专利名称：一种甘蔗叶的定性鉴别hplc指纹图谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱检测方法，属于中药的分析检测领域。
背景技术：
甘鹿叶是禾本科植物甘鹿Saccharum sinensis Roxb.的叶。甘鹿广泛种植于热带、亚热带地区，我国甘蔗种植蔗区主要分布在广西、广东、台湾、福建及云南等地。甘蔗叶含有氨基酸、多糖和黄酮类等物质，其嫩叶和蔗梢含过氧化物酶等物质，具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗肿瘤等药理作用。国内外对甘蔗叶的研究并不多见，仅提取工艺、药效学筛选等报道。中药成分极其复杂，临床用药强调整体性，测定少数几种有效成分或指标成分，不足以确保药材或制剂质量，应该建立全面反映所含成分的指纹图谱，将更加有效地体现中药成分的整体性和综合作用，从而更好地评价中药的质量。中药指纹图谱作为一种有效的质量控制模式，以其科学的理论依据获得国际上的一致认可。
发明内容
本发明的解决方案是提供一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱检测方法，此方法简单、稳定、可靠、重复性好，可作为甘蔗叶的鉴定方法。本发明一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱的测定包括以下步骤:I供试品溶液的制备:称取样品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，减压浓缩，将浓缩样品上大孔树脂柱，先用IOOml水洗脱洗至无色，然后用100ml70%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩，并甲醇定容至5ml容量瓶，离心，备用。2色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，甲醇-0.1%冰乙酸水溶液为流动相，按以下体积百分比条件进行梯度洗脱:0 5min，20% A，5 15min，20% 28% A, 15 30min，28% 34% A, 30 40min，34% A, 40 45min，34% 42 % A，45 70min，42 % 50 % A，70 95min，50 % 65 % A ;柱温 25°C，检测器为紫外吸收检测器，检测波长320nm,流速1.0ml.mirT1。3测定方法:精密吸取供试品溶液20 μ L，按设定的色谱条件进样，测定，即得。在此条件下获取的甘蔗叶对照指纹图谱见附图1。下面对本分析方法的建立作进一步的描述:I供试品溶液的制备方法考察1.1提取方法的考察根据试验要求比较了超声和回流两种提取方法，结果见附图2、3。从图中可以看出由不同提取方法提取后的甘蔗叶的色谱图的性状及色谱峰的数目基本一致，回流提取2h比超声提取30min提取更加完全(色谱峰强度大)，因此，选用回流提取法进行甘蔗叶中有效成分提取。
1.2样品除杂方法的考察考虑到样品颜色较深，色素较多，因此考察了除杂方法。实验中比较了石油醚萃取和大孔树脂洗脱两种方法，见附图4、5。从图中可以看出石油醚除杂方法处理的甘蔗叶的色谱图基线飘动比较大，小的杂峰比较密集，经过大孔树脂洗脱的甘蔗叶的色谱图基线较为平稳，而且杂峰较少，因此甘蔗叶除杂方法选用样品经大孔树脂洗脱。2色谱条件的选择2.1色谱柱的选择分别采用不同的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在同一台高效液相色谱仪(美国AgilentllOOSeries:四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外吸收检测器)上，取同一甘蔗叶供试品，在相同的色谱条件下进样分析，进样量为20yL，检测色谱图，结果见附图
6、7、8。实验结果表明，除了 AgilentC18(5 μ m, 4.6mmX 250mm)色谱柱外,其他各种品牌的色谱柱均可得到相似的色谱图。其中以AgilentC18(5 μ m, 4.6mmX 250mm)分离效果最好,且稳定性好，故优选的最佳色谱柱为AgilentC18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm)。2.2流动相系统的选择分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液、甲醇-0.2%冰乙酸水溶液系统对甘蔗叶的HPLC色谱图进行了考察。结果见附图9、10、11、12。相同条件下甲醇-水与乙腈-水梯度洗脱，后者色谱图中的色谱峰不但密集而且分离效果不好，故选定用甲醇-水洗脱后，加不同比例的冰乙酸，改善峰型，减少色谱峰的拖尾。结果表明甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液系统的效果最佳，采用该系统各个色谱峰的峰型和分离度均较好，因此选定该系统作为流动相。
2.3检测波长的选择对于指纹图谱，为了能获取更多的化学信息总体概括甘蔗叶的质量，本实验考察7 210nm、230nm、254nm、320nm、360nm 吸收波长下的色谱图，结果见附图 13、14、15、16、17。实验结果表明，检测波长为2IOnm和230nm时基线飘动较大，254nm和360nm色谱峰相对较少，检测波长为320nm所得色谱图不但色谱峰较多，而且各峰的峰型较好，基线较为平稳。因此选择检测波长为320nm。2.4柱温的选择本实验在其他色谱条件相同(流动相、梯度洗脱条件、流速、进样量、检测器参数)的情况下，用同一甘蔗叶供试品溶液，分别考察了不同色谱柱温度(20°C，25°C，30°C，35°C )对供试品的分离度的影响，见附图18、19、20、21。从图谱中可知，当色谱柱温度为25°C时，各色谱峰分离度较好，基线平稳，所以本实验选择色谱柱温度为25°C。2.5流速的选择本实验考察了0.81111/1^11，1.01111/1^11，1.21111/1^11不同流速下的色谱图。结果见附图22、23、24。实验结果表明,0.8ml/min和1.2ml/min分离效果不佳，1.0ml/min分离效果好，且基线平稳，因此流速选择1.0ml/min。3指纹图谱的方法学考察3.1精密度试验取同一甘蔗叶供试品溶液，连续进样6次，检测色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要色谱峰I 14号峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%,表明仪器的精密度良好。3.2重复性试验取同一批的甘蔗叶样品6份，按供试品制备方法来制备并进行检测，考察试验方法的重复性，结果表明所有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于I %和相对峰面积的RSD均小于3%，符合色谱指纹图谱研究的要求。3.3稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h不同时间点进行检测，考察样品溶液的稳定性。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于I %和相对峰面积的RSD均小于3%，样品溶液在24h内基本稳定。经过上述研究，本发明采用如下的色谱条件:色谱柱为AgilentC18(5 μ m,
4.6mmX250mm);流动相为甲醇(A)-0.1%冰乙酸水溶液(B)系统，按以下体积百分比条件进行梯度洗脱:0 5min，20 % A，5 15min，20 % 28 % A，15 30min，28 % 34 % A，30 40min，34 % A，40 45min，34 % 42 % A，45 70min，42 % 50 % A，70 95min，50% 65% A ;柱温25°C ;检测器为紫外吸收检测器，检测波长320nm ;进样量20 μ L ;流速
1.0ml.mirT1。本发明的优点在于:本发明的甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱用于甘蔗叶的质量控制，是把指纹图谱中的14个特征峰看成一个整体，可以更加有效地体现中药成分的整体性和综合作用，从而更好地评价中药的质量。本发明的检测方法具有简单、稳定、可靠、重复性好、易于掌握和操作的特点。
图1是甘蔗叶对照指纹图谱 图2是回流提取色谱图 图3是超声提取色谱图 图4是石油醚萃取除杂色谱图 图5是大孔树脂洗脱除杂色谱图 图 6 是月旭 Ultimate C18 (5um, 4.6mmX 250mm)色谱图 图 7 是依利特 HypersilBDSC18 (5um, 4.6mmX 250mm)色谱图 图 8 是安捷伦 AgilentC18 (5um, 4.6mm X 250mm)色谱图 图9是甲醇-水梯度洗脱色谱图 图10是乙腈-水梯度洗脱色谱图 图11是甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液梯度洗脱色谱图 图12是甲醇-0.2%冰乙酸水溶液梯度洗脱色谱图 图13是检测波长210nm色谱图 图14是检测波长230nm色谱图 图15是检测波长254nm色谱图 图16是检测波长320nm色谱图 图17是检测波长360nm色谱图 图18是柱温20°C色谱图 图19是柱温25°C色谱图 图20是柱温30°C色谱图 图21是柱温35°C色谱图 图22是流速0.8ml.mirT1色谱图 图23是流速1.0ml.mirT1色谱图 图24是流速1.2ml.mirT1色谱图
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在说明本发明，并不构成对本发明的限制。实施例1甘蔗叶供试品溶液的制备及其指纹图谱的测定I甘蔗叶供试品溶液的制备称取样品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，减压浓缩，将浓缩样品上大孔树脂柱，先用IOOml水洗脱洗至无色，然后用100ml70%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩，并甲醇定容至5ml容量瓶，离心，备用。2甘蔗叶的指纹图谱的测定2.1仪器与试剂2.1.1仪器:安捷伦1100高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机(G-1322A)，高压四元梯度泵(G-1311A)，标准自动进样器(G-1313A)，智能化柱温箱(G-1316A)，紫外检测器(G-1314A) ,AgilentllOOseries色谱工作站(美国安捷伦科技公司);LG16_WA高速离心机(北京京立离心机有限公司)；KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP211D电子天平(德国赛多利斯)。2.1.2试剂及药材:甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，甲醇、乙醇(分析纯，国药试剂有限公司)，石油醚(国药试剂有限公司)，冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；甘蔗叶样品采集于广西甘蔗研究所，经广西甘蔗研究所高级农艺师许树宁鉴定为禾本科甘鹿属植物甘鹿(Saccharum officinarum)的叶。2.2分析软件AgilentllOO色谱工作站数据处理系统中药色谱指纹图谱相似度评价系统(药典2004A版)2.3HPLC分析条件:色谱柱为AgilentC18(5 μ m,4.6mmX250mm);流动相为甲醇(A)-0.1 %冰乙酸水溶液(B)系统，按以下体积百分比条件进行梯度洗脱:0 5min，20%A，5 15min，20% 28% A, 15 30min，28% 34% A, 30 40min，34% A, 40 45min，34% 42% A, 45 70min，42% 50% A, 70 95min，50% 65% A ;柱温 25°C ;分析时间95min ;检测器为紫外吸收检测器，检测波长320nm ;进样量20 μ L ;流速1.0ml.mirT1。2.4测定:精密供试品溶液20 μ L，注入高效液相色谱仪测定，即得。
权利要求
1.一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于它是甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法，所述的一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱测定的色谱条件是:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱，柱温25°C，检测器为紫外吸收检测器，检测波长320nm,流速1.0ml.mirT1。
3.根据权利要求2所述的测定条件，其中所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的规格是5 μ m, 4.6mmX 250mm。
4.根据权利要求2所述的测定条件，其中所述的流动相是甲醇(A)-0.1 %冰乙酸水溶液⑶体系，其梯度洗脱的体积百分比条件是O 5min，20% A ;5 15min，20% 28% A ;15 30min，28% 34% A ；30 40min，34% A ；40 45min，34% 42% A ；45 70min，42% 50% A ；70 95min，50% 65% A。
5.根据权利要求1所述的一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法，其供试品溶液的制备及测定方法包括: ①供试品溶液的制备:称取样品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，减压浓缩，将浓缩样品上大孔树脂柱，先用IOOml水洗脱洗至无色，然后用100ml70%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩，并甲醇定容至5ml容量瓶，离心，备用。
②测定方法:精密吸取供试品溶液20μ L，按权力要求2-4项的色谱条件进样，测定，即得。
6.根据权利要求1所述的一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法，所述的HPLC指纹图谱时间总长度为95min。
7.根据权利要求1所述的一种甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法，所述的甘蔗叶HPLC指纹图谱具有14个特征峰。
全文摘要
本发明涉及甘蔗叶的HPLC指纹图谱检测方法。本发明的指纹图谱检测方法包括按一定方法制备供试品溶液，然后在一定的色谱条件下测得指纹图谱。经实验证明，此方法测定的指纹图谱专属性和重复性高，可作为鉴定甘蔗叶的.质量控制方法。
文档编号G01N30/02GK103149282SQ201310014800
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者侯小涛, 邓家刚, 马丽娜 申请人:广西中医药大学