓冲液稀释羊抗鼠抗体，使其浓度为1.0?2.0mg/ml，按膜液量0.16?0.20 μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上,备用；
[0024](5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。
[0025]为了解决信号扩大不足和不能用免疫层析法同步检测人体自身抗体疾病的问题，本发明基于固相免疫层析原理，采用功能性彩色微球技术(胶体金颗粒标记技术)、微信号放大技术(亲和素-生物素体系和双抗原夹心反应体系)及联检技术检测人体血液中的系统性红斑狼疮sm抗体和系统性硬化症Scl-70抗体。若样品中含有系统性红斑狼疮sm抗体或系统性硬化症Scl-70抗体，经玻璃纤维膜上的微信号级联系统将信号放大，使sm/Scl-70抗体与胶体金颗粒标记物结合，形成复合物，并扩散到硝酸纤维素膜上进一步层析，当遇到包被在硝酸纤维素膜上检测区的检测线6或者检测线7 (分别为系统性红斑狼疮sm重组抗原或系统性硬化症Scl-70重组抗原包被线)处的配对抗原时，复合物则又和包被抗原结合，被捕获在包被处，当被捕获的复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的检测线条，说明样品中含有sm抗体或者Scl-70抗体，若不出现，说明样品为阴性或含量低于试纸条的最低检测限。控制区(C线)作为试纸条的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0027](I)本发明在现有检测试纸条的基础上，添加了生物素-亲和素微信号级联放大系统，因而，在检测自身抗体的过程中，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检；
[0028](2)本发明的试纸条具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(3-5分钟左右即可有结果)等优点，可实现对系统性红斑狼疮和系统系硬化症的POCT检测；
[0029](3)本发明的试纸条可以实现在一条纸条上同时检测系统性红斑狼疮、系统性硬化症，相对于免疫印迹方法缩短了检测时间；相对于市面现有的自身免疫性疾病免疫层析试纸条检测产品，增加了检测灵敏度，并实现了 2种自身免疫性疾病的同步检测,节约了一次性耗材。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明的一种人体自身抗体联检试纸条的结构示意图；
[0031]图2为利用本发明一种人体自身抗体联检试纸条检测系统性红斑狼疮和系统性硬化症的有效检验结果示意图
[0032]图3为利用本发明一种人体自身抗体联检试纸条检测系统性红斑狼疮和系统性硬化症的无效结果检验结果示意图
[0033]附图标记:1.样品垫；2.玻璃纤维膜；3.硝酸纤维素膜；4.吸水纸；5.底板；6.系统性红斑狼疮检测区；7.系统性硬化症检测区；8.质控区。
【具体实施方式】
[0034]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0035]实施例1本发明系统性红斑狼疮和系统性硬化症的联检试纸
[0036]如图1所示，为本发明所述的一系统性红斑狼疮和系统性硬化症的联检试纸。包括样品垫1、与所述样品垫I 一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜2、与所述玻璃纤维膜2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜3、以及与所述纤维素膜3的另一端紧密相连的吸水纸4，所述样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4均设置于底板5上，所述硝酸纤维素膜3包括包被有系统性红斑狼疮sm重组抗原的检测区6、包被有系统性硬化症Scl-70重组抗原的检测区7和包被有羊抗鼠抗体的控制区8，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记鼠IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原，其中sm/Scl-70重组抗原为系统性红斑狼疮sm重组抗原或系统性硬化症Scl-70重组抗原。
[0037]本发明所述的一种人体自身抗体联检试纸条，所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-系统性红斑狼疮sm重组抗原复合物在玻璃纤维膜2上的用量为50 μ g/cm2 ;胶体金颗粒-亲和素-生物素-系统性硬化症Scl-70重组抗原复合物在玻璃纤维膜2上的用量为55 μ g/cm2 ;胶体金标记鼠IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为30 μ g/cm2 ;系统性红斑狼疮sm重组抗原的原始浓度为3.5mg/ml和系统性硬化症Scl-70重组抗原的原始浓度为
2.5mg/ml,包被到硝酸纤维膜3的检测区6和检测区7时的浓度分别为1.0mg/ml和1.2mg/ml，包被用量分别为0.18 μ g/mm和0.21 μ g/mm ;羊抗鼠IgG抗体包被在控制区时的用量为0.30 μ g/mm。
[0038]实施例2本发明试纸条的制备方法
[0039]在本发明中采用胶体金颗粒标记。其中胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级(30?50nm),胶体金颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质,与蛋白质分子的正电荷集团，靠静电吸引而结合形成免疫诊断试剂。
[0040]下面对本发明试纸条的制备方法介绍如下:
[0041]一种人体自身抗体联检试纸条，其制备步骤如下:
[0042]1.制备系统性红斑狼疮sm重组抗原和系统性硬化症Scl-70重组抗原。
[0043]参阅文献及用生物专用软件分析系统性红斑狼疮sm蛋白和系统性硬化症Scl-70蛋白，明确功能性片段及其氨基酸序列，用PCR扩增方法或者基因合成方法获取功能性蛋白片段，采用的原核表达体系或者真核表达体系表达目标蛋白并根据蛋白特性进行重组蛋白纯化和功能性鉴定。
[0044]2、制备微信号放大系统
[0045]a、制备胶体金标记亲和素:将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4°C透析过夜，以除去多余的盐离子，然后4°C IOOOOOg离心lh，去除聚合物；以
0.lmol/L K2CO3或0.lmol/L HCl调节胶体金液的pH值至9?10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；
[0046]b、制备生物素化sm/Scl-70重组抗原:先用6_氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，再使其与sm/Scl-70重组抗原结合，然后在碳二亚胺的作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-轻基丁二酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinylami do hexanoate, BCNHS),即为生物素化sm/Scl-70重组抗原。通过透析除去游离生物素。
[0047]C、完成微信号放大系统:将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化sm/Scl-70重组抗原直接混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原复合物，经过洗涤、离心处理后，即得微信号放大系统。[0048]3、胶体金标记鼠I gG抗体
[0049]在pH6.5?7.0范围内，鼠IgG与胶体金颗粒蛋白标记形成胶体金标记鼠IgG抗体(蛋白探针)。
[0050]4、将胶体金-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原、以及胶体金标记鼠IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜2上，稀释参数(稀释参数是每ml溶液喷洒多少面积的工艺参数)为25?35cm2/ml，并在温度20?40°C，湿度10% -30%，将玻璃纤维膜2干燥12个小时以上，备用。
[0051]5、用包被缓冲液(主要成分是磷酸缓冲液、蔗糖)稀释sm/Scl-70重组抗原，使其浓度为1.0mg/ml，按膜液量0.18 μ 1/mm,将其分别细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，其中硝酸纤维素膜3孔径为5.0?12.0 μ m，置于20?40°C，湿度10%?30%条件下烘干处理12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，使其浓度为1.5mg/ml，按膜液量
0.20 μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，置于20?40°C，湿度10%?30%条件下烘干处理12个小时以上，封袋，备用；
[0052]6、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4依序粘贴于底板7上，即得本发明所述的试纸条。
[0053]本发明所述的系统性红斑狼疮和系统性硬化症的联检试纸经过包装可以直接使用，或者安装到试剂盒里，配合小滴管，充当试剂卡使用。
[0054]实施例3利用实施例1中的试纸条检测样本中的系统性红斑狼疮sm抗体和系统性硬化症Scl-70抗体的方法
[0055]本实施例利用实施例1的试纸条对人血液样本中的sm/Scl-70抗体进行检测。
[0056]包括以下步骤:
[0057](I)采集血液样本，离心收取血清。
[0058](2)沿铝箔袋切口部位撕开，取出试条平放，吸取5μ I样本垂直滴加于试条箭头胶所示的加样区(图1);由于毛细管作用，样品将沿着试纸条经过玻璃纤维素膜2和硝酸纤维素膜3。
[0059](3)5分钟后观察显示结果(30分钟后显示的结果无效)，判读并记录检测结果(图2和图3)，若硝酸纤维素膜3的检测区6出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中含有大量系统性红斑狼疮sm抗体，即说明受检验者患有系统性红斑狼疮(系统性红斑狼疮sm抗体阳性，请同时参考图2);若检测区7出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中含有系统性硬化症Scl-70抗体，说明受检验者患有系统性硬化症(系统性硬化症Scl-70抗体阳性，请同时参考图2);若检测区6和检测区7同时显色，即说明受检验者同时患有系统性红斑狼疮和系统性硬化症；若硝酸纤维素膜3的检测区6和检测区7均未出现肉眼可见的显色线条，即表明样品中未含有可检出的sm抗体或Scl-70抗体，说明受检验者未患有系统性红斑狼疮和系统性硬化症(阴性，请同时参考图2);当样品通过硝酸纤维素膜3的检测区6和检测区7移动至控制区8时，无论样品中是否含有sm抗体或者Scl-70抗体，控制区8都会出现有一条深色线(C线)；若控制区8无显色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误，检测结果无效(请参考图3)；
[0060](4)测试结束后，将使用后的试纸条、加样管按生物医疗废弃物进行处理。
【权利要求】
1.一种人体自身抗体联检试纸条，其特征在于，包括样品垫(1)、与所述样品垫(1) 一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜(2)、与所述玻璃纤维膜(2)另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)、以及与所述硝酸纤维素膜(3)的另一端紧密相连的吸水纸(4)，所述样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)均设置于底板(5)上，所述硝酸纤维素膜(3)包括包被有系统性红斑狼疮sm重组抗原的检测区(6)、包被有系统性硬化症Scl-70重组抗原的检测区(7)，以及包被有羊抗鼠抗体的控制区(8)，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的鼠IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-sm/SCL-70重组抗原。
2.根据权利要求1所述的人体自身抗体联检试纸条，其特征在于平行包被了系统性红斑狼疮sm重组抗原和系统性硬化症SCL-70重组抗原，可以同时检测系统性红斑狼疮和系统性硬化症。
3.根据权利要求2所述的人体自身抗体联检试纸条，其特征在于，所述系统性红斑狼疮sm重组抗原用量为0.13-0.27μ g/mm，所述系统性硬化症SCL-70重组蛋白用量为0.13-0.27 μ g/mm。
4.根据权利要求1-3所述的人体自身抗体联检试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原复合物的用量为12.5-68 μ g/cm2。
5.根据权利要求1所述的人体自身抗体联检试纸条，其特征在于，所述胶体金标记有鼠IgG抗体，用量为15-50 μ g/cm2。
6.根据权利要求1所述的人体自身抗体联检试纸条，其特征在于，所述羊抗鼠抗体为羊抗鼠IgG抗体，所述羊抗鼠抗体的用量为0.20-0.48 μ g/mm。
7.一种制备权利要求1所述的人体自身抗体联检试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备系统性红斑狼疮sm重组抗原、系统性硬化症Scl-70重组抗原以及胶体金标记鼠IgG抗体； (2)制备微信号放大系统 a、制备胶体金标记亲和素 将待标记亲和素预先在0.001~0.01mol/L的NaCl溶液中透析过夜，离心，调节胶体金液的PH值至9~10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素； b、按常规方法制备生物素化sm重组抗原和生物素化Scl-70重组抗原； C、完成微信号放大系统 将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化sm/Scl-70重组抗原混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-sm/Scl-70重组抗原复合物，洗涤，即得微信号放大系统； (3)按稀释参数25~40cm2/ml，将步骤(2)的胶体金-亲和素-生物素_sm重组蛋白、以及胶体金-亲和素-生物素-Scl-70重组蛋白喷洒到玻璃纤维膜上，干燥12个小时以上，备用; (4)用包被缓冲液稀释sm重组抗原，使其浓度为1.0~1.5mg/ml，按膜液量0.15~.0.2 μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上,备用； 用包被缓冲液稀释Scl-70重组抗原，使其浓度为1.0~1.5mg/ml，按膜液量0.15~`0.20 μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上,备用； 用包被缓冲液稀释羊抗鼠抗体，使其浓度为1.0~2.0mg/ml,按膜液量0.16~`0.20 μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上,备用； (5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。
8.根据权利要求7所述的人体自身抗体联检试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中胶体金-亲和素-生物素-sm重组抗原复合物的用量为12.5-68 μ g/cm2，胶体金-亲和素-生物素-Scl-70重组抗原复合物的用量为12.5-68 μ g/cm2。
9.根据权利要求7所述的人体自身抗体联检试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中sm重组抗原用量为0.13-0.27 μ g/mm ;Scl_70重组抗原的用量为0.13-0.27 μ g/mm ;所述羊抗鼠抗体的用量为0.20-0.48 μ g/mm。
【文档编号】G01N33/558GK103913568SQ201310007578
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月4日 优先权日:2013年1月4日
【发明者】王继华, 王雪霞, 唐时幸 申请人:广州万孚生物技术股份有限公司