专利名称：一种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及ー种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法。
背景技术：
群勃龙(Trenbolone,TRE),俗称追宝龙,化学名称为去甲雄三烯醇酮(17-P -hydroxyestra-4, 9，ll-trien-3-one-17_acetate),是ー种人工合成的促蛋白同化激素。群勃龙在临床上可用于治疗严重的营养缺乏、骨质疏松症及重度烧伤等疾病，由于具有合成代谢和雄激素的功效，用其喂养畜禽时可使营养成分由脂肪组织向肌肉组织转移，从而促进肌肉生长和提高食欲。它还可以增加蛋白质合成，促进肌肉发达和红细胞生成，增强体力和耐力，因此在运动会和动物竞技比赛中被用作兴奋剂，这严重违背了体育竞赛的公平精神。群勃龙残留的危害包括对动物本身产生的危害和由于群勃龙在动物源食品中的残留对人体产生的危害，其副作用包括皮肤痤疮、性功能减退以及睾丸萎縮，女性使用者则是体毛增长、胸部变小及经期不規律等。长期食用时会严重干扰人体的自然激素平衡，导致内分泌失调、生育能力下降，并具有潜在的致癌性和发育毒性。由于这些有害的毒副作用，TRE的使用在许多国家得到了严格的监管。国际食品法典委员会(CAC)、美国、日本等组织和国家对动物食品中蛋白同化类激素的残留都有严格的要求。FAO / WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)在文件“TRS788-JECFA34/40”中规定:TRE在动物肌肉和肝脏中的最大残留限量(MRLs)分别为2 ng/g和10 ng/g。2004年欧盟对我国畜禽产品提出了 18个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，群勃龙不得检出。我国农业部2002年4月发布的第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清単》也明确表示，性激素类原料药及其单方、复方制剂产品不准以抗应激、提高饲料报酬、促进动物生长为目的在所有食源动物的饲养过程中使用。因此，迫切需要建立方便、快捷、灵敏的检测方法，来监控TRE在动物饲料和组织的残留。TRE残留常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱ー质谱法(GC-MS)和液相色谱ー质谱法(LC-MS)等。这些方法灵敏度高，定性准确，可以确定化合物的分子量、分子式，甚至官能团，适合定量检测TRE含量。但这些方法成本高，需要专业的技术人员，昂贵的实验仪器及长时间的前期准备工作。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，其主要优点是抗原抗体的亲合力高、检测快速、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，是最灵敏的方法之一。胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的ー种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检測。与ELISA相比，具有样品前处理简単，显色时间短(3-5 min)，且所有试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏、高效的群勃龙残留快速检测试纸卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。本项目也得到2012年度国家自然科学基金项目(U1204310)资金支持。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了ー种操作简便、快速准确、灵敏度高、特异性強、成本低廉、稳定性好且可进行批量检测的群勃龙残留快速检测试纸卡。本发明解决的另一个技术问题是提供了ー种群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法。本发明的技术方案是:ー种群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的群勃龙残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的金标抗体结合垫上灌注有胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体。本发明所述的支撑层为PVC板。本发明所述的吸收垫是以植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 _，吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 mm。本发明所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。本发明所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。本发明所述的胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体是由群勃龙ー牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来的。ー种群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于:首先将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按照由左到右的顺序附着干支撑层上，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，然后用切割机制成试纸条，再将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的塑料盒体内，这样就制得了群勃龙残留快速检测试纸卡。本发明所述的样品垫的制备方法为:将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN3的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫。本发明所述的金标抗体结合垫的制备方法为:将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN3的PBS缓冲液中20 min, 37で恒温烘干，然后将金标抗体灌注于已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫。本发明所述的硝酸纤维素膜的制备方法为:将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紫，开机后将抗原和ニ抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30 min, 37で烘干后，加入干燥剂，4で密封保存。本发明所述的群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为:准确称取TRE 100 mg和琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml无水吡啶，50で避光搅拌反应24 h，反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物；用质量浓度为5%的NaHCO3溶液溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化，离心后弃上清，残余物用无水硫酸钠干燥，重结晶得TRE琥珀酸酷；混合酸酐法将37.2 mg TRE琥珀酸酷溶解在2 ml N，N-ニ甲基甲酰胺(DMF)中，置4°C冰箱中预冷10 min，然后于冰浴磁力搅拌下，加入10 三こ胺，4で冰浴条件下反应I h，然后加入30 氯甲酸异丁酷，继续冰浴搅拌反应I h;将40 mg的OVA溶于2 ml碳酸盐缓冲溶液中(CBS，0.05 mol/L, pH 9.6)，冰浴、搅拌条件下将上述反应产物逐滴加入OVA溶液中，加完后在4で下振荡反应6 h。反应产物充分透析，即得TRE-OVA检测抗原溶液，将其冷冻干燥保存备用。本发明所述的吸收垫的制备方法为:将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸收垫。本发明的群勃龙残留快速检测试纸卡具有如下优点:
(1)灵敏度高、特异性强。群勃龙残留快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和カ的抗群勃龙特异性单克隆抗体制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子通过异性电荷间范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体的特异性和亲和カ影响很小。因此，快速检测试纸卡灵敏度高、特异性强，其检测限可达2 ng/ml ；
(2)操作简单、方便快捷。使用快速检测试纸卡时无需特殊试剂，只要将处理后的样品溶液用滴管滴入试纸卡加样孔内3 4滴，3飞min即可观察结果；
(3)检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“I ”或“ Il ”作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹时，表示被检测样品溶液呈阳性；若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹吋，表示样品溶液呈阴性。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判；
(4)胶膜的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；
(5)成本低、投资少。使用本发明试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一歩到位，成本低廉，见效快；
(6)易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监瞀、规模养殖及个体生产等，具有广_的市场前景和较大的经济效益和社会效益。
图1为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡的结构示意图；图2为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡中试纸条的侧视图；图3为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡中试纸条的俯视图。图面说明:1、塑料盒体、2、试纸条、3、支撑层、4、样品垫、5、金标抗体结合垫、6、硝酸纤维素膜(NC膜)、7、吸收垫、8、加样孔、9、观察窗、10、质控线(C线)、11、检测线(T线)、12、胶膜、13、标记线。
具体实施例方式结合附图详细描述实施例。ー种群勃龙残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体I和封装于塑料盒体I内的试纸条2，所述的试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫4、金标抗体结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，所述的塑料盒体I上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上的样品垫4位置相对应，观察窗9与试纸条2上的硝酸纤维素膜6位置相对应，所述的硝酸纤维素膜6上有群勃龙ー鸡卵清白蛋白(TRE — OVA)偶联物溶液印制的检测线(T线)11和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线(C线)10，两者间距5 mm，其中群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11位于靠近样品垫4的ー侧，所述的金标抗体结合垫5上灌注有胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体。本发明所述的支撑层3是由聚氯こ烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本发明所述的吸收垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5是由玻璃纤维棉制作而成的。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5的叠压宽度为2 mm,吸收垫7与硝酸纤维素膜6的叠压宽度为2 _。本发明所述的样品垫4、金标抗体结合垫5和吸收垫7上方覆盖有胶膜保护层12。本发明所述的硝酸纤维素膜6两端分界处有标记线13。一、本发明群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法:
1、所述的抗群勃龙特异性单克隆抗体由群勃龙ー牛血清白蛋白(TRE — BSA)偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来，由以下步骤实现:
(I)半抗原衍生化:准确称取TRE 100 mg溶于10 ml无水吡啶，然后加入180 mg的琥珀酸酐，50で避光搅拌反应24 h。反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物，用5% NaHCO3溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化。离心后弃上清，残余物用无水硫酸钠干燥，重结晶得TRE琥珀酸酷。(2)免疫原的合成:采用碳化ニ亚胺法(EDC)法合成TRE免疫原:37.2 mg TRE琥珀酸酯用2 ml N，N- ニ甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解后，加入12 mg NHS和38 mg EDC, 37で条件下避光，摇床振荡反应24 h。离心后取上清逐滴加入到3 ml含66 mg BSA的磷酸盐缓冲溶液中(PBS，0.01 mol/L, pH 7.4),37で条件下避光振荡反应4 h。反应完成后先用蒸馏水透析2 d，再用PBS透析3 d。紫外扫描透析液无小分子吸收峰时分装于安瓿瓶中，-2 0で保存。(3)小鼠免疫:用TRE-BSA免疫8 10周龄雌性Balb/C小鼠5只，剂量为60 U g/只，体积为0.2 ml。首免用PBS稀释的免疫原与等体积FCA完全乳化，以后每隔3 w加强免疫一次，换用FIA乳化。免疫5次后断尾采血分离血清，用间接ELISA和间接竞争ELISA(ciELISA)筛选效价高,抑制效果好的小鼠作为融合备用鼠。融合前3 d超免小鼠,尾静脉和腹腔各注射60 //g免疫原。(4)细胞融合:融合前4 5 d用含有8-氮鸟嘌呤的完全培养基(含15%FBS的RPM1-1640)传代培养NSO细胞；前I d用HAT培养滋养细胞；融合时眶下窦采血，脱颈致死小鼠。无菌取脾脏制备脾细胞，在PEG-1500作用下与NSO细胞融合(细胞数量比约为10:1)，将融合后的细胞悬液加入到已铺有滋养细胞的96孔细胞板中，HAT培养。(5)单克隆细胞株的筛选:融合后1(T14 d用间接ELISA和ciELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行3次亚克隆。然后用蛋白同化激素标准品溶液筛选灵敏度高、特异性强的单克隆源细胞株，共取得6株。其中，T3D6细胞株灵敏度最高，特异性最強，其抗体特异性结果见表一。
表一 T3D6细胞株抗体特异性
权利要求
1.ー种群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的群勃龙残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的金标抗体结合垫上灌注有胶体金标记的抗群勃龙 特异性单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的支撑层是PVC 板。
3.根据权利要求1所述的群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体是由群勃龙ー牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来的。
4.一种权利要求1所述的群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于:首先将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按照由左到右的顺序附着干支撑层上，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，然后用切割机制成试纸条，再将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的塑料盒体内，即制得群勃龙残留快速检测试纸卡。
5.根据权利要求4所述的群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述的样品垫的制备方法为:将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN3的磷酸盐缓冲溶液处理后，干燥备用，即为样品垫。
6.根据权利要求4所述的群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述的金标抗体结合垫的制备方法为:将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN3的磷酸盐缓冲溶液中20 min，37で恒温烘干，然后将金标抗体灌注于已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫。
7.根据权利要求4所述的群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述的硝酸纤维素膜的制备方法为:将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紫，开机后将抗原和ニ抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.4的封闭液中30 min，37で烘干后，加入干燥剂，4で密封保存。
8.根据权利要求4所述的群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述的群勃龙ー鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为:称取群勃龙100 mg和琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml无水吡啶，50で避光搅拌反应24 h，反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物；用质量浓度为5%的NaHCO3溶液溶解后，こ醚萃取，H2SO4酸化，离心后弃上清，残余物用无水硫酸钠干燥，重结晶得群勃龙琥珀酸酷；混合酸酐法将37.2 mg群勃龙琥珀酸酷溶解在2ml N，N-ニ甲基甲酰胺中，置4°C冰箱中预冷10 min，然后于冰浴磁力搅拌下，加入10 U I三乙胺，4で冰浴条件下反应I h，再加入30 氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌反应I h;将·40 mg的鸡卵清白蛋白溶于2 ml、摩尔浓度为0.05 mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲溶液中，冰浴、搅拌条件下将上述反应产物逐滴加入鸡卵清白蛋白溶液中，加完后在4で下振荡反应6h，反应产物充分透析，即得群勃龙ー鸡卵清白蛋白检测抗原溶液，将其冷冻干燥保存备用。
9.根据权利要求4所述的群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述的吸收垫的制备方法为:将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 _宽的细条，并用胶膜进行一侧 封闭，干燥备用，即为吸收垫。
全文摘要
本发明公开了一种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法。本发明的技术方案要点为一种群勃龙残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙－鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的金标抗体结合垫上灌注有胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体。本发明还公开了该群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法。本发明操作简单、快速准确、灵敏度高、特异性强、成本低、稳定性好，可进行批量检测。
文档编号G01N33/74GK103116031SQ20131005453
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年2月20日
发明者姜金庆, 王自良, 张慧辉, 常新耀, 刘俊伟, 王淑云, 齐永华, 赵坤, 胡建和, 刘兴友 申请人:河南科技学院