专利名称：淋球菌ng检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种淋球菌(NG)检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的NG-DNA检测试剂盒。
背景技术：
奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrheae, NG) 1879年由Neisser发现,俗称淋病双球菌或淋球菌，是引起人类淋病的致病病原体，属奈瑟菌属。淋球菌(NG)有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是发展中国家发病率较高的性传播疾病之一。NG主要通过性接触直接感染，也可以通过接触患者的衣物或马桶等间接感染，还可以通过产道感染分娩时的胎儿。淋病是世界上发病人数较多的性病之一，估计每年世界的患病人数大约有I亿；在美国，据保守的估计，每年至少发生100万例患者。我国在解放后不久淋病基本消灭，但是从1977年起淋病死灰复燃，并迅速蔓延到全国各地，在短短的几年时间里报告病例数迅速攀升，至九十年代中期达到高峰，此后其发病水平开始缓慢回落，但仍然维持在较高水平。近年来，淋病的发病水平又呈上升的势头，在性传播疾病中位居前列。由NG感染引起的疾病是性传播疾病中的一种重要疾病，由于NG感染者临床症状不典型，如何快速、准确的进行检测，对疾病的诊断、治疗和控制等有着十分重要的意义。目前淋球菌的实验室诊断方法主要有分离培养法、涂片镜检法、免疫学方法、基于PCR技术的检测方法等。分离培养法的操作简单，特异性较高，被认为是诊断淋球菌的“金标准”，但是培养耗时比较长，同时敏感性较低，可能因病原微生物的量过少，或接种后病原微生物不成活而延误病情。涂片镜检法简便易行，价格低廉，但其特异性受取材、涂片、染色等各种因素的影响，且镜下淋病双球菌极易与其他的革兰氏阴性双球菌混淆，易发生误诊和漏诊。免疫学方法主要包括酶联吸附试验和免疫胶体金技术，操作简单且灵敏性优于培养法。近年来，聚核酶链式反应(`PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。目前国内临床上主要采用煮沸法对淋球菌的核酸进行提取，具体是先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污；另外，对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，能看到沉淀是因为该步骤将核酸与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的则使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到核酸。临床上检测NG-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应;如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术检测NG-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在50(Tl000COpies/ml左右；另外，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
发明内容
本发明提供一种核酸释放剂在淋球菌NG检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. OI O. 5mM/L,氯化钾20^300mM/L,十二烷基磺酸钠O. OI 2%和乙醇
O.05 1%。在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在淋球菌NG检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该核酸检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。本发明提供一种淋球菌NG检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. 0Γ2%和乙醇O. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测淋球菌NG的灵敏度可达400copies/ml，检测线性范围为400 4. 00E+10copies/ml。具体地，用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’;优选用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分别为5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’_GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本发明中所述内标为插入PUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且优选内标探针的序列为5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。在一个具体实施方式
中，所述试剂盒中还包括NG阳性对照、NG阴性对照和NG定
量参考品O本发明还提供一种淋球菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分别为5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5， -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3，。本发明又提供一种淋球菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷 酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。本发明还具体提供一种淋球菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂、PCR反应液、内标、酶混合液、NG阳性对照、NG阴性对照和NG定量参考品；且所述核酸释放剂中包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. θΓ2%,乙醇
O.05^1%和溶剂TE缓冲液；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，用于内标扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，10XPCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述内标为插入PUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本发明提供的NG荧光PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对生殖道分泌物等未知样本中的NG-DNA进行快速准确的检测，为诊断淋球菌感染提供可靠的实验依据。其检测结果可用于NG感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为性病的早期诊断以及性病高危人群的初筛提供分子诊断依据。
图1中①为实施例中淋球菌NG-DNA检测结果为阳性的待测样本的扩增曲线，图1中②为实施例中NG-DNA检测结果为阴性的待测样本的扩增曲线。
具体实施例方式以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例1本实施例提供一种具体的淋球菌荧光PCR检测试剂盒，它包括如下组分①核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin) O.1mM/L,氯化钾100mM/L,十二烧基磺酸钠(SDS) O. 1%, O. 1% 的乙醇。②内标(阳性内对照)为插入PUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为5. 00E+05copies/ml,97碱基对的序列为5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。③PCR反应液包括10XPCR反应缓冲液5 μ 1，O. 2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为O. 3 μ mol/L，用于靶多核苷酸检测的探针为O. 3 μ mol/L,用于内标片段扩增的上下游引物均为O. 3 μ mol/L，用于检测内标的探针为O.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反应缓冲液为包括pH7. 5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0. 2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于淋球菌核酸的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为上游引物5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ ；下游引物5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’ ；探针5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATA GGGCTTG-3 ’ ；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为上游引物5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’ ；下游引物5’ -ACAAACGGGCAACATACCTTG-3’ ；探针5’-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。④酶混合液包含5U/ μ I的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑤NG定量参考品来源于使用NG企业定量线性参考品Lf L5定值后的NG强阳性质粒，该淋球菌定量参考品包括Α、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为 4. 00E+07copies/ml (Α)、4· 00E+06copies/ml (Β)、4· 00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑥NG阳性对照为临床医院收集的NG强阳性样本，其浓度为4. 00E+05copies/ml ο⑦NG阴性对照不含有淋球菌、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体、解脲脲原体以及人乳头瘤病毒等的灭活阴性临床样本。实施例2本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测生殖道分泌物等未知样本中NG-DNA的操作步骤一、试剂准备根据待测样本、NG阴性对照、NG阳性对照以及NG定量参考品Al的数量，按比例取相应量的PCR反应液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及内标1. O μ I/人份，充分混匀成PCR-mix，例如待测样本为3人份时，一共需配制9人份(上述四者的人份数分别为3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬时离心后备用。二、样本处理1.方法A :样本直接快速核酸释放每个PCR反应管中加入核酸释放剂2 5μ I (建议深吸浅打，避免出现气泡)，各管依次加入待测样本、NG阴性对照、NG阳性对照及NG定量参考品A D各3飞μ 1，吸打3飞次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；间隔10分钟以上，每管加入ΡΟ -π Χ4(Γ45μ 1，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。2.方法B :样本经高速离心浓缩后核酸释放取20(Γ500 μ I待测样本，13，OOOrpm离心5分钟后吸弃上清，加入20^50 μ I核酸释放剂，静置10分钟后，备用；每个PCR反应管加入上述经预处理的待测样本、NG阴性对照、NG阳性对照及NG定量参考品A D各5 10 μ I ;每个PCR反应管加入PCR_mix4(T45 μ 1，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。三、荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)I)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。2)突光检测通道选择选择FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )检测NG ;选择 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)检测内标；参比突光(PassiveReference)设置为 none。
3)荧光定量PCR反应条件见表1:表I
权利要求
1.一种核酸释放剂在淋球菌NG检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾 2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠 O. 01 2% 和乙醇 O. 05 1%。
2.一种淋球菌NG检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠0. Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探针序列为5’-CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分别为5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ 和 5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。
5.根据权利要求2 4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标序列为 5，-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3，。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且内标探针的序列为5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3，。
7.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和0. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。
8.根据权利要求广4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括NG阳性对照、NG阴性对照和NG定量参考品。
9.一种淋球菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分别为5 ’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3 ’和5， -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3，。
10.一种淋球菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为 5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
全文摘要
本发明提供一种淋球菌(NG)检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测NG的灵敏度可达400copies/ml，检测线性范围为400~4.00E+10copies/ml；应用该试剂盒可以对生殖道分泌物等未知样本中的NG-DNA进行快速准确的检测，为诊断淋球菌感染提供可靠的实验依据。
文档编号G01N21/64GK103060453SQ20131000907
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者戴立忠, 邓中平, 李勃 申请人:湖南圣湘生物科技有限公司