用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法，该方法包括以下步骤：（1）制备参芪扶正注射液的供试品；（2）制备差异样品；（3）测定差异样品的指纹图谱；（4）测定差异样品的药效；（5）进行谱效关系分析，以评价共有峰的药效活性。通过采用本发明的方法，发明人得知参芪扶正注射液指纹图谱的9号峰、11号峰、12号峰、15号峰、20号峰为活性成分，5号峰和/或13号峰为负相关成分，有利于对中药药品质量、安全性和有效性进行控制。
【专利说明】用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种评价中药化学成分的方法，具体涉及一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法，以及该方法的应用。
【背景技术】
[0002]党参(Radix Codonopsis)药性平和，用途广，具有多方面的药理活性，不仅对消化、心血管系统有作用，还能调节免疫系统功能，增强机体的抵抗力，毒性甚微。黄芪(RadixAstragalus)是补气主药，能明显增加巨噬细胞的吞噬功能，与党参合用，能使巨噬细胞吞噬有害物质的作用增强。
[0003]参芪扶正注射液是由党参、黄芪经提取制成的纯中药制剂，以益气扶正为主。党参和黄芪两种药物的性味及归经一致，功效基本相同，两者相加，起到君臣佐使、相使的协同作用，明显增强了临床疗效。
[0004]然而，在参芪扶正注射液的现行质量标准中，原质量标准指纹图谱中仅关注了 S峰(毛蕊异黄酮苷)和极性较大的水溶性成分，以及关注了含量测定项下的黄芪甲苷含量，难以评估参芪扶正注射液中的各活性成分，及其负相关成分，不利于对产品的安全性和有效性进行标准控制。
[0005]因此，在参芪扶正注射液的生产过程中，还需要寻求一种能够有效评价和筛选其活性成分以及负相关成分的有效方法。
【发明内容】
[0006]因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种能够较为全面地评价参芪扶正注射液化学成分的方法以及该方法的应用，以帮助建立更为合理、有效的中药质量控制模式。
[0007]本发明提供了一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法，该方法包括以下步骤:
[0008](O制备供试品:取每ml含0.5?Ig党参和0.5?Ig黄芪的参芪扶正注射液作为供试品;
[0009](2)制备差异样品:使用高速逆流色谱法(HSCCC)分离所述供试品，分别收集9(Tl25min、125?183min、183?210min的分离液体和管路液体，分别作为第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品，然后按照四因素九水平均匀设计表勾兑所述第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品，得到差异样品1、；换言之，从90min开始收集第一部分样品，从125min开始收集第二部分样品，从183min开始收集第三部分样品，至210min。所述管路液体是指在收集完第三部分样品之后，管路中剩余的溶有供试品的流动相。
[0010](3)测定差异样品的指纹图谱:采用高效液相色谱法(HPLC) - 二极管阵列检测器(DAD)-蒸发光散射检测器(ELSD)联用技术对步骤(2)所得的差异样品1、分别进行指纹图谱测定，并确定23个共有峰；
[0011](4)测定差异样品的药效:将差异样品1、分别稀释至适当浓度后，向经环磷酰胺处理的小鼠分别进行注射，然后测定包括脾脏指数、外周血白细胞数、骨髓细胞数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清IL-2水平的药效学指标；
[0012](5)谱效关系分析:采用包括灰色关联分析、多元线性回归分析和主成分分析的方法，分析步骤(3)所得的指纹图谱与步骤(4)所得的各药效学指标之间的关系，以评价共有峰(及其所代表的化学物质)的药效活性。
[0013]所述灰色关联分析，在本领域通常是指根据各比较数列构成的曲线与参考数列构成的曲线之间的几何相似程度来确定比较数列与参考数列间的关联度。几何形状越接近，关联程度越大。在本发明中，发明人将各药效学指标处理为参考数列，将各差异样品的各共有峰面积处理为比较数列，用于计算各共有峰与药效学指标之间的关联度，并进行排序。
[0014]所述多元线性回归分析，在本领域通常是指自变量为多个且因变量为一个时的线性回归分析。
[0015]所述主成分分析，在本领域通常是指将原来众多具有一定相关性指标，重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来指标的一种统计分析方法。
[0016]另外，在确定了 23个共有峰之后，还可依据差异样品1、的23个共有峰的峰面积进行聚类分析，用于辅助后续的谱效关系分析。
[0017]根据本发明的方法，其中，步骤(2)中，高速逆流色谱法的溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水，将溶剂静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，六通阀接法为正接正转，转速为80(T900rpm，以1.5^2ml/min的流速将流动相泵入，建立动态平衡后上样步骤(I)所得的供试品，再进行所述的收集。作为优选，所述转速可以为900rpm，泵入流动相的流速可以为2ml/min。作为更优选，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比可以为4:1: 5。
[0018]根据本发明的方法，其中，在步骤(1)中，取每ml含党参、黄芪各0.5g的参芪扶正注射液，经0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品。作为优选，在步骤(2)中的上样之前，将250ml的所述供试品浓缩至20ml，旋蒸至干后以5ml所述溶剂体系溶解，然后进行上样。
[0019]根据本发明的方法，其中，所述四因素九水平均匀设计表的九个水平分别为O、12.5%,25%,37.5%,50%,62.5%,75%,87.5%、100%。更具体的，所述四因素九水平均匀设计表可以如下表1:
[0020] 表1四因素九水平均匀设计表(差异样品勾兑方案)
[0021]
【权利要求】
1.用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)制备供试品:取每ml含0.5~1g党参和0.5~1g黄芪的参芪扶正注射液作为供试品； (2)制备差异样品:使用高速逆流色谱法分离所述供试品，分别收集90~l25min、125^183minU83^210min的分离液体和管路液体，分别作为第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品，然后按照四因素九水平均匀设计表勾兑所述第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品，得到差异样品1~9 ； (3)测定差异样品的指纹图谱:采用高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术对步骤(2)所得的差异样品1~9分别进行指纹图谱测定，并确定23个共有峰； (4)测定差异样品的药效:将差异样品1、分别稀释至适当浓度后，向经环磷酰胺处理的小鼠分别进行注射，然后测定包括脾脏指数、外周血白细胞数、骨髓细胞数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清IL-2水平的药效学指标； (5)谱效关系分析:采用包括灰色关联分析、多元线性回归分析和主成分分析的方法，分析步骤(3)所得的指纹图谱与步骤(4)所得的各药效学指标之间的关系，以评价共有峰的药效活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，高速逆流色谱法的溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水，将溶剂静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，六通阀接法为正接正转，转速为800~900rpm，以1.5^2ml/min的流速将流动相泵入，建立动态平衡后上样步骤(1)所得的供试品，再进行所述的收集；优选地，所述转速为900rpm，泵入流动相的流速为2ml/min ;更优选地，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为4:1:5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，取每ml含党参、黄芪各0.5g的参芪扶正注射液，经0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品；优选地，步骤(2)中的上样之前，将250ml的所述供试品浓缩至20ml，旋蒸至干后以5ml所述溶剂体系溶解，然后进行上样。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述四因素九水平均匀设计表的九个水平分别为 0,12.5%,25%,37.5%,50%,62.5%,75%,87.5%、100%。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以 Dionex Acdaim? Polar Advantage C18(3 μ m, 50mmX 3.0mm)为前处理柱，以 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (3.5 μ m, 150mmX 3.0mm)为分析柱，柱温为30°C;优选地，采用在线前处理模式，将所述差异样品1、分别从进样器进样后，由预处理流动相通过装载泵带入前处理柱，并于进样后1.2min切换至前处理柱与分析柱相连的状态，由分析泵用分析流动相将前处理后的差异样品正冲入分析柱进行分离分析；更优选地，所述预处理流动相为2%乙腈；所述分析流动相为作为流动相A的乙腈和作为流动相B的水。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件还包括:采用二极管陈列检测器和蒸发光散射检测器相互串联的方式进行图谱采集；优选地，在0~33min时采用二极管阵列检测器进行检测，在33~40min采用蒸发光散射检测器进行检测；更优选地，所述二极管阵列检测器的检测波长在0~23.5min时为266nm，在23.5~33min时为208nm ;更优选地，在蒸发光散射检测器的检测中，N2的压力为3.5bar，漂移管温度为60°C，增益值为10。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术按照以下条件进行梯度洗脱:
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述小鼠为Balb/c 小鼠。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述灰色关联分析包括如下步骤: 1)将各差异样品的药效学指标组成参考数列，将各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列；2)对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理；优选采用均值化方法进行处理；3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列，计算各共有峰与药效之间的关联度； 4)对步骤3)所得关联度进行排序，以评价共有峰的药效活性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，共有峰药效活性的评价结果为:9号峰、11号峰、12号峰、15号峰、20号峰为活性成分；所述9号峰为毛蕊异黄酮-7-0- β -D-葡萄糖苷，11号峰为异微凸剑叶莎醇_7，2' - 二 -O-葡萄糖苷，12号峰为鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷，15号峰为9，10- 二甲氧基紫檀烷-3-0-木糖葡萄糖苷，20号峰为黄芪甲苷；优选地，5号峰为负相关成分，所述5号峰为5-羟甲基糠醛；更优选地，13号峰也为负相关成分，所述13号峰为党参炔苷。
【文档编号】G01N30/88GK103913533SQ201310008395
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月9日 优先权日:2013年1月9日
【发明者】苏薇薇, 王锦旭, 童欣, 曹晖, 李沛波, 彭维, 王永刚 申请人:丽珠集团利民制药厂, 中山大学