专利名称：黄瓜粗线期染色体的制片方法
技术领域：
本发明公开了黄瓜粗线期染色体的制片方法，专用于制备黄瓜的粗线期染色体，有利于开展黄瓜的细胞学研究，属于植物生物技术领域。
背景技术：
黄瓜(Cucumis sativus L., 2n = 14)是葫芦科黄瓜属一年生蔓生草本植物,起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，在我国已有2000多年的栽培历史。黄瓜食用方便，富含维生素C以及多种有益矿物质，是我国的主栽蔬菜作物之一，对提高人民生活水平、满足蔬菜周年供应发挥了巨大作用。我国是世界上最大的黄瓜生产和消费国，据统计，我国黄瓜(包括腌溃用小黄瓜)的栽培面积和产量呈逐年增加的趋势。利用黄瓜的粗线期染色体进行制片，是近年来细胞学领域的一大重要进展。然而，由于黄瓜的染色体小、细胞质浓厚、染色能力弱、异染色质少等因素的影响，很难获得形态清晰的粗线期染色体分裂相。另外，现有技术压片法以及冻片法制作黄瓜粗线期染色体，虽然能得到分散度高的染色体，但染色体的结构不明显，无法观察到染色体上的异染色质区和着丝粒等的位置，并且在压片过程中易导致染色体的断裂。目前，仅有少数的报道中是利用黄瓜粗线期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交。针对以往的利用黄瓜的粗线期染色体进行制片时，其染色体缠绕严重，并且花药的利用率低等不足，我们通过改进制片过程，提出本技术，能获得染色体分散良好、结构清晰的粗线期制片，并且利用一个花药能制备3-4张粗线期染色体形态良好的片子，提高了黄瓜花药的利用效率。因为粗线期在染色体减数分裂过程中占的时期极短，找到处于合适时期的花药较费时间，本技术在花药利用率上的提高，改善了这方面的不足。
发明内容
技术问题本发明黄瓜粗线期染色体的制片方法的目的，是针对以往黄瓜粗线期染色体制片时染色体缠严重，染色体形态不清晰等，黄瓜花药利用率低等缺陷，发明能制备分散度高的黄瓜粗线期染色体，并且提高了黄瓜花药的利用率，为制作高精密的黄瓜染色体的物理图谱奠定了基础，加快了黄瓜的细胞学研究进展。技术方案本发明所提供的黄瓜粗线期染色体的制片，其特征在于:得到了分散度良好的粗线期染色体，提高了了黄瓜花药的利用率。上述黄瓜粗线期染色体，是通过以下方法获得的:在黄瓜植株盛花前期和盛花期取适当大小的花蕾，放入体积比为3: I的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定备用。取出固定好的花蕾，剥出花药，取其四分之一的花药，用醋酸直接压片法制片，在普通光学显微镜下进行观察是否处于粗线期。
若其处于粗线期，则将同一花蕾其余所有花药放入1.5ml的离心管中，加入(纤维素酶:果胶酶=4%: 2%)的混合酶液，37°C下酶解1.5小时。然后用冰冷的蒸馏水置换酶液，并在冰水中低渗后转入固定液中固定24h以上。取出其中一个花药，加入约IOOul的E: G固定液，吸打成花药悬浮液，吸出约30ul的含粗线期染色体的液体，涂于载玻片上，再加上IOOul的E: G固定液，在酒精灯上烧片。由于采用了上述方案，一个黄瓜花药能制作3-4张片子，大大提高了花药的利用率，并且粗线期染色体分散度高，形态好。有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果:I)黄瓜粗线期染色体(图1)进行制片，在靶信号的分辨率方面比黄瓜中期染色体(图2和3)进行制片要高得多。2)现有的技术压片后冻片得到的黄瓜粗线期染色体互相缠绕，堆积在一起，并且无法分辨出染色体上的异染色质区和着丝粒位点(图4和5)。通过将花药酶解后涂片再烧片干燥的方法，使粗线期染色体在载玻片上分散开来，便于分辨黄瓜的各条粗线期染色体。3)在材料准备方面，可以直接在黄瓜植株上取花蕾，放入E: G固定液中固定备用即可，省去了在获取中期染色体时取黄瓜根尖，并进行预处理后再固定的一系列过程，节约了黄瓜种子，加快了实验进程。4)将酶解后的黄瓜单个花药取出，放入另一离心管中捣碎后再吸出一部分含有黄瓜粗线期染色体的悬浮液进行制片，与现有的压片法相比，一方面，使染色体在载玻片上分布均匀，避免了一张载玻片上杂质或间期核过多；另一方面，大大的提高了花药的利用率，也减少了利用花蕾拨出花药的时间，从而在一定程度上加快了实验的进度。
四
图1:利用本发明制作得到的黄瓜粗线期染色体，染色体的分散度高，能清晰的分辨出每条染色体，也能直接观察到染色体上染色较深的异染色质区。图2:多个黄瓜四号染色体上的靶信号在中期染色体上的分布，由于染色体粗短，无法分辨出多个信号的具体位置和排列顺序。图3:多个黄瓜四号染色体上的靶信号在粗线期染色体上的分布，能清晰的分辨出目标信号在染色体上的分布，也可以观察出探针在染色体上的排列顺序。图4:现有技术压片后冻片制得的黄瓜粗线期染色体，染色体易断裂，且无法分辨染色体上的异染色质区及着丝粒位点。图5:现有技术压片后冻片制得的黄瓜粗线期染色体，染色体缠绕堆积在一起。
五具体实施例方式本发明黄瓜粗线期染色体制片的实施程序包括:(I)材料准备:在黄瓜植株盛花前期和盛花期取适当大小的花蕾，放入体积比为
3: I的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定至少24小时，超过一周的话可将花蕾换到70%的乙醇中，备用。
(2)挑选处于粗线期时期的花药:取出一个固定好的花蕾，在显微镜下分离出花药，取其四分之一的花药放在干净的载玻片上，加几滴45%的醋酸进行软化，用镊子轻轻敲碎花药，盖上盖玻片，轻轻的压片，然后在普通光学相差显微镜下进行观察，若观察到其染色体处于粗线期，则将剩下的花药放入1.5ml的离心管中，加入少量E: G固定液，4°C保存备用。(3)花药酶解:固定好的粗线期的花药，用蒸馏水洗2篇，然后加入混合酶液(纤维素酶:果胶酶=4%: 2% )，37°C下酶解1.5小时。小心地吸出酶液，加入约Iml的蒸馏水水，冰上放置5-10min，吸出蒸馏水，加入约Iml的E: G固定液，冰上放置lOmin。(4)制片:取出酶解好的其中的一个花药，放入另一新的1.5ml离心管中，加入约IOOul的E: G固定液，将花药捣碎，吸出约30ul的含粗线期染色体的液体，涂于载玻片上，再加上IOOul的E: G固定液，在酒精灯上烧片干燥制片。
权利要求
1.利用黄瓜粗线期染色体进行制片，其特征在于: 得到了分散度很高、且染色质结构特征明显的粗线期染色体，提高了黄瓜花药的利用率。
2.根据权利要求1所述的得到的分散度高和形态结构特征明显的黄瓜粗线期染色体，是通过以下方法获得的: 1)在黄瓜植株处于盛花期或盛花前期时，采摘花蕾，用E: G(乙醇:冰醋酸体积比=3: I)固定液固定24小时以上； 2)从固定好的花蕾中分离出花药，45%醋酸压片，临时片在OlympusBX41相差显微镜下观察，选择处于粗线期的花蕾，将剩余的花药取出用于下一步酶解； 3)用含有4%的纤维素酶和2%的果胶酶的混合酶液酶解处于粗线期状态的黄瓜花药，将酶解好的花药在冰水中后低渗30分钟，然后在E: G固定液中固定24h以上； 4)取酶解好的花药，加入适量固定液制成悬浊液涂片，再利用火焰干燥法制片，镜检，挑选染色体分散度高的载玻片备用。
3.根据权利要求1所述的提高了黄瓜花药的利用率，是由于将黄瓜酶解好的一个花药在适量E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中捣碎后吸取一定量的悬浮液进行涂片，通过这种方法，一个花药可以制作3-4张染色体载玻片，与以往的一个花药制作一张染色体载玻片相t匕，大大提高了黄瓜花药的利用率。
全文摘要
本发明公开了一种黄瓜减数分裂粗线期染色体制片的方法，它是取黄瓜盛花期植株上的花蕾，放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定，剥开花蕾，取处于减数分裂粗线期的花药用纤维素酶和果胶酶进行酶解，取酶解好的一个花药在适量E∶G固定液中捣碎，吸取悬浮液涂片，然后用火焰干燥法制片。本发明采用涂片后再火焰干燥的方法，不仅可以制得分散度高，形态好的粗线期染色体，而且提高了黄瓜花药的利用率；更重要的是，其所得的粗线期染色体制片可直接用于荧光原位杂交，为黄瓜的细胞学研究提供了可靠的保证。
文档编号G01N1/28GK103115811SQ20131008100
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者娄群峰, 何玉华, 陈劲枫, 贾利, 李季 申请人:南京农业大学