专利名称:尿液中(s)-nnal和(r)-nnal的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法
技术领域:
本发明属于烟草特有亚硝胺在尿液中的生物标志物理化检验技术领域,具体涉及尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法。
背景技术:
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草内源性生物碱与硝酸盐和亚硝酸盐通过亚硝化作用而产生,只存在于烟草、烟草制品和卷烟烟气中。近年来,随着吸烟与健康问题受到人们的广泛关注,国内外对于烟气中各种有害化学成分的研究也日益深入。由于烟草特有亚硝胺中的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1_ 丁酮(NNK)对动物可能有致癌性,因此,现在烟草行业以及卫生机构等迫切需要建立一种准确评价不同人群对NNK暴露程度的方法,而生物标志物法是一种公认且有效的监测NNK暴露人群暴露程度的方法。在NNK分子中没有手性碳原子,因此NNK分子没有对映异构体,但NNK分子中有一个羰基,该羰基随着NNK进入人体后被羰基还原酶还原为羟基,生成一对NNAL对映异构体,分别为(S) -NNAL和(R) -NNAL,部分NNAL可以进一步被糖苷化物为NNAL糖苷化合物(包括NNAL-O-Glucuronide和NNAL-N-Glucuronide),这些代谢产物主要通过尿液和其它体液排出体外,研究还发现在吸烟者的尿液中不含游离形式的NNK。由于人体本身就是一个动态的不对称化学反应有机系统,所以卷烟烟气中的NNK被加氢还原酶还原生成(S)-NNAL和(R)-NNAL的比例以及进一步代谢产物比例必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK的损害程度,因此尿液中(S)-NNAL、(R)-NNAL,-NNAL-糖苷化合物和(R)-NNAL-糖苷化合物的含量以及比例一直受到关注。2002年,Hecht等的研究发现揭示,人体尿样中游离形式的(R)-NNAL的含量略约是(S)-NNAL含量的1.1倍,但人尿样中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S)-NNAL糖苷化合物含量的的两倍左右,这说明(S)-NNAL和(R)-NNAL的进一步代谢途径差别很大,同时也说明人体对(S)-NNAL有一种立体选择性的保留能力,特别是老鼠在摄入NNK后相当长一段时间内其肺部(S)-NNAL的比例也远高于(R)-NNAL。其他学者的研究结果也显示吸烟的肺癌患者尿样中(S)-NNAL与(R)-NNAL的比值明显大于普通吸烟者。结合流行病学调查分析结果,人们推测人肺脏内可能有(S)-NNAL的受体,此受体可特异性结合(S)-NNAL,这可能就是吸烟吸收NNK导致肺癌的原因之一。由于中式卷烟每支卷烟烟气中释放的NNK只有几个纳克,而NNK进入人体后又被代谢为多种物质,加之尿样基质复杂,所以尿样中的⑶-NNAL和(R)-NNAL的检测非常困难,国内外许多相关行业都无法开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作。在这种背景下,许多相关行业迫切需要建立一种能够快速准确测定人体尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例的方法,以便为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息
发明内容
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本发明的目的在于针对现有方法很难开展尿样中⑶-NNAL和(R) -NNAL的检测工作的不足,提供一种尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科学的判定方法,该方法具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,包括以下步骤:①用测定旋光并比对的方法确定⑶-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照,或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-⑶-(+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照;②配制含有rac-NNAL和氘代rac_NNAL_甲基_d3的混合标准溶液,再进行Mosher衍生化,然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;用确定构型后的(S)-NNAL-(S) _(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间,采用内标法分别建立(S) -NNAL- (S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL_(S)-(+)-a -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线;③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀,准确移取IOmL于50mL试管中,加入rac-NNAL-甲基_d3溶液,再用MIP-NNAL固相萃取小柱净化,淋洗后洗脱,干燥过滤后进行Mosher衍生化,浓缩至干,再用7/3的乙腈/水溶解后上HPLC-MS-MS检测。所述的尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其中在分析检测尿样中尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL时进行Mosher衍生化,并使用rac-NNAL-甲基_d3作为内标。所述的尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱_质谱_质谱联用检测方法,使用微波辅助萃取仪在37°C对尿样进行恒温酶解。所述的尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其中向尿液样品加入rac-NNAL-甲基_d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液(pH6.4,50mM)和β -葡糖苷酸酶混匀后置入恒温振荡器或微波辅助萃取仪中在37°C恒温酶解,再将酶解后的尿样经过MIP-NNAL固相萃取小柱净化,淋洗后用二氯甲烷洗脱,加入无水硫酸钠干燥后过滤,减压浓缩至干,加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液,衍生化后再对样品进行HPLC-MS-MS分析,进而换算出尿样中(S) -NNAL 和(R) -NNAL 的含量。
具体实施例方式以下结合应用实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不限定本发明的保护范围。实施例1:除非另有说明,本发明中所采用的百分数均为重量百分数。尿液中⑶-NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,该方法包括以下步骤:1、化学试剂(S)-(+)-a -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐(CAS号20445-33-4),(S)-(+)-a—甲氧基-(三氟甲基)苯乙酸酐(CAS号85541-57-7),4-(-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇(NNAL) (rac NNAL, CAS 号 76014-81-8),4-(甲基-d3_ 亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(rac-NNAL-甲基 _d3CAS 号 1020719-61-2),三乙基胺,β-葡萄糖甘酸酶(类型ΙΧ-Α,来自大肠杆菌)。(S) -NNAL和(R) -NNAL的制备和绝对构型的确定:制备型OD-H手性色谱柱,流动相异丙醇:正己烷的比例为10:90,分别收集两个流出色谱峰,分别浓缩直至其残留物重量都大于lmg。分别取两个色谱峰的浓缩物,用2ml乙醇溶解,测定其比旋光度值,比旋光度值为负值的浓缩物为(S)-NNAL,比旋光度值为正值的浓缩物为(R)-NNAL。2.标准曲线建立外消旋体NNAL标准溶液:以无水乙腈为溶剂,配制浓度为Iyg / mL的racNNAL标准品单标溶液,保留四位有效数字;以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为lug / mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液;以无水乙腈为溶剂,按表I配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基_d3的混合标准溶液;配制浓度为IOng / mL的(S)-⑴-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制浓度为IOng / mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,再按照表2分别加入(S)-(+)_a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜,在氮气氛围中真空浓缩至干,再用100 μ L乙腈/水(7/3)溶解,然后立即对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;将确定构型后的(S)-NNAL或(R)-NNAL用乙腈溶解抽干,(S)-⑴-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐进行衍生化,通过保留时间确定衍生化后的⑶-NNAL-(S)-⑴-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-⑴-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的色谱峰。外消旋体NNAL标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1。以HPLC-MS-MS色谱图中⑶-NNAL- (S)-⑴-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的浓度与⑶-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度之比为横坐标,以色谱图中⑶-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-a -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积之比为纵坐标,建立⑶-NNAL-(S)-⑴-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线,以同样方法建立(R) -NNAL- (S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线。表Irac-NNAl和氘代rac_NNAL_甲基_d3的混合标准溶液
权利要求
1.尿液中(S)-NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其特征在于该方法包括以下的步骤: ①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照,或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3- (S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照; ②配制含有rac-NNAL和氣代rac_NNAL_甲基_d3的混合标准溶液,再进行Mosher衍生化,然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间,采用内标法分别建立(S) -NNAL- (S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL_(S)-(+)-a -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线; ③将在室温下解冻后的尿液样品摇勻,准确移取IOmL于50mL试管中,加入rac-NNAL-甲基_d3溶液,再用MIP-NNAL固相萃取小柱净化,淋洗后洗脱,干燥过滤后进行Mosher衍生化,浓缩至干,再用7/3的乙腈/水溶解后上HPLC-MS-MS检测。
2.根据权利要求1所述的尿液中(S)-NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其特征在于在分析检测尿样中尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL时进行Mosher衍生化,并使用rac-NNAL-甲基-d3作为内标。
3.根据权利要求1所述的尿液中(S)-NNAL和(R) -NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其特征在于使用微波辅助萃取仪在37°C对尿样进行恒温酶解。
4.根据权利要求1所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其特征在于向尿液样品加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液(pH6.4,50mM)和β -葡糖苷酸酶混匀后置入恒温振荡器或微波辅助萃取仪中在37°C恒温酶解,再将酶解后的尿样经过MIP-NNAL固相萃取小柱净化,淋洗后用二氯甲烷洗脱,力口入无水硫酸钠干燥后过滤,减压浓缩至干,加入三乙基胺无水乙腈溶液、(s)-(+)-a-甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液,衍生化后再对样品进行HPLC-MS-MS分析,进而换算出尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量。
全文摘要
尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法,使用衍生化后HPLC-MS-MS法测定尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL,包括用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照,或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照;配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液,再进行Mosher衍生化,然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;最后进行尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL检测。该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的优点。
文档编号G01N30/06GK103149297SQ20131006597
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者蒋举兴, 段焰青, 王明锋, 夏建军, 刘亚, 张敏 申请人:红云红河烟草(集团)有限责任公司