基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒及其测定方法
【专利摘要】本发明公布了一种基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒及其使用该试剂盒进行检测的方法。该试剂盒包括检测膜条、酶标试剂、显色剂A、显色剂B、反应终止液、浓缩洗涤液、自身抗体谱标准条带。检测膜条上包括检测区和质控区，其中，质控区包被有2条质控线，用于指示操作中是否正常加入待检样本酶标试剂是否有效，以及初步定性指示样本液体中所含IgG抗体量的程度。
【专利说明】基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒及其测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂及其测定方法，属于医疗检测领域。
【背景技术】
[0002]作为自身免疫病的重要血清标志物，人体自身抗体的快速检测对于自身免疫性疾病的诊断、预后和转归判断及理解疾病的病理过程有重要的应用价值和理论意义。本发明适用于体外定性检测人血清中可提取性核抗原(ENA)自身抗体，包括抗Sm(史密斯抗体)、抗U1RNP (Ul小分子细胞核核糖蛋白抗体)、抗SSA (干燥综合征抗原A抗体)、抗SSB (干燥综合征抗原B抗体)、抗rRNP (核糖体P蛋白抗体)、抗Scl-70 (DNA拓扑异构酶I抗体)、抗Jo-1 (组氨酰-tRNA合成酶抗体)。
[0003]目前，市面上的自身抗体检测膜条产品只有一条包被抗人IgG抗体的质控线，这种方法只能判断检测时是否添加了检测样本，而不能判别检测过程中加入的AP酶活性是否有效。
[0004]临床上常用的自身抗体检测方法主要有:免疫双扩散法、间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等。其中免疫双扩散法是经典的实验方法，其特异性高，价格低廉，但操作费时，且肉眼观察沉淀环，结果灵敏度低。对实验操作人员经验和操作水平要求高，结果一致性较差。间接免疫荧光法是检测自身抗体的常用技术，其特异性判断需经过ELISA、免疫印迹等技术的二级确认，同样对实验操作人员经验和操作水平要求高，且结果一致性差。酶联免疫吸附法具有较高的成熟度，灵敏度高、特异性较好，操作方法简便快速、无放射性污染且检测结果排除了人为的主观判断，然而，该方法一次实验仅能检测单一指标，通量低，成本较高，应用推广难度大。免疫印迹法是在凝胶电泳和固相免疫检测技术基础上发展起来的一种免疫生化检测技术，具备SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和高敏感性的特点，但目前市面上基于该方法的自身抗体检测膜条产品只有一条包被抗人IgG抗体的质控线，不能判别检测过程中加入的AP酶活性是否有效。
【发明内容】
[0005]为了克服上述方法检测自身免疫性疾病过程存在的不足，节省时间、人力和资金，本发明提供了一种定位准确、价格低廉，多种蛋白联合检测的免疫印迹法自身抗体检测试剂。
[0006]本发明目的在于提供一种基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂，能同时检测包括抗Sm、抗U1RNP'抗SSA、抗SSB、抗rRNP、抗Scl_70、抗Jo-1等7种抗体，并且该检测试剂经过喷印包被设置了两条质控线，分别包被有人IgG蛋白和抗人IgG抗体，用于指示检测过程是否正常进行和酶免试剂是否有效，为进一步的明确判断提供有价值的参考依据。
[0007]本发明的主要技术方案是:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，将ENA按照分子量大小依次分开，通过转印技术转移至硝酸纤维素膜上，对该硝酸纤维素膜条进行喷印包被设置两条质控线，然后将含有质控线和ENA抗原的硝酸纤维素膜放入反应槽中，与待测血清进行反应，如待测样本中含有自身抗体，则膜条上原本按照分子量依次分开的各种ENA相关抗原，将会与待测血清中含有的抗体发生特异性结合，再加入酶标试剂和显色齐U，进行显色反应，将显色区带与标准对照区带对比即可判断待测样本中所含有的ENA抗体类别；其抗体的有无和抗体种类和数量，对诊断和鉴别风湿病等自身抗体疾病具有重要的临床意义。同时，本发明涉及的硝酸纤维素膜上喷印有人IgG的质控线1，用于检测加入酶结合物中酶的活性是否失效，无论ENA抗体阴性或阳性血清，只要试剂有效，在膜条的质控线区域，均能显示出棕色区带；阳性血清在ENA抗原转印区还能显示对应阳性区带。质控线2包被有抗人IgG抗体，用于初步定性指示样本液体中所含IgG抗体量的程度。若试剂失效(主要指酶标抗体、显色液1、显色液2)，则膜条质控线区域不会有任何区带。本发明不但可以判断待测样本中含有何种ENA抗体，还可以断定检测结果是血清ENA抗体阴性还是试剂失效，有效解决了用户在遇到不显色的膜条时，难以断定是血清ENA抗体阴性还是试剂失效的问题，同时可初步知识样本液体中所含IgG抗体量。
[0008]经喷印机喷印包被，在固相膜上附着两条质控线。
[0009]所述质控线I包被有人IgG蛋白。
[0010]所述质控线2包被抗人IgG抗体。
[0011]所述质控线I用于检测加入的抗体中所标酶的活性是否失效，如酶的活性失效，则此条带不显色。
[0012]所述质控线2的抗人IgG抗体质控线显色颜色的深浅用于初步定性指示样本液体中所含IgG抗体的情况。
[0013]同时，本发明还提供了上述试剂的测定方法，包括以下步骤:
[0014](I)按所需量将浓缩洗涤液用蒸馏水作1: 10稀释，将稀释好的洗涤液置于37°C水浴中预热。
[0015](2)取出反应槽，每槽加入0.5ml洗涤液，然后加入待检血清IOul，充分混匀，缓慢摇动于37°C孵育30min。
[0016](3)弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤4次，每次每槽1ml，洗涤lmin。
[0017](4)每槽加入洗涤液0.5ml，酶结合物20ul，混匀，缓慢摇动于37°C孵育30min。
[0018](5)洗涤方法与⑶相同。
[0019](6)加入显色液A0.5ml,显色液B0.5ml,室温反应lOmin。
[0020](7)每槽加入0.5ml终止液，终止反应，Imin后弃去液体，用自来水洗涤数次，取出硝酸纤维素膜条，用吸水纸吸干后进行结果判断。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0022]本发明涉及的经喷印包被增加的自身抗体检测试剂中质控线I上的人IgG，用于指示AP酶的活性，其显色强度与待测样本无关，仅指示AP酶的活性。这条质控线为试剂货架期的稳定性和有效性提供了参考依据。质控线2包被的是抗人IgG抗体，利用双抗体夹心法，通过与血清样本中的人免疫球蛋白IgG结合后再与试剂中的碱性磷酸酶(AP酶)标记的抗人IgG进行特异反应而显色的，可初步定性指示样本中IgG含量。这种质控方式，可以指示实际操作中因漏加样本或误加其他样本而导致的检测结果无效。【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例一的检测膜条结构示意图；
[0024]图2是本发明的检测原理图；
[0025]图3是本发明实施例1的自身抗体谱标准条带；
[0026]附图标记:1、检测膜条；2、自身抗原线；3、质控线。
【具体实施方式】
[0027]本发明的实施例和制剂实施例可更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0028]实施例1
[0029]本发明试剂组成成分包括:膜条(8条X 5板)、浓缩洗涤液(25ml/瓶X 2瓶)、酶标抗体(0.6ml/瓶X2瓶)、显色液A(25ml/瓶)、显色液B(25ml/瓶)、终止液(25ml/瓶)、海绵和标准对照图谱组成。样本要求，取血后应尽快分离血清，以免溶血。分离后的标本应尽快进行测试，如不能及时测试可将标本置4°C冰箱贮存，超过3天应加入0.1 %硫柳汞防腐，置-20°C冷冻保存，测试前注意恢复至室温。
[0030]测定步骤:
[0031](I)将所有试剂恢复至室温。在室温下进行测试。
[0032](2)按所需量将浓缩洗涤液用蒸馏水作1: 10稀释，即I份浓缩洗涤液加9份蒸馏水稀释。
[0033](3)取出反应槽，每槽加入0.5ml洗涤液，然后加入待检血清IOul，充分混匀，缓慢摇动于37°C孵育30min。
[0034](4)弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤4次，每次每槽1ml，洗涤lmin。
[0035](5)每槽加入洗涤液0.5ml，酶结合物20ul，混匀，缓慢摇动于37°C孵育30min。
[0036](6)洗涤方法与⑷相同。
[0037](7)加入显色液A0.5ml，显色液B0.5ml，室温反应IOmin。
[0038](8)每槽加入0.5ml终止液，终止反应，Imin后弃去液体，用自来水洗涤数次，取出膜条，用吸水纸吸干后即可进行结果判断。
[0039]结果判定:将印迹膜上起始线与标准对照图谱的起始线对齐，观察膜条上的阳性显色区带与标准对照区带对应的位置，即可判断显色区带含有的是何种自身抗体。
[0040](I)结果判断请参看说明书附图3自身抗体的谱标准条带图，零位线(蓝线)下约2_处的第一、二条显色带为试剂质控线1、质控线2，若第一条质控线I不出现，说明试剂失效。
[0041](2)判断结果时，需将谱带定位与带型结合起来。带型指一种抗体有多条区带时，区带间相对不变的位置关系构成的图型。如抗Scl-70常出现4条；抗SSB常出现2条，且总是与抗SSA同时出现；抗Sm常出现2-3条；抗DE (抗Liu)常出现5_6条等等。谱带定位时与标准带相差Imm内属允许范围。
[0042](3)本试剂盒也可作抗DM-53、抗RA-54检测，类风关病人除有54KD抗体外，也可出现36KD抗体。
[0043]如下表所示:[0044]ENA相关抗体对应的疾病及阳性率
[0045]
【权利要求】
1.基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂包括检测膜条、酶标试齐?、显色剂Α、显色剂B、反应终止液、浓缩洗涤液、自身抗体谱标准条带。
2.根据权利要求1所述的基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒，其特征在于，检测膜条包括2条或2条以上自身抗原检测线、质控线1、质控线2。
3.根据权利要求2所述的基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒，其特征在于:质控线I包被有人IgG抗体，质控线2包被有抗人IgG抗体。
4.根据权利要求2所述的基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜条上的质控线蛋白通过喷印包被。
5.一种使用权利要求1中所述的基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒的测定方法，其特征在于，所述试剂盒的测定方法包括以下步骤: (1)按所需量将浓缩洗涤液用蒸馏水作1: 10稀释，将稀释好的洗涤液置于37°C水浴中预热。 (2)取出反应槽，每槽加入0.5ml洗涤液，然后加入待检血清IOul，充分混匀，缓慢摇动于 37°C 孵育 30min。 (3)弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤4次，每次每槽1ml，洗涤lmin。 (4)每槽加入洗涤液0.5ml，酶结合物20ul，混匀，缓慢摇动于37°C孵育30min。 (5)洗漆方法与(3)相同。 (6)加入显色液A0.5ml,显色液B0.5ml,室温反应lOmin。 (7)每槽加入0.5ml终止液，终止反应，Imin后弃去液体，用自来水洗涤数次，取出检测膜条，用吸水纸吸干后进行结果判断。
【文档编号】G01N33/68GK103969441SQ201310032228
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月28日 优先权日:2013年1月28日
【发明者】王继华, 陈飞, 唐时幸 申请人:广州万孚生物技术股份有限公司