一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
【专利摘要】本发明属蛋白质分析领域，涉及富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具体涉及一种利用氨基修饰的磁性纳米材料同时选择性富集磷酸化肽和糖基化肽的新方法。本发明通过一锅法合成了氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4@NH2，利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之间的螯合作用以及材料表面带正电的氨基和带负电的磷酸肽之间的静电作用，实现磷酸化肽段的选择性富集；利用磁性纳米材料表面氨基的亲水性实现糖肽的选择性富集；进一步实现磷酸化肽段和糖基化肽段的同时富集和质谱分析。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现磷酸化肽和糖基化肽的同时高灵敏质谱分析。
【专利说明】一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
【技术领域】
[0001]本发明属蛋白质分析领域，涉及富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具体涉及一种利用氨基修饰的磁性纳米材料同时选择性富集磷酸化肽和糖基化肽的新方法。
【背景技术】
[0002]研究公开了磷酸化和糖基化是生物体内组普遍存在的两种翻译后修饰，它们执行着重要的生物学功能，如，蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节，对若干生物的细胞功能起开关调控作用，是一种普遍的重要调节机制。而糖基化修饰在各种生命现象中起着重要的作用，如，参与细胞黏附及信号转导，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。研究报道，约有生物体内约1/3以上的蛋白质会发生磷酸化，而1/2以上的蛋白质会发生糖基化，研究显示若干蛋白质则同时具有磷酸化修饰和糖基化修饰。高灵敏地鉴定生物体内这些后修饰位点是实现进一步研究的首要前提。然而，所述的研究均面临着类似的困难。首先，含有上述两种翻译后修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度却通常较低，并且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有2-5%左右的肽段带有磷酸化或糖基化修饰；第二，带有磷酸化和糖基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率往往比非修饰肽段低，因而不易被质谱鉴定；第三，尽管已经有较多的方法实现了磷酸化肽和糖基化肽的富集，但这样的富集是对磷酸化和糖基化肽分别进行的，导致在传统的研究中往往只能单一地研究磷酸化肽或者糖基化肽，这对于同时携带这两种修饰的蛋白质的研究是很大的缺陷。因此，发展磷酸化肽和糖基化肽同时富集的方法，将有利于研究两种修饰同时存在的情况，实现它们的高灵敏质谱鉴定。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种步骤简单、操作方便、快速高效，同时实现磷酸化肽和糖基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的新方法，具体涉及一种利用氨基修饰的磁性纳米材料同时选择性富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0005]1.合成氨基修饰的磁性纳米材料；
[0006]2.首先对其中的磷酸化肽段进行富集；
[0007]3.收集经磷酸化富集后的肽段溶液，再次进行糖基化肽富集；
[0008]4.最后将磷酸化肽和糖基化肽从磁性纳米材上洗脱下来送入质谱分析。
[0009]具体地，本发明通过一锅法合成了氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4ONH2，利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之间的螯合作用以及材料表面带正电的氨基和带负电的磷酸肽之间的静电作用，实现磷酸化肽段的选择性富集；利用磁性纳米材料表面氨基的亲水性实现糖肽的选择性富集；进一步实现磷酸化肽段和糖基化肽段的同时富集和质谱分析。
[0010]更具体的，本发明的一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基修饰的磁性纳米材料为吸附剂，利用氨基修饰的磁性纳米材料和磷酸化肽之间的螯合作用以及材料表面带正电的氨基和带负电的磷酸肽之间的静电作用，实现磷酸化肽段的选择性富集，本发明的实施例中，选用氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4ONH2,利用磁性纳米材料表面氨基的亲水性实现糖肽的选择性富集，进一步实现磷酸化肽和糖基化肽的同时富集和质谱分析，其包括步骤:
[0011](I)在多肽样品中，加入氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4ONH2材料与多肽溶液混合；
[0012](2)外加磁场，使磁性材料和溶液分离，分别收集上清液和收集下层固体相；
[0013](3)收集下层固体相，清洗材料，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开,收集材料，用含有5%氨水的水溶液再混匀材料；外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析；
[0014](4)在步骤(2)获得的上清液中加入一定体积的碳酸氢铵溶液，使pH呈中性；再往其中加入氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4ONH2材料与多肽溶液混合使样品中的糖基化肽充分吸附，外加磁场，使磁性材料和溶液分离，收集下层固体相。清洗材料，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；
[0015](5)用含有三氟乙酸的水溶液再混匀材料。外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。
[0016]本发明中，氨基修饰的磁性纳米材料按下述步骤以1，6-己二胺为稳定剂水热一锅法合成:将2.0-4.0克六水合三氯化铁、4.0-8.0克无水醋酸钠和3.6-7.2克的1，6-己二胺溶解在30毫升乙二醇中，在室温下机械搅拌0.5-2小时，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于180-220°C的烘箱中6-12小时，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁分离分离出产物磁簇，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中，备用。
[0017]本发明中，氨基修饰磁性纳米材料的尺寸为50_200nm，本发明的实施例中，选用氨基修饰的磁性纳米材料Fe3O4ONH2材料，在多肽样品中，加入5-25毫克的Fe3O4ONH2材料与多肽的溶液在25 - 37摄氏度下混合3-5分钟，以使样品中的磷酸化肽充分吸附；多肽样品浓度为0.5ng/uL?IOng/ μ L，体积为50 μ L?ImL ;所述的多肽样品溶于含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液中。
[0018]本发明中，对于步骤(2)中得到的下层固体相，用50yL— ImL含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液清洗材料1-3次，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料,用5 μ L含有5%氨水的水溶液重新混匀材料,使磷酸化肽充分从材料上解离,外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质含有1%磷酸的2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析；
[0019]在获得的上清液中加入碳酸氢铵溶液，使pH处于6.5-7.5，且保证加入碳酸氢铵后，溶液终浓度中乙腈的体积分数含量不低于70% ；
[0020]再往所获得的溶液中，加入5-25毫克的Fe3O4ONH2材料与多肽溶液在25 — 37摄氏度下混合3-5分钟，使样品中的糖基化肽充分吸附，外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相，用70%乙腈的水溶液清洗材料1-3次，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；
[0021 ] 本发明步骤(5 )中，用5 μ L含有5%三氟乙酸的水溶液再混匀材料使糖基化肽从材料上解离，外加磁场再次将材料从上清液中分离后，，取上清液与有机基质α -氰基-4-羟基肉桂酸(a -CHCA)混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。本发明的优点在于:
[0022]本发明使用的功能化介孔纳米材料，其材料尺寸在50_200nm范围内较为合适，采用一锅法将氨基修饰于材料表面。本发明选用的氨基修饰的磁性纳米材料，以氨基为修饰基团。首先在含乙腈的酸性溶液中对磷酸化肽段进行富集，可以利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之间的螯合作用以及材料表面带正电的氨基和带负电的磷酸肽之间的静电作用，实现磷酸化肽段在材料上的选择性富集，富集后分别收集富集有磷酸化肽的磁性纳米材料和上清溶液，对富集有磷酸化肽的磁性纳米材料进行洗脱，可实现磷酸化肽段的高灵敏分析。另将经过磷酸化肽富集后的上清溶液用碳酸氢铵调至中性后，再次向其中加入氨基修饰的磁性纳米材料，利用磁性纳米材料表面氨基的亲水性可以实现糖肽在材料上的选择性富集，富集后用酸性的洗脱液将糖基化肽从磁性纳米材上洗脱下来，可实现糖基化肽的高灵敏分析。因而，在一次实验中可以同时实现磷酸化肽和糖基化肽的同时高灵敏质谱分析。本发明选用的氨基修饰的磁性纳米材料，以具有磁性的Fe3O4为核心，具有高的磁响应性。可以利用外加磁场的方式将材料从溶液中分离出来，免去传统离心分离方法耗时长等缺点。本发明具有步骤简单、操作方便、快速高效等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本富集方法的流程图。
[0024]图2为lng/μ L标准磷酸化蛋白质beta-酪蛋白酶解肽段的MALD1-T0F-MS谱图，MALD1-T0F-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity)，横坐标为质荷比(m/z)；(a)是富集前，(b)从体积为100 μ L的样品溶液富集后得到的；*为磷酸化肽段的单电荷峰，&为磷酸化肽的双电荷峰；对比图(a)和图(b)可以看出，经过富集后，磷酸化肽可以被选择性的富集下来。
[0025]图3为Ing/ μ L标准糖蛋白质辣根过氧化物酶的酶解肽段的MALD1-TOF-MS谱图，MALD1-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z)。
(a)是富集前，(b)从体积为100μ L的样品溶液富集后得到的;#为糖基化肽段的单电荷峰，@为糖基化肽段的双电荷峰；对比图(a)和图(b)可以看出，经过富集后，糖基化肽可以被选择性的富集下来。
[0026]图4为5ng/yL以质量比为1:1的标准磷酸化蛋白质beta-酪蛋白酶解肽段和标准糖蛋白质辣根过氧化物酶的酶解肽段的MALD1-T0F-MS谱图，MALD1-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z) ； (a)是未富集得到的；
(b)是经磷酸化肽富集后得到的；(C)是收集磷酸化肽富集后的上清再次富集糖基化肽得到的；*为磷酸化肽段的单电荷峰，&为磷酸化肽的双电荷峰。#为糖基化肽段的单电荷峰，@为糖基化肽段的双电荷峰；对比图(a)和图(b) (C)可以看出，经过富集后，磷酸化肽和糖基化肽均可以被选择性的富集下来，实现；同时富集和质谱鉴定。
【具体实施方式】
[0027]下面的实例是对本发明提出的一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析方法的进一步说明。[0028]实施例1
[0029]氨基修饰磁性纳米材料对磷酸化肽选择性富集能力的试验
[0030]配制100 μ Llng/μ L级别的磷酸化蛋白质beta-酪蛋白酶解肽段混合物(溶于含有三氟乙酸的乙腈水溶液中)，将氨基修饰的磁性纳米材料在上述溶液中孵育3-5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来。弃除上清液，然后取5 μ L5%氨水的水溶液重新混匀固体相，摇晃5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有磷酸化肽段的溶液)I μ L点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的2，5- 二羟基苯甲酸基质溶液(1%磷酸50%乙腈水溶液)，干燥结晶后进行MALD1-T0F/MS分析，结果如图2所示。
[0031]实施例2
[0032]氨基修饰磁性纳米材料对糖基化肽选择性富集能力的试验
[0033]配制100 μ Llng/μ L级别标准糖蛋白质辣根过氧化物酶酶解肽段(溶于含有碳酸氢铵的乙腈水溶液中)，将氨基修饰的磁性纳米材料在上述溶液中孵育3-5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来。弃除上清液，然后取5 μ L5%三氟乙酸的水溶液重新混匀固体相，摇晃5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有糖基化肽段的溶液)I μ L点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液(0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液)，干燥结晶后进行MALD1-T0F/MS分析，结果如图3所示。
[0034]实施例3
[0035]氨基修饰磁性纳米材料同时选择性富集磷酸化和糖基化肽能力的试验
[0036]配制100μ L5ng/y L级别的磷酸化蛋白质beta-酪蛋白酶解肽段，标准糖蛋白质辣根过氧化物酶酶解肽段的混合物(溶于含有三氟乙酸的乙腈水溶液中)，将氨基修饰的磁性纳米材料在上述溶液中孵育3-5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，同时收集上清液。然后，一方面取5 μ L5%氨水的水溶液重新混匀固体相，摇晃5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有磷酸化肽段的溶液)I μ L点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的2，5- 二羟基苯甲酸基质溶液(1%磷酸50%乙腈水溶液)，干燥结晶后进行MALD1-T0F/MS分析；另一方面将收集到的完成磷酸化肽富集后的上清溶液，向其中加入碳酸氢铵溶液，使溶液PH呈中性。然后将氨基修饰的磁性纳米材料在上述溶液中孵育3-5分钟后，在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来。取5μ L5%三氟乙酸的水溶液重新混匀固体相,摇晃5分钟后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有糖基化肽段的溶液)I μ L点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α -氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液(0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液)，干燥结晶后进行MALD1-T0F/MS分析，结果如图4所示。
【权利要求】
1.一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基修饰的磁性纳米材料为吸附剂，实现磷酸化肽段的选择性富集和糖基化肽的选择性富集后，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析；其包括步骤: (1)在多肽样品中，加入氨基修饰的磁性纳米材料与多肽溶液混合； (2)外加磁场，使磁性材料和溶液分离，分别收集上清液和收集下层固体相； (3)收集下层固体相，清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料，用含有5%氨水的水溶液再混匀材料；外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析； (4 )在步骤(2 )获得的上清液中加入碳酸氢铵溶液，使pH呈中性；再加入氨基修饰的磁性纳米材料与多肽溶液混合使样品中的糖基化肽充分吸附，外加磁场，使磁性材料和溶液分离，收集下层固体相。清洗材料，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料； (5)用含有三氟乙酸的水溶液再混匀材料。外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。
2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)的多肽样品浓度为0.5ng/uL^lOng/ μ L,体积为 50 μ L~ImL。
3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)的多肽样品溶于含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液中。
4.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的氨基修饰磁性纳米材料的尺寸为 50_200nm。
5.按权利要求1或4所述的方法，其特征是，所述步骤(1)或(4)中的氨基修饰的磁性纳米材料为Fe3O4ONH2材料；其加入量为5-25毫克。
6.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的氨基修饰磁性纳米材料以I,6-己二胺为稳定剂水热一锅法合成。
7.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(1)中氨基修饰磁性纳米材料进行样品富集的温度是25 - 37摄氏度，样品富集的时间是3 - 5分钟。
8.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(3)中用50μL — ImL含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液清洗材料1-3次。
9.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(3)中用5μL含有5%氨水的水溶液再混匀材料使磷酸化肽充分从材料上解离；
10.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(4)中补加的碳酸氢铵溶液使溶液pH呈6.5-7.5，加入碳酸氢铵水溶液后，溶液终浓度中乙腈的体积分数含量不低于70%。
11.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(5)中用50μL — lmL70%乙腈水溶液清洗材料1-3次。
12.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(6)中用5μ L含有5%三氟乙酸的水溶液再混匀材料使糖基化肽从材料上解离。
【文档编号】G01N27/62GK103940894SQ201310025887
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】陆豪杰, 张莹, 杨芃原 申请人:复旦大学