专利名称：一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组抗体，特别涉及一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus, SA)是一种人畜共患病的重要致病菌，是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一。该菌广泛分布于自然界中，包括空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中，尤其食品极易受污染，其引起的食物中毒临床表现主要以恶心、呕吐和腹痛为主，少数病人有腹泻、头痛、头晕、发热、脱水等症状。迄今，世界诸多国家都曾相继报道金黄色葡萄球菌的暴发流行，不但严重危害人类健康，且直接间接经济损失巨大。金黄色葡萄球菌的强致病性主要取决于耐热毒素和相关酶类物质的产生能力，其中葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)作用至关重要。葡萄球菌肠毒素为一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的细胞外毒素，分子量低(22-24KDa)，易溶于水和盐溶液，不受胰蛋白酶影响，可耐受100°C煮沸30min而不被破坏。自从1959年葡萄球菌肠毒素被证实以来，已获得肠毒素类型共21种，根据血清学特征分类，包括早为人类发现和熟知的五种肠毒素SEA, SEB, SEC (C型又可分为C1、C2和C3三亚型)，SED, SEE和毒性休克综合症毒素I (Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1,既SEF),以及近几年相继发现的 SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SE0, SEP, SEQ, SER, SET, SEU 等多种新型肠毒素。研究表明，并非所有的肠毒素都能在食物中毒中起作用，其中以SEA和SED最常见，并以SEA毒力最强，摄入I y g即能引起中毒。虽然已从基因水平对传统及新型肠毒素加以区分，但关于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚无借鉴资料，因此广泛获得不同动物及动物性食品中葡萄球菌株，提纯天然肠毒素蛋白，可为研究葡萄球菌肠毒素检测方法及其功能活性奠定基础，对丰富其认识亦有重要意义。目前，葡萄球菌肠毒素导致食物中毒机制有待于进一步证实，从免疫机制研究，可能与其介导大量细胞因子释放而引起多器官损害有关。与此同时，作为第一个被发现的超抗原，其独特高效的诱导机体免疫机制依旧倍受关注。新生物构建技术与其固有生物特性 的结合，葡萄球菌肠毒素研究及应用前景将更为广阔。现阶段，对于葡萄球菌肠毒素的检测、预防、治疗的方法和手段多基于免疫原理，随着分子生物学的进一步发展，抗体技术也逐步由细胞工程抗体(单克隆抗体)向基因工程抗体演替。基因工程抗体，又被称为第三代抗体，即应用基因工程技术将抗体基因重组并克隆到表达载体上，在宿主中表达并折叠成有功能的抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA后，经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链可变区基因，按特定方式连接克隆到表达载体后，表达、折叠成功能抗体分子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性。该技术既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造，且不受伦理和技术等因素的制约，发展迅速。
单链抗体(Single chain Fv segment, scFv)是基因工程抗体技术重要应用产物，即将重链可变区和轻链可变区基因用寡聚核甘酸连接，经表达、折叠后形成只由重链和轻链可变区构成的新型的小分子抗体，大小仅为完整IgG的1/6，同时抗原结合位点没有发生变化，即保持完整的特异性。该抗体缺失Fe片段，减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同时，降低了免疫变态反应的可能性。另外，其分子量小，有利于穿透肿瘤组织，并避免了传统制备方法中细胞杂交的过程，减少工作量，提高制备成功率。近年来已构建了多种类的表达载体，使单链抗体在真核细胞、原核细胞、噬菌体等表达系统中表达，其表达量、蛋白折叠及糖基化各具特点。通过抗体库展示技术，体外表达重组抗体已显示出广泛的临床应用前景，特别是寄生虫抗原表位、自身免疫疾病、基因治疗、肿瘤印象分析与治疗等方面。基因工程重构抗体技术日趋成熟，但将其应用于葡萄球菌肠毒素抗体的研究，国内外罕有报道，且研究对象仅局限于SEB、SEC等少数传统肠毒素。综述其基本路线为:查找相关IgG抗体的基因序列，分析抗体基因的结构及完整性，利用PCR技术分别扩增其重链可变区和轻链可变区基因序列，再通过LinkeH多采用(Gly4Ser)3)将二者连接，克隆到表达载体后转入表达系统。2009年，Kalinina等建立抗SECl基因重构抗体原核表达体系，但受到表达系统蛋白修饰功能缺乏的制约，其蛋白活性表现受阻，该抗体与SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反应，特异结合能力有待提高；2010年，Pawan等通过PCANTAB5E载体系统制备出特异性强和亲和力高的抗SEB单链抗体，但研究发现该表达系统随时间推移分泌能力逐渐消失，稳定性缺陷突显。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中葡萄球菌肠毒素检测手段上存在的缺陷，提供一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体。本发明的第二个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体的用途。本发明的技术 方案概述如下:一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体的制备方法，包括如下步骤:(I)制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2 ；(2)采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2总mRNA，以oligo(dT) 18为引物,逆转录合成cDNA ；(3)在相对保守的framel区和frame4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2表达的单抗的轻链可变区基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游简并引物，以及重链可变区基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游简并引物；以cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-Tsimple载体，经测序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V (D) J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID N0.2所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.3所示；重链可变区基因为SEQ ID N0.4所示，其编码的多肽为SEQ IDN0.5所示；(4)结合二硫键稳定的重构抗体突变位点设计原则，设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Aba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引A Kozak 序列；(5)经酶切、连接，将步骤(4)获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)，获得pcDNA3.1-Vh过渡载体；另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-1RES序列；同时以步骤(4)获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-1RES序列为模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamH I和Xba I酶切位点的ivs-1RES-'融合基因片断，经酶切、连接，插入所述pcDNA3.1-VhS渡载体，构建真核单启动子共表达重组质粒p2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示；(6)通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体在细胞间接免疫荧光检测中的应用。一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体在流式细胞术检测中的应用。本发明通过构建葡萄球菌肠`毒素单抗轻、重链基因真核共表达载体，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的基因重构抗体。实验证明本发明的葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体可以对葡萄球菌肠毒素进行检测。特别是可以在细胞间接免疫荧光和流式细胞术检测中的应用。本发明中所涉及的葡萄球菌肠毒素为天然的葡萄球菌肠毒素或者通过重组表达获得的肠毒素，该肠毒素优选为葡萄球菌肠毒素A、葡萄球菌肠毒素G、葡萄球菌肠毒素K、葡萄球菌肠毒素O、葡萄球菌肠毒素Q、葡萄球菌肠毒素U型中的一种或多种。
图1:葡萄球菌肠毒素单抗可变区基因克隆的电泳图片；图中A为轻链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNAMarker，1_6为同时制备的杂交瘤细胞267、202、765、5(:12、442、1卩10轻链可变区基因，7为阴性对照，8为空白对照。B为重链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNAMarker, 1-6为同时制备的杂交瘤细胞2G7、2C2、7G5、5C12、4A2、IFlO重链可变区基因片段，
7.阴性对照，8.空白对照。图2:细胞间接免疫荧光(IFA)结果图；图中a-g为SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his 处理组，h 为阴性对照细胞系。图3:流式细胞术(FCM)结果图；图中A为稳定表达细胞系识别天然及重组抗原流式细胞术检测结果为稳定表达细胞系识别不同抗原能力比较。
图4:ELISA应用结果图。
图5:重叠PCR反应程序。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例11.葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2的制备以SEK-GST融合蛋白为免疫抗原，免疫6周龄Balb/c小鼠4次，2周/次:初次免疫采用加入等量弗氏完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为IOOiig/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为IOOil g/只；第三次及终次免疫不加佐剂，采用尾静脉注射，免疫抗原剂量为50 yg/只。处死已结束免疫的Balb/c小鼠，无菌取脾，制备免疫脾脏细胞悬浮液备用。通过PEG法体外融合免疫脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，步骤如下:分别吸取并混匀IX IO8个免疫脾细胞和5 X IO7个SP2/0细胞，1000r/min离心lOmin，弃上清；缓缓加入lmL37°C预温的PEG4000融合剂，作用90s后使用DMEM液终止反应，800r/min离心lOmin，弃上清；加入适量HAT选择培养基，以1000个cell/孔铺于96孔细胞培养板中，每3天更换培养液，持续筛选7d ;阳性细胞通过有限稀释法单克隆后，逐步扩大培养，制备得到葡萄球菌畅毒素单抗杂交瘤细胞2C2。2.单抗杂交瘤轻链重链可变区基因克隆、测序分析及表达载体的构建(I)选取稳定分泌抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞2C2株，采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2的总mRNA，以oligo (dT) 18为引物，逆转录合成cDNA。 (2)分别在抗体轻、重链可变区相对保守的framel区和frame4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2表达的单抗的轻链可变区基因的上游简并引物，用SEQID N0.8所示，下游简并引物，用SEQ ID N0.9所示，以及重链可变区基因的上游简并引物，用SEQ ID N0.10所示，下游简并引物，用SEQ ID N0.11所示；以cDNA为模板，通过PCR扩增获得单抗轻链可变区基因\和单抗重链可变区基因VH。表I轻链、重链可变区基因PCR简并引物
权利要求
1.一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体,是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
2.一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体的制备方法，包括如下步骤: (1)制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2； (2)采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2总mRNA，以oligo(dT)18为引物，逆转录合成cDNA ； (3)在相对保守的framel区和frame4区,设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2表达的单抗的轻链可变区基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游简并引物，以及重链可变区基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游简并引物；以cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-T simple载体，经测序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V (D)J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID N0.2所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.3所示；重链可变区基因为SEQ ID N0.4所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.5所示； (4)结合二硫键稳定的重构抗体突变位点设计原则，设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ IDN0.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列； (5)经酶切、连接，将步骤(4)获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)，获得pcDNA3.1-Vh过渡载体；另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-1RES序列；同时以步骤(4)获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-1RES序列为模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamHI和Xba I酶切位点的ivs_IRES-\融合基因片断，经酶切、连接，插入所述pcDNA3.1-Vh过渡载体，构建真核单启动子共表达重组质粒P2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示； (6)通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。
3.权利要求1的抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。
4.权利要求1的抗体在细胞间接免疫荧光检测中的应用。
5.权利要求1的抗体在流式细胞术检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途，一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本发明的方法通过构建葡萄球菌肠毒素单抗轻、重链基因真核共表达载体，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的基因重构抗体。本发明的葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体可以在葡萄球菌肠毒素检测中的应用，细胞间接免疫荧光检测中的应用和流式细胞术检测中的应用。
文档编号G01N33/577GK103224560SQ201310015929
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者黄金海, 刘鹏翀 申请人:天津大学