一种裸花紫珠中总酚的含量测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种裸花紫珠中总酚的含量测定方法。本发明采用分光光度法对裸花紫珠中总酚的含量进行测定，有助于对裸花紫珠药材、提取物及其制剂的定量控制。
【专利说明】一种裸花紫珠中总酚的含量测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药领域，具体涉及裸花紫珠中总酚含量测定方法。
【背景技术】
[0002]裸花紫珠iCallicarpa nudiflora Hook, et Am.)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属植物，主产于我国海南、广东、广西，是海南的道地药材，具有收敛、止血、镇痛、消炎等功效。现有上市品种如裸花紫珠片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠栓等制剂，目前多以总黄酮为质量控制标准，《广西植物》2012年11期《七种紫珠属植物水提物中总黄酮、总酚酸及其抗氧化活性的测定》记载了总酚的含量测定方法，但本发明提供的总酚含量测定方法，对提取条件和含量测定方法等方法学考察进一步研究，优化了相关参数，进一步提高了质量标准。
[0003]
【发明内容】
[0004]本发明的目的是建立一种准确、可靠的裸花紫珠药材、提取物中总酚的含量测定方法。
[0005]本发明所述的裸花紫珠中总酚的含量测定方法包括下列步骤:
(1).供试品溶液的制备:
取裸花紫珠药材适量，用醇溶剂或酮溶剂超声提取，提取液离心，以上清液为供试品溶
液；
(2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液置于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线；
(3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量；
(4).药材中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠药材中总酚的含量。
[0006]其中，步骤(1)供试品溶液的制备可优选为:醇溶剂为40-60%的甲醇或乙醇，酮溶剂为40~60%丙酮，超声提取的液料比为120: 1-250:1，离心速率为1000(Tl5000r/min，提取时间0.5^1.5h ;可进一步优选为50%的丙酮超声提取，提取时间为I小时，液料比为250:1，提取液以10000r/min离心，离心I min后，精密量取上清液l_5ml置25ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液。
[0007]本发明所述的一种裸花紫珠提取物中总酚的含量测定方法，包括如下步骤:(1).供试品溶液的制备:
精密称取0.01~0.05g裸花紫珠提取物粉末，置25ml量瓶中，加50%甲醇l(T20ml超声溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液；
(2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液置于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线；
(3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量；
(4).提取物中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠提取物中总酚的含量。
[0008]本发明所述的一种裸花紫珠固体制剂中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤:
(1).供试品溶液的制备: 取裸花紫珠固体制剂，精密称取0.05、.1g内部药物，粉碎，置25ml量瓶中，加50%甲醇l(T20ml超声溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液；
(2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液置于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线；
(3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量；
(4).制剂中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠制剂中总酚的含量。
[0009]本发明所述的一种裸花紫珠液体制剂中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤:
(1).供试品溶液的制备:
精密量取l-5ml裸花紫珠液体制剂，置25ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液；
(2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液置于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线；
(3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量；
(4).制剂中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠制剂中总酚的含量。
[0010]本发明中上述的含量测定方法中所述的显色剂为0.45、.6ml的Folin-酚试液和1.2~2.1mlNa2CO3溶液，反应温度为40~45°C，反应时间为l(Tl5min，显色时间为45~60min，显色温度为2(T30°C，Na2CO3溶液质量浓度为5.0%~7.5% ;显色剂及浓度、用量可进一步优选为0.45ml的Folin-酚试液和1.5ml的质量浓度为7.5%的Na2CO3溶液，反应温度优选为40°C，反应时间优选为lOmin，显色时间优选为45min，显色温度优选为25°C。 [0011]发明人对裸花紫珠药材的提取工艺，裸花紫珠药材、提取物中总酚含量的测定方法进行了最佳反应温度、最佳显色时间、稳定性、重现性、回收率等考察研究，证实本方法具有较好的稳定性和可靠性，进一步提高了裸花紫珠药材以及裸花紫珠制剂的质量控制标准。
[0012]以下是方法学考察的详细说明:
一、含量测定方法方法学研究:
1、裸花紫珠干浸膏的制备:
取IOkg裸花紫珠药材，加水煎煮2次，每次加水80kg，每次2小时，合并两次煎液，过滤，所得滤液上HP-20大孔吸附树脂，树脂柱的径高比为1:8，用6倍柱体积的水洗涤柱体，弃去洗涤液，再用20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇洗脱，各梯度均洗脱至无颜色为止，收集各洗脱液合并，回收甲醇后减压浓缩至相对密度为1.25，冷冻干燥，得裸花紫珠干浸膏。
[0013]最佳测量波长和最佳对照品溶液的选择
分别移取0.1ml的裸花紫珠干浸膏溶解而得的供试品溶液(lmg/ml)及没食子酸(0.lmg/ml)、毛蕊花糖苷(0.168mg/ml)、原儿茶酸(0.184mg/ml)三组对照品溶液，加入0.3mlFolin-酚试液，黑暗条件下放置2min，然后加入2ml7.5%Na2C03溶液，加蒸馏水至5ml，摇匀，40°C水浴IOmin后25°C水浴暗置30min。空白管移取0.1ml相应溶剂置于5ml量瓶中，加入0.3mlFolin-酚试液，黑暗条件下放置2min，然后加入2ml质量浓度为7.5%的Na2CO3溶液，加水至刻度，摇匀，40°C水浴IOmin后25°C水浴暗置30min。用紫外可见分光光度计在400~800nm波长范围内每隔20nm测吸光值，绘制得到波长扫描图(附图1)，确定最佳检测波长和最佳对照品溶液。
[0014]由图1所示，四者均在760nm波长处有最大吸收，故选择760nm为最佳检测波长。此外，没食子酸和干浸膏趋势较一致，且没食子酸对照品较容易获得，故选择没食子酸为总酚检测最佳对照品溶液。
[0015]碳酸钠溶液质量浓度的确定
分别移取21份0.1ml最佳对照品溶液置于5ml量瓶中，分成三组，每组加入0.3mlFolin-酚试液，黑暗条件下放置2min，然后分别加入2ml质量浓度为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%, 20.0% 的 Na2CO3 溶液，加水至刻度，摇匀，40°C 水浴 IOmin 后25°C水浴暗置30min，在最佳检测波长处测量其吸光度，确定Na2CO3溶液的最佳质量浓度。空白管移取0.1ml相应溶剂置于5ml量瓶中，加入0.3mlFolin-酚试液，黑暗条件下放置2min，然后加入2ml质量浓度为7.5%的Na2CO3溶液，加水至刻度，摇匀，40°C水浴IOmin后25 °C水浴暗置30min。
[0016]实验结果见表1:故实验选择Na2CO3溶液质量浓度为7.5%。
[0017]表1碳酸钠溶液质量浓度的考察
【权利要求】
1.一种裸花紫珠中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤: (1).供试品溶液的制备: 取裸花紫珠药材适量，用醇溶剂或酮溶剂超声提取，提取液离心，以上清液为供试品溶液； (2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约10mg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1 mg/ml的对照品储备液；精密移取1 ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线； (3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量； (4).药材中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠药材中总酚的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤(1)中醇溶剂为40-60%的甲醇或乙醇，酮溶剂为40~60%丙酮。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤(1)中超声提取的液料比为120:1~250:1，离心速率为 10000-l5000r/min，提取时间 0.5~1.5h。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤(1)为: 供试品溶液的制备: 裸花紫珠用50%的丙酮超声提取，提取时间为1小时，液料比为250:1，提取液以10000r/min离心，离心1 min后，精密量取上清液l_5ml置25ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液。
5.一种裸花紫珠提取物中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤: (1).供试品溶液的制备: 精密称取0.01-0.05g裸花紫珠提取物粉末，置25ml量瓶中，加50%甲醇10-20ml超声溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液； (2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约10mg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1 mg/ml的对照品储备液；精密移取1 ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液置于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线； (3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量； (4).提取物中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠提取物中总酚的含量。
6.一种裸花紫珠固体制剂中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤: (1).供试品溶液的制备: 取裸花紫珠固体制剂，精密称取0.05、.1g内部药物，粉碎，置25ml量瓶中，加50%甲醇l0~20ml超声溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液； (2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线； (3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量； (4).制剂中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠制剂中总酚的含量。
7.一种裸花紫珠液体制剂中总酚的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤: (1).供试品溶液的制备: 精密量取l_5ml裸花紫珠液体制剂，置25ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，所得滤液制成供试品溶液； (2).标准曲线的制作:精密称取没食子酸约IOmg作为对照品，置10ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为I mg/ml的对照品储备液；精密移取I ml对照品储备液置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液于5ml量瓶中配制成梯度的标准溶液，加入显色剂显色，以50%甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下，分别测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线； (3).样品溶液总酚的含量测定:精密量取0.1ml步骤(1)所述的供试品溶液，加入显色剂显色，相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长下测定吸光度值，根据该吸光度值，由标准曲线得对应的浓度，该浓度值即为供试品溶液总酚的含量； (4).制剂中含量的计算:根据步骤(3)所得的供试品溶液中总酚的含量，换算出裸花紫珠制剂中总酚的含量。
8.根据权利要求1-7任一所述的含量测定方法，其特征在于所述的显色剂为Folin-酚试液、Na2CO3溶液和水。
9.根据权利要求1-7任一所述的含量测定方法，其特征在于，反应温度为4(T45°C，反应时间为l(Tl5min，显色时间为45~60min，显色温度为2(T30°C。
10.根据权利要求1-7任一所述的含量测定方法，其特征在于所述的显色剂为0.45~0.6ml的Folin-酚试液和1.2~2.1mlNa2CO3溶液，所述Na2CO3溶液质量浓度为5.0%~7.5%。
11.根据权利要求1-7任一所述的含量测定方法，其特征在于显色剂为0.45ml的Folin-酚试液和1.5ml的质量浓度为7.5%的Na2CO3溶液，反应时间为lOmin，反应温度为40°C，显色时间为45min，显色温度为25°C。
【文档编号】G01N21/3577GK103926212SQ201310015598
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2013年1月16日
【发明者】李典鹏, 袁莉, 黄胜, 颜小捷, 卢凤来, 潘争红, 谷陟欣, 徐向平, 陈珍贵 申请人:九芝堂股份有限公司