专利名称：禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测禽白血病病毒的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
背景技术：
禽白血病(Avian leukosis，AL)是由反转录病毒科中的禽白血病病毒(Avianleukosis virus，ALV)引起的多种肿瘤性疾病的统称，呈世界性分布。根据病毒宿主范围、囊膜特性和交叉中和反应的不同，将ALV分为A-JlO个亚群，其中E亚群为内源性ALV，A、B、C、D和J亚群为外源性ALV。由于诱发肿瘤、患鸡胴体废弃、产蛋性能下降和对鸡群生产性能的影响，ALV给养禽业带来巨大经济损失。然而，迄今为止，针对该病尚无可供预防的疫苗和有效药物，检测淘汰阳性鸡，进而建立无禽白血病种鸡群是控制本病的有效途径。培育无ALV感染鸡群时，首先对母鸡血清分离病毒，检测其中的p27抗原，同时检测泄殖腔棉拭子的P27抗原，选择ALV阴性和不排泄ALV的母鸡的种蛋孵化，然后对孵出的雏鸡检测其泄殖腔拭子中的P27抗原。选用阴性的雏鸡分成小群隔离饲养，至6周和25周龄时再检测ALV,淘汰阳性鸡，连续3-4个世代，可逐步建立起无ALV感染鸡群，达到净化ALV的目的。目前常用的检测ALV的方法主要包括:病毒分离，免疫荧光检测(IFA)，琼脂扩散试验，ELISA，RT-PCR等。不同方法各有优缺点。ELISA抗原检测方法以其敏感、特异、易于操作而被广泛使用，适用于大量样品的快速检测，更适合基层对该病的检测。ALV核衣壳蛋白p27由ALV gag基因保守序列编码，p27蛋白是核衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的抗原位点，外源性ALV各亚群间同源性高达90%，在病毒粒子中含量高，占总蛋白成分的30%以上。本专利应用两株抗ALV p27蛋白的特异性单克隆抗体ALVP27-5D3和ALV P27-4F12研制出了禽白血病病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，能够快速、准确地检测ALV病毒，具有很好的特异性和敏感性。
发明内容
本发明提供的禽白血病病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其包括:(I)包被抗ALVp27蛋白单克隆抗体(捕获抗原的抗体)的酶标板；(2)酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体(检测抗体)；其中，包被在酶标板的ALVp27蛋白单克隆抗体与酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体分别针对ALVp27蛋白不同的抗原决定簇。本发明以GST-p27纯化的蛋白作为抗原制备ALV病毒核衣壳蛋白p27单克隆抗体，得到多个不同抗原决定簇的单克隆抗体，进一步筛选发现其中2株针对不同表位的杂交瘤细胞株分泌抗体效价高。在本发明实施例中，包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株ALVP27-5D3 (保藏号:CGMCCN0.7106)分泌获得，酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株ALV P27-4F12 (保藏号:CGMCC N0.7107)分泌获得。
本发明所述酶标记抗ALV P27蛋白单克隆抗体的标记酶是辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤:将5mg HRP溶于0.5mL0.lmol/L NaHCO3溶液中；加0.5mlIOmmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。(2)加0.75mL0.lmol/L Na2CO3混匀。(3)加入0.75mL小鼠已处理的腹水，或纯化单克隆抗体等(15mg/mL)，混匀。(4)称取SephadexG-25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3小时或4°C过夜。(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制的5mg/mL NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20体积的NaBH4溶液，混匀，室温作用I小时(或4°C过夜)。(6)用等体积的饱和硫酸铵沉淀交联物，收集沉淀并用PBS溶解。(7)用Protein G柱纯化，4°C过夜透析24_36h，即得纯化酶标记抗体。单克隆抗体可按照如下方法包被到酶标板:将3.5yg/mL的单克隆抗体按100 μ L/孔加入到酶标板中，4°C放置12-16h，用PBST洗涤后，用5%脱脂乳封闭，350 μ L/孔，于37 °C放置2h，再用PBST洗涤。此外，本发明试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:稀释液、酶标抗体、IOX洗涤液、阳性对照、阴性对照、底物缓冲液、TMB粉剂、TMB溶解液、H2O2溶液、终止液。运用本发明检测试剂盒可检测天然的ALV病毒p27蛋白，以及重组的ALVp27蛋白。本发明运用杂交瘤细胞技术制备了多株针对ALVp27蛋白的单克隆抗体，筛选出其中可分别识别P27蛋白上2个不同线性表位的2株单克隆抗体(即ALV P27-5D3, ALVP27-4F12)进行了相应的特性鉴定。经间接免疫荧光和ELISA方法鉴定，2株单克隆抗体与ALV分离株ALV(GY3)具有良好的反应性。其腹水效价均可达1: 1.5x10s或以上，且分泌抗体的杂交瘤细胞株活性 稳定。本发明用分别针对p27蛋白不同线性表位的2株单克隆抗体对抗原进行捕获和检测，相对于仅用一株单克隆抗体建立的抗体夹心ELISA方法来说，敏感性大大提高，更适用于临床样本中微量抗原的检测。本发明还有一个重要的环节就是需要高纯度的酶标记抗体，优质的酶标记抗体既能保留抗体的免疫学活性，又能保留酶的活性。抗体的标记率越高，则方法的敏感性越高，所以这就需要摸索出比较成熟的HRP标记抗体的方法；本发明利用免疫学上的过碘酸钠法进行标记，并进行了一些细节上的改进。这有效地保证了本方法的高敏感性。与目前常用于ALV检测的RT-PCR等方法相比，本发明建立的双抗体夹心ELISA抗原检测法成本低、操作简便、重复性好，适用于基层临床推广应用，具有巨大的经济效益和广阔的应用前景。本试剂盒的建立为ALV流行病学研究及疫病防控、净化提供了实用、快速、有效的检测工具。
图1显示的是本发明ELISA抗原检测建立的技术路线。.
图2显示的是两株单克隆抗体分别与ALVp27蛋白反应性的Westernblotting鉴定，M.蛋白marker，1.DF-1细胞裂解产物，2，3.感染ALV-J的DF-1细胞裂解产物，4.感染ALV-A的DF-1细胞裂解产物。
图3显示的是单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定ALV-J，A.ALV P27-4F12 ；B.ALVP27-5D3 ；C.ALV P27-3C6 ；D.ALV P27-5B10 ；E.ALV P27-1C5。图4显示的是两株腹水纯化后的SDS-PAGE，M.Marker ; 1.纯化后的ALVP27-5D3IgG ；2.纯化后的 ALV P27_4F12IgG。本发明中杂交瘤细胞株ALV P27-5D3于2013年I月21日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.7106。杂交瘤细胞株ALV P27-4F12于2013年I月21日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.7107。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤 或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1双抗夹心ELISA抗原检测方法的建立一、单克隆杭体的制备1.单克隆抗体的制备(技术路线见图1)根据已发表的ALV JS-nt株的基因序列(登录号:HM235667)，设计合成了一对针对P27的特异性引物，在上下游分别添加了 BamHI和XhoI酶切位点，由上海英骏公司合成。引物序列如下:上游引物 5' -GCGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG-3' (SEQ ID N0.1)；下游引物5' -GCCTCGAGTTAGGCCGCGGCTATGCCT-3' (SEQ ID N0.2) 用PCR的方法从ALV基因组中扩增出了 p27基因，并将扩增片段克隆至pGEX-6P-l表达载体(GE公司产品)中，筛选重组菌pGEX-6p-l-P27/BL21，用IPTG诱导蛋白表达GST-p27，并利用GE公司蛋白预装柱纯化蛋白，得到纯化的GST-p27融合蛋白。用上述纯化的GST-p27融合蛋白腹腔注射6周龄雌性BALB/C小鼠，共三次，每次间隔14天，剂量分别为50、100、150 μ g/只。融合前加强免疫，200 μ g/只，加强免疫后72-96h按常规方法进行细胞融合，融合后第10天用预冷丙酮乙醇(3:2，v/v)固定感染ALV-J的DF-1细胞，经间接免疫荧光(IFA)检测融合细胞上清中的抗体，筛选阳性杂交瘤细胞；同时用包被GST-p27蛋白，间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清中的抗体，用非重组菌裂解上清GST作对照，筛选阳性杂交瘤细胞。所有检测强阳性孔的融合细胞转到24孔板，进行扩大培养，同时选择5个荧光亮度强并且ELISA值高的孔进行亚克隆。最终获得了 5株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，分别命名为ALV P27-5D3、ALV P27_4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5 和 ALV P27-3C6。参照Barton F等(1983)的方法制备单克隆抗体的腹水:主要步骤是挑选雌性或者个体大的雄性BALB/c小鼠，每只腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL, 10-14天后，将状态良好的杂交瘤细胞从细胞培养瓶内轻轻吹下，1000rpm/min离心lOmin，弃上清，用无菌PBS悬浮，计数；每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5χ105-1χ106个，注射后轻柔小鼠腹部，使细胞均匀分散于小鼠的腹腔中；7_10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水；将腹水5000rpm/min离心lOmin，收集上清，即为单克隆抗体腹水，-20°C保存备用。2.单克隆抗体的鉴定2.1单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定将单克隆抗体ALV P27-5D3, ALV P27-4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5 和ALVP27-3C6 分别用 ALV-J GY3 (ffu X,2010Vet Res Commun, 2010.34 (7):ρ.619-32)感染DFl细胞进行间接免疫荧光检测，同时设SP2/0细胞培养上清液对照。结果显示获得的5株单克隆抗体对ALV-J的感染的细胞都具有特异性荧光，SP2/0细胞上清液没有荧光，为阴性(如图3)。2.1单克隆抗体识别表位的分析采用相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位。即用ρ27蛋白以3.5 μ g/mL浓度ΙΟΟμ L包被酶标板，封闭、洗涤后分别加入饱和稀释度的单克隆抗体，37°C作用60min，再洗涤后每孔分别两两组合加入另一株单克隆抗体，37°C作用60min，同样洗涤后加入工作浓度的HRP标记山羊抗小鼠二抗(Sigma公司产品),37°C作用60min,最后再洗漆,底物显色测定0D450nm值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的Al值:Al= (Al.2-Α1)/Α2χ100%(Α1.2:表示2株单克隆抗体叠加后的OD值；Al:表示第I株单克隆抗体自身叠加的OD值;A2:表示第2株单克隆抗体自身叠加的OD值)。当两两抗体叠加之后的Al值大于30%，判为两株单克隆抗体识别不同位点。经过相加指数计算，并结合单克隆抗体腹水效价和间接免疫荧光结果，确定识别2个不同表位的单克隆抗体代表株分别为ALV P27-5D3和ALV P27-4F12。2.2杂交瘤细胞上清及腹水中单克隆抗体效价的测定杂交瘤细胞培养上清从1:100开始作2倍比稀释，纯化的腹水从1:1000开始作2倍比稀释，按间接ELISA方法测定其效价。细胞培养上清和纯化的腹水的效价测定结果分别见表1、表2。表I两株单克隆杂交瘤细胞培养上清抗体ELISA效价
权利要求
1.禽白血病双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其包括: (1)包被抗ALVp27蛋白单克隆抗体的酶标板； (2)酶标记抗ALVp27蛋白单克隆抗体； 其中，包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体与酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体分别针对ALV p27蛋白不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体为保藏号CGMCC N0.7106的杂交瘤细胞株ALV P27-5D3分泌获得，酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体为保藏号CGMCC N0.7107的杂交瘤细胞株ALV P27-4F12分泌获得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
全文摘要
本发明提供了一种禽白血病双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其中包括包被抗ALVp27蛋白单克隆抗体的酶标板、酶标记抗ALVp27蛋白单克隆抗体等。捕获抗体和检测抗体分别针对p27蛋白不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗ALVp27蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ALVP27-5D3分泌获得，酶标记抗ALVp27蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ALVP27-4F12分泌获得。本发明试剂盒操作简便、快速，可以用于ALV所有亚群病毒的检测，适用于基层各级兽医部门和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。
文档编号G01N33/577GK103163299SQ201310046928
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者秦爱建, 钱琨, 尹丽平, 韶红霞, 金文杰 申请人:扬州大学