专利名称：应用近红外光谱分析技术制备银杏叶提取物的方法
技术领域：
本发明涉及中药提取物生产过程的控制，具体涉及一种应用近红外光谱分析技术制备银杏叶提取物的方法，属于中药制剂技术领域。
背景技术：
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功能。银杏叶中含有天然活性黄酮及苦内酯等与人体健康有益的多种成份，具有溶解胆固醇，扩张血管的作用，对改善脑功能障碍、动脉硬化、高血压、眩晕、耳鸣、头痛、老年痴呆、记忆力减退等有明显效果，对人体的脑循环、心血管系统、中枢神经系统、血液系统等疾病有很好疗效。大量的药理实验结果显示，在多种化学活性成分中，酮类和萜内酯是银杏叶发挥独特药理活性的有效成分，对如何安全、有效地从银杏叶中提取这两类化合物，以及如何快速、准确的测定银杏叶或银杏叶提取物(GBE)中的黄酮类或萜内脂类化合物的含量成为多年来科研工作者研究的热点。银杏总黄酮和总内酯的常规分析方法为高效液相色谱法(HPLC)，HPLC方法定量精确、重现性好，但分析耗时较长，运行和维护成本较高，需大量消耗化学试剂，难以满足生产大批量分析和即时控制的需求。近红外光谱技术是近年来快速发展的一种新型光谱分析技术，具有快速、准确、无污染及非破坏性等优点。应用近红外光谱技术同时测定银杏提取液中总黄酮和总内酯含量的方法也已有报道，但尚未有应用于银杏提取过程的中间控制和大批量产品的检测。现在国内银杏叶提取物生产方法，按照药典方法:采用一定浓度乙醇提取，浓缩，上大孔树脂吸附分离，洗脱，收集洗脱液，干燥即得银杏叶提取物。在银杏叶生产过程中，大孔树脂吸附分离为生产过程中最重要的工序，在目前的生产方法中通过人为判断洗脱液的颜色深浅或通过显色剂变色判断收集的起点与终点，此类判断方式，无法准确有效判断，存在滞后性，操作不便，对人的依赖性较强，容易造成由于人的疏忽或判断失误，造成物料损失及成本增大。发明的内容为了进一步稳定与提高银杏叶提取物生产过程质量，克服生产过程无法在线控制其质量缺陷，本发明通过对银杏叶吸附解析过程主要有效成分黄酮与内酯的现场连续取样及实验室定量检测，建立主要成分近红外在线模型。通过在线模型预测实际银杏叶洗脱液的收集起点与终点，制备出符合要求的银杏叶提取物。本发明的技术方案为:应用近红外光谱分析技术制备银杏叶提取物的方法依次包括以下步骤:银杏叶粉碎、提取、浓缩、大孔树脂柱分离纯化、收集洗脱液、浓缩、干燥；(解析溶剂使用乙醇)；其特征在于，通过在对大孔树脂分离纯化过程中进行取样时，用近红外光谱建立模型，控制乙醇解析过程中有效成分收集的起点与终点，具体包括下述步骤:a样品的准备
正常生产时，在大孔树脂柱层析工序中采集样品，样品采集多个，每两个采集时间间隔固定；b.银杏叶黄酮含量的检测对步骤a所采集样品中的银杏黄酮和内酯一一利用HPLC法进行准确的含量测定;银杏黄酮HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:甲醇:0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;进样量:10μ L ;检测波长:360nm ；银杏内酯HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:正丙醇:四氢呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;进样量:10yL ;检测波长:360nm ；银杏黄酮含量的变化如图1(a)，银杏内酯含量变化如图1(b)，可见在乙醇洗脱的过程中银杏黄酮和银杏内酯均呈现明显的先升高后下降的规律；c..建立模型Cl.光谱预处理由于洗脱液体系中主要部分是水和乙醇；而乙醇和水在近红外区内均有一定吸收；考虑到洗脱液中水和乙醇的组成比例在不断改变，为获得良好的光谱数据，应在稳定的实验条件下进行光谱扫描，扫描模式设为“Ratio mode”，因为这种方式可以有效地扣除背景变化带来的影响；Ratio mode模式为双光路双检测器的测样方式，每次扫描样品的光谱的同时进行光谱背景的检测，并自动进行光谱背景剔除，因此，所采集样品的光谱背景的针对性很强，能够得到大量对检测分析有利的有效信息，避免背景变化对光谱的影响；c2.获取近红外光谱使用近红外光谱仪的扫描软件对样品进行光谱采集；操作时，将仪器的液体探头插入烧杯中的溶液中，使液体完全覆盖探头的测样口，采用透射的方式对样品进行扫描 '为保证采集光谱的代表性，每个批次的样品采集光谱时，在试剂瓶中3个不同位各采集I张光谱；采用透射的测样方式，每一张光谱都是100次扫描的平均结果；波长范围从1100nm到2300 nm，波长增量为2.0 nm ;光谱数据为比率模式下采集；c3模型的创建将红外光谱采集的数据导入定量分析软件，利用HPLC法检测得到的含量数据和光谱数据一一对应，创建模型；所有样品都是在正常生产过程中在线取样，银杏黄酮和银杏内酯分别随机挑选几个样品不参与建模，作为验证集，其他的样品建立数学模型；将经过预处理后的光谱数据与样品含量数据关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉一验证法(cross-validation),用The Unscrambler定量分析软件建立模型；光谱和化学值异常值(outlier)分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这两个统计量来检验剔除；经过异常值的剔除进行逐步优化，得到理想的校正模型；实验证明样品成分含量模型的线性关系非常明显，其黄酮模型相关性为0.9888，内酯的为0.9521 ;这充分说黄酮、内酯具有明显的近红外活性，能够产生明显的近红外吸收，所以含量和光谱图之间呈现出良好的线性关系；d.模型验证利用建立好的样品数学模型对预测样品进行预测验证，算出预测偏差；实验证明黄酮含量的绝对偏差为0.021，内酯含量的绝对偏差为0.033 ；所以近红外光谱仪利用光谱数据和校正模型完全能够有效预测黄酮的含量指标；从模型的相关性以及预测偏差，充分说明了近红外技术可以应用于银杏叶提取物大生产过程中的监控；e.结果分析从采集的样品看在乙醇洗脱的过程中无论是银杏黄酮还是银杏内酯均呈现含量先升高后下降的规律，而且此规律可以通过近红外检测到；将银杏黄酮含量突然升高的点判定为以银杏黄酮作为参考参数时的收集起点，下降至平稳水平的点判定为以银杏黄酮作为参考参数时的收集终点；将银杏内酯含量突然升高的点判定为以银杏内酯作为参考参数时的收集起点，下降至平稳水平的点判定为以银杏内酯作为参考参数时的收集终点，结合两者的变化情况判断银杏提取物一乙醇洗脱过程中的收集起点和终点，主要以考虑银杏黄酮的含量变化为主；所以利用近红外光谱分析技术完全可以实现对银杏提取物大生产过程时柱层析工序中乙醇解析的起点和终点判断。本发明的一种利用近红外光谱判断大孔树脂分离纯化银杏提取物时，收集有效成分的起点与终点，并制备出符合标准的银杏叶提取物的方法。本发明应用近红外光谱技术，测定银杏叶提取物生产过程中有效成分含量的含量，不仅大大提高了分析效率，节约了分析成本，还可以有效地对中间环节进行监控，保证生产过程安全、有序、可靠的进行。本发明的优点:近红外光谱技术是近年来快速发展的一种新型光谱分析技术，快速、准确、无污染及非破坏性。应用近红外光谱分析技术对银杏叶中黄酮含量进行测定方法简单，速度快，样品无需处理，只需扫描出图谱，然后调用样品模型对待测成分含量进行预测即可。只要样品化学测定方法的精度高，那么该方法的预测值精度就高，逼近真值。最关键的是近红外在大生产过程中可以直接测得银杏黄酮和银杏内酯的含量，可以实现银杏提取过程即时分析和在线控制。
图1 (a).黄酮含量(mg/ml)的曲线图；图1(b).内酯含量(mg/ml)的曲线图；图2.样品原始光谱图；图3.黄酮含量的PLSI模型；图4.内酯含量的PLSI模型。具体实施方法实例I1.样品准备:正常生产时，在大孔树脂柱层析工序中采集样品，样品采集多个，每两个采集时间间隔固定。共采集65个样品。2.银杏叶黄酮含量的检测对步骤I所采集样品中的银杏黄酮和内酯一一利用HPLC法进行准确的含量测定。银杏黄酮HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:甲醇:0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;进样量=IOyL ;检测波长:360nm。银杏内酯HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:正丙醇:四氢呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;进样量:10yL ;检测波长:360nm。HPLC检测结果见表1.
表1.样品数据表
权利要求
1.一种应用近红外光谱分析技术制备银杏叶提取物的方法依次包括以下步骤:银杏叶粉碎、提取、浓缩、大孔树脂柱分离纯化、收集洗脱液、浓缩、干燥；(解析溶剂使用乙醇)；其特征在于，通过在对大孔树脂分离纯化过程中进行取样时，用近红外光谱建立模型，控制乙醇解析过程中有效成分收集的起点与终点，具体包括下述步骤: a.样品的准备 正常生产时，在大孔树脂柱层析工序中采集样品，样品采集多个，每两个采集时间间隔固定； b.银杏叶黄酮含量的检测 对步骤a所采集样品中的银杏黄酮和内酯一一利用HPLC法进行准确的含量测定； 银杏黄酮HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:甲醇:.0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;进样量:10μ L ;检测波长:360nm ； 银杏内酯HPLC检测的色谱条件:色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相:正丙醇:四氢呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;进样量:10 μ L ;检测波长:360nm ； c..建立模型 Cl.光谱预处理 在稳定的实验条件下进行光谱扫描，扫描模式设为“Ratio mode”，每次扫描样品的光谱的同时进行光谱背景的检测，并自动进行光谱背景剔除；c2.获取近红外光谱使用近红外光谱仪的扫描软件对样品进行光谱采集；操作时，将仪器的液体探头插入烧杯中的溶液中，使液体完全覆盖探头的测样口，采用透射的方式对样品进行扫描；为保证采集光谱的代表性，每个批次的样品采集光谱时，在试剂瓶中3个不同位各采集I张光谱；采用透射的测样方式，每一张光谱都是100次扫描的平均结果；波长范围从1100 nm到.2300 nm，波长增量为2.0 nm ;光谱数据为比率模式下采集；c3模型的创建 将红外光谱采集的数据导入定量分析软件，利用HPLC法检测得到的含量数据和光谱数据一一对应，创建模型；所有样品都是在正常生产过程中在线取样，银杏黄酮和银杏内酯分别随机挑选几个样品不参与建模，作为验证集，其他的样品建立数学模型； 将经过预处理后的光谱数据与样品含量数据关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉一验证法(cross-validation),用The Unscrambler定量分析软件建立模型；光谱和化学值异常值(outlier)分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这两个统计量来检验剔除；经过异常值的剔除进行逐步优化，得到理想的校正模型； d.模型验证 利用建立好的样品数学模型对预测样品进行预测验证，算出预测偏差； e.结果分析 将银杏黄酮含量突然升高的点判定为以银杏黄酮作为参考参数时的收集起点，下降至平稳水平的点判定为以银杏黄酮作为参考参数时的收集终点；将银杏内酯含量突然升高的点判定为以银杏内酯作为参考参数时的收集起点，下降至平稳水平的点判定为以银杏内酯作为参考参数时的收集终点，结合两者的变化情况判断银杏提取物一乙醇洗脱过程中的收集起点和终点，主要以考虑银杏黄酮的含量变化为主。
全文摘要
应用近红外光谱分析技术制备银杏叶提取物的方法，通过在对大孔树脂分离纯化过程中进行取样时，用近红外光谱建立模型，控制乙醇解析过程中有效成分收集的起点与终点,具体包括下述步骤a样品的准备、b.银杏叶黄酮含量的检测、c.建立模型光谱预处理、获取近红外光谱、模型的创建d.模型验证,e.结果分析，主要以考虑银杏黄酮的含量变化为主；本发明测定方法简单，速度快，样品无需处理，只需扫描出图谱，然后调用样品模型对待测成分含量进行预测即可，可以实现银杏提取过程即时分析和在线控制。
文档编号G01N21/35GK103115892SQ20131002533
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者王如伟, 叶剑锋, 姚德中, 姚建标, 苏一多, 钱笑芳 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司