专利名称：伊犁马育种方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物分子生物学和育种领域，具体的说，涉及一种提高伊犁马体尺性状的育种方法及其试剂盒。
背景技术：
马肉质味极佳，越来越受到消费者青睐，价格平稳上扬。近年来，随着人们对马肉理化特性和营养价值进一步认识，逐渐明确了它们所具有的特殊作用。马肉瘦肉多、脂肪少，含较多的不饱和脂肪酸，这种不饱和脂肪酸能抵消饱和脂肪酸促使血管中胆固醇沉积的有害过程等优点，马肉中胆固醇含量低，每IOOg可食肉中胆固醇含量仅为10.4-31.9mg,因此有很好的防止动脉血管粥样硬化的作用。国内马肉消费主要集中在新疆、内蒙等喜食马肉的少数民族聚集区，马肉市场销售量逐年上升。新疆马肉产量2000年3.57万吨，2008年达到4.8万吨。目前，国内马肉的产量已经无法满足消费者日益增长的需求。同时在国际市场上也成为热销商品，因此发展肉用养马业势在必行。伊犁昭苏马场近年来从国外和东北引进了大量的大型阿尔登马对当地的伊犁马进行杂交改良，进行肉用马新类型的培育。但是马作为大家畜，其世代间隔长，且马的主要经济性状的遗传力低，用传统的育种方法很难获得较为显著的遗传进展。要在常规的杂交和选优交配培育马的基础上，需要筛选与马的肉用性能密切相关的DNA标记，利用分子标记辅助选择技术，实现早期选种和选种的准确性，加速伊犁马肉用新类群的培育工作。生长发育性状，屠宰性能和肉品质是评价马肉用性能的主要指标。马的体尺性状的准确测定能够评估生长发育性状，因此我们通过鉴定与马的体尺性状相关的SNP标记，进行肉用马的标记辅助选择，加速伊犁马肉用新类群的培育工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种伊犁马的育种方法和试剂盒，通过检测与伊犁马肉用新类群体尺性状相关的SNP标记,该位点位于如SEQ ID N0.1所示的170bp处,通过分子生物学技术检测该标记，利用该标记辅助选择有利的个体留种，以显著提高伊犁马肉用新类群的体尺性状，即体高，体长，胸围和管围，加速伊犁马肉用新类群的培育。本发明一方面涉及一种伊犁马的育种方法，其特征在于包括如下步骤:提取伊犁马父本和/或母本血液中的DNA，针对SEQ ID N0.1中170bp处的SNP多态性位点，根据SEQIDN0.1序列分别在其160bp上游、ISObp下游设计适合的、与其核苷酸互补的正向、反向引物，采用正反向引物进行扩增，扩增产物使用Alu I限制性内切酶进行酶切，酶切产物使用凝胶电泳进行检测，选择在凝胶电泳中出现2或者3条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于上游正向引物为:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 和 / 或下游的反向引物 5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，选择在凝胶电泳中284bp，169 bp，115bp附近有2或者3条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本。在本发明的另一个优选实施方式中，其特征在于选择在284bp，169bp，115bp附近仅有2条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本，优选的，所述的条带位于169bp 和 115bp 附近。在本发明的另一个优选实施方式中，其特征在于还包括针对所培育的子代进行相同的筛选步骤。本发明另一方面还涉及一种伊犁马育种的试剂盒，其特征在于包括正向引物F:5，-TGGAGTCAGTTGGGTTTAATG-3，、反向引物 R: 5 ’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3 ’、Alu I 限制性内切酶，任选的，包括PCR和/或凝胶电泳所需要的其它试剂。本发明还涉及上述试剂盒在提高伊犁马体高和/或体长和/或胸围和/或管围中的应用。采用本发明的方法和试剂盒能够显著提高伊犁马肉用新类群的体尺性状，即体高，体长，胸围和管围，加速伊犁马肉用新类群的培育。
具体实施方式
:1.与伊犁马体尺性状相关的SNP的获得(I)伊犁马基因组DNA的提取采集伊犁马血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取伊犁马基因组DNA，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至50ng/ul，保存备用。(2)目的片段的扩增根据NCBI数据 库收录的马的基因组序列设计引物，包括正向引物F:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 反向引物 R:5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，扩增出目的片段。如SEQ ID N0.1所示，该SNP位于扩增到目的片段的170bp处，该处碱基可以为C或T，当该处碱基为C时，可以被Alu I内切酶识别，识别序列为AGCT。PCR反应体系为25μ L，包含:10 X buff er2.5 μ L，IOpmol/μ L正反向引物各
0.5 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, 2.5U/ μ L DNA 聚合酶 0.4 μ L，50ng/ μ L DNA 模板 I μ L,余量用水补足。PCR反应程序:94 V 5分钟；94 V 30秒，54 V 30秒，72 V 30秒，35个循环；72°C IOmin。(3)PCR-RFLP该PCR产物用Alu I内切酶进行酶切，反应体系为20yL:10yL PCR产物，2 μ LlO XBuffer, I μ LIOU/ μ LAlu I限制性内切酶，余量为水。反应条件:37°C温育3小时。然后将得到的酶切产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相。(4)基因型判定根据PCR-RFLP的结果判定检测个体的基因型。当扩增片段的170bp处碱基为C时，AluI内切酶可以识别该位点，即可将PCR扩增片段切成2条片段，一条为169bp，一条为115bp，该基因型记为CC型；当扩增片段的170bp处碱基为T时，Alu I内切酶不能识别该位点，即无法切开PCR扩增片段，凝胶中只有一条条带，为284bp，该基因型记为TT型；当扩增片段的170bp处碱基既含有T又含有C时，凝胶中将有3条带，分别为284bp，169bp，115bp，该基因型记为TC型。以上表明该位点存在3种基因型:TT:284，TC =284/169/115,CC:169/115。2伊犁马不同基因型与体尺性状的关联分析按照实施I中方法，对采自新疆昭苏县158份伊犁马进行PCR-RFLP检测，该SNP位点分析结果如表I所示:表ISNP位点在伊犁马新类群中的基因型频率和等位基因频率
权利要求
1.一种伊犁马的育种方法，其特征在于包括如下步骤:提取伊犁马父本和/或母本血液中的DNA，针对SEQ ID N0.1中170bp处的SNP多态性位点，根据SEQ ID N0.1序列分别在其160bp上游-、180bp下游设计适合的、与其核苷酸互补的正向、反向引物,采用正反向引物进行PCR扩增，扩增产物使用Alu I限制性内切酶进行酶切，酶切产物使用凝胶电泳进行检测，选择在凝胶电泳中出现2或者3条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本。
2.根据权利要求1所述的伊犁马育种方法，其特征在于上游正向引物为:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 和下游的反向引物 5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，选择在凝胶电泳中284bp，169bp，115bp附近有2或者3条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本。
3.根据权利要求2所述的伊犁马育种方法，其特征在于选择在284bp，169bp，115bp附近仅有2条条带的父本和/或母本作为育种的父本和/或母本，优选的，所述的条带位于169bp 和 115bp 附近。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的伊犁马育种方法，其特征在于还包括针对所培育的子代进行相同的筛选步骤。
5.—种伊犁马育种的试剂盒，其特征在于包括正向引物F:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’、反向引物 R:5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’、Alu I 限制性内切酶，任选的，包括PCR和/或凝胶电泳所需要的其它试剂。
6.权利要求 5所述的伊犁马育种试剂盒在提高伊犁马体高和/或体长和/或胸围和/或管围中 应用。
全文摘要
本发明公开了一种伊犁马的育种方法和试剂盒，通过检测伊犁马的SNP进行育种。采用本发明的方法和试剂盒能够显著提高伊犁马肉用新类群的体尺性状，即体高，体长，胸围和管围，加速伊犁马肉用新类群的培育。
文档编号G01N27/447GK103181361SQ20131004005
公开日2013年7月3日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者贺三刚, 李文蓉, 刘明军, 耿娟, 张宁, 张雪梅, 刘晨曦, 郑新宝, 董红 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心