一种基于Fe₃O₄纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法

专利名称：一种基于Fe₃O₄纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种致病菌的快速检测方，尤其涉及一种基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法。
背景技术：
基本原理:单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤:1.利用Fe3O4磁珠，包被一层高分子化合物，经过修饰后后采用适当的偶联剂将待检目标菌的单克隆抗体偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠，并封闭多余活性位点。2.将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。3.将制备的特异性免疫磁珠用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的磁珠和没有结合目标菌的磁珠还是混在一起。4.将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的磁珠洗脱，如不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉。5.再采用洗脱剂将固相载体上结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，用外加磁场将这部分磁珠分离，清洗掉离子、溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。6.加入硝酸和硫酸进行硝化反应，这部分磁珠如果存在，则Fe3O4转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准中致病菌都是不得检出的。通过检测是否存在铁离子就可以检测出样本中是否存在目标菌。通过加标，在一定范围内可以定量检测目标菌。该方法中Fe3O4磁珠既是分离富集的手段，同时也是定量检测的载体，起了一个信号放大的作用。该方法的主要优点就是快速、灵敏度相对较高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，检出的阳性样还需用微生物培养进行确证。目前，国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集、目标物的富集等的报道还是很多的，但没有采用检验铁离子的方法做进一步的检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于Fe3O4纳米材料的免疫磁分离食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价，该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。—种基于Fe3O4的纳米免疫磁分离快速检测出食品中的有害致病菌的方法，通过分离捕获的免疫磁珠，使其转化为铁离子，提出铁离子与目标菌的相关性指标，通过检测铁离子来间接定量目标菌。不同的致病菌检出下限不同。该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离。采用偶联了特异性单克隆抗体的免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集；通过设计双抗夹心分离捕获到目标菌的磁珠，再将磁珠硝化反应转化为三价铁离子和二价铁离子。采用邻二氮菲吸光光度法、硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。通过定量分析捕获目标菌的磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。本发明是这样实现的，步骤如下:
1)检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；
2)将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体表面；
3)免疫磁珠富集目标菌株，并分离:将第I步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬池液；
4)将富集的磁珠悬浊液加到第2步制作的固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；
5)之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法分离磁珠，用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠，这部分磁珠就是抓到目标菌的磁珠；
6)加入硝酸和硫酸进行硝化反应，这部分磁珠如果存在，则被反应转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，此时若检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。采用邻二氮菲吸光光度法、硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。所述NMR纳米免疫磁珠核材Fe3O4材料，纳米粒径小于1000纳米，包被材料为葡聚糖、壳聚糖等能被硝化有机高分子。所述的目标菌的最终检出评价方法是基于是否检出铁离子及铁离子的浓度。本发明的有益效果:本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是通过检验铁离子间接检出目标致病菌。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。一定程度上可以定量检测。
具体实施例方式实例I
检测食品样本中测定其是否含有有害致病菌一李斯特菌。1.免疫磁珠制备:磁珠与单克隆抗体的偶联。采用奥润公司商品化的羧基化磁珠PM3-020 (180nm),或采用微乳液法自行制备Fe3O4纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。单克隆抗体采用生物试剂公司购买的商品李斯特菌单克隆抗体，或自行制备单克隆抗体并分离纯化。以羧基化磁珠为例，偶联步骤:①清洗:分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL磷酸缓冲液(PB)0.02M，pH=6.0洗2次，洗涤后用2mL水吗啉乙磺酸(MES) 0.05M, pH=6.0重悬；②活化:超声使磁珠分散，再分别加入Img碳二亚胺(EDC)，ImgN-羟基琥珀酰亚胺(NHSS)(用0.05M, pH=6.0 MES溶解)，25°C活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态 ’③偶联:磁分离，吸去上清，2mL PB (0.02M,pH=7.4)洗涤一次并转移至新的离心管，3mL磷酸盐缓冲液(PBS) 0.02M, pH=7.4重悬，超声使磁珠分散。再分别将275 μ g抗体加入到已活化磁珠中，25°C偶联3h,旋转仪15r/min保持悬浮状态；(D封闭:磁分离,取出上清(上清中的蛋白含量用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，测算偶联量)，加入lmg/mL乙醇胺及lmg/mL牛血清白蛋白(BSA)封闭(0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性)，25°C封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存:0.0lM PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL pH7.4 PB (0.02M,0.02% NaN3，0.5%BSA)重悬，存于4°C。制备的免疫磁珠备用。2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入李斯特菌单克隆单抗，即将100 100 Iig mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。3.将食品样本进行预处理，得到待检液体样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量无菌的去离子水得到磁珠的悬浊液。此时，如果待检样本中有目标李斯特菌，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，反应一段时间则磁珠乳液中结合了李斯特菌的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了李斯特菌的磁珠。4.用洗脱液(甲醇等)将固定板上的结合了李斯特菌的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。加入硝酸和硫酸进行硝化反应，如果存在磁珠，则反应使之转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。加入还原剂盐酸羟胺使三价铁离子全部转化为二价铁离子，采用邻二氮菲吸光光度法可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。
具体实施例方式实例2
测定食品样品是否含有有害致病菌大肠杆菌0157:H7。 1.免疫磁珠制备:磁珠与单克隆抗体的偶联。采用采用奥润公司商品化的羧基化磁珠PM3-020( 180nm),或采用微乳液法自行制备Fe3O4纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。单克隆抗体采用商品的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，或自行制备单克隆抗体并分离纯化。以羧基化磁珠为例，偶联步骤:①清洗:分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL PB (0.02Μ，ρΗ=6.0)洗 2 次，洗涤后用 2mL MES (0.05M，ρΗ=6.0)重悬；②活化:超声使磁珠分散，再分别加入Img EDC, Img NHSS (用0.05M, pH=6.0 MES溶解)，25°C活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；③偶联:磁分离，吸去上清，2mL PB (0.02M, pH=7.4)洗涤一次并转移至新的离心管，3mL PB (0.02M，pH=7.4)重悬，超声使磁珠分散。再分别将275 μ g单克隆抗体加入到已活化磁珠中，25°C偶联3h,旋转仪15r/min保持悬浮状态！④封闭:磁分离，取出上清(上清中的蛋白含量待检)，加入lmg/mL乙醇胺及lmg/mL BSA封闭(0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性)，25°C封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存:0.0lM PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL ρΗ7.4 PB (0.02Μ，0.02% NaN3,
0.5%BSA)重悬，存于4°C。制备的免疫磁珠备用。2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入0157:H7单克隆抗体，即将100 μ-L 100 Pg'mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min, M
成如下结构。加入牛血清蛋白将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。3.将食品样本进行预处理，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此时，如果待检样本中有目标大肠杆菌0157:H7，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，则磁珠悬池液中结合了大肠杆菌0157:H7的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将未结合大肠杆菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了大肠杆菌0157:H7的磁珠。4.用洗脱液(甲醇等)将固定板上的结合了 0157:H7的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。加入硝酸和硫酸进行硝化反应，如果存在磁珠，则反应使之转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。加入还原剂盐酸羟胺使三价铁离子全部转化为二价铁离子，采用邻二氮菲吸光光度法可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。
权利要求
1.一种基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，其特征步骤如下: 1)检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备； 2)将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体上； 3)免疫磁珠富集目标菌株并分离:将第I步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬池液； 4)将富集的磁珠悬浊液加到固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉； 5)之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法分离磁珠，用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠，这部分就是抓到目标菌的磁珠； 6)这部分磁珠，加入分析纯的硝酸和硫酸进行硝化反应，使磁珠Fe3O4转变为三价铁离子和二价铁离子，采用邻二氮菲吸光光度法、硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。
2.根据权利要求1所述的基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述免疫磁珠为Fe3O4材料，表面修饰为葡聚糖、壳聚糖等可被硝化反应的有机高分子，纳米磁珠粒径小于1000纳米。
3.根据权利要求1所述的基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述的目标菌最终检出评价方法是通过分析捕获目标菌的磁珠Fe3O4的量，间接计算目标菌的量。
4.根据权利要求1所述的基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，其特征是通过硝化反应，将捕获目标菌的磁珠转化成铁离子，通过检测出铁离子的量来定量磁珠量并间接定量目标菌。
全文摘要
一种基于Fe3O4纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品液体样本中致病菌的快速筛选方法，利用Fe3O4纳米材料制备的免疫磁珠针对性地富集目标菌株，通过分离捕获了目标菌的纳米磁珠，再硝化反应使之转化为铁离子，检验铁离子从而间接检测出样本中是否含有目标致病菌。在一定条件下铁离子的量与目标菌显示出线性关系，在一定范围能够定量检测目标菌。该方法可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
文档编号G01N33/577GK103116026SQ201310032109
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者张锦胜, 彭红, 赖卫华 申请人:南昌大学