专利名称：邻苯二甲酸二丁酯快速检测试剂盒的制备及检测方法
技术领域：
本发明涉及分析检测技术领域，更具体地讲，涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)的酶联免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术：
邻苯二甲酸酯类(PAEs)是增塑剂的主体，广泛应用于农膜、黏合剂、服装、农药、肥料、油漆、化妆品、儿童玩具等行业，具有三致(致癌、致畸、致突)作用，属于环境内分泌干扰物，是环境中常见的痕量有机污染物之一。最常使用的为邻苯二甲酸二乙酯(DEP)JP苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DHEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)等。这几种化合物已被美国国家环保局(USEPA)列为“优先监控污染物”。中国已将DMP、DBP、D0P列入优先控制污染物黑名单。《国家饮用水标准》(GB5749-2006)要求DOP < 0.008mg/L,DBP < 0.003mg/L,DEP < 0.3mg/L。《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》(GB9685-2008)规定食品、食品添加剂中的DOP < 1.5mg/kg、DINP < 9.0mg/kg>DBP < 0.3mg/kg。由此可见,急需研制出方便、快捷、检出限低的DBP测试方法已迫在 眉睫。目前最引起广泛关注的是DBP的生殖毒性和发育毒性(包括胚胎毒性)。美国NTP的一系列研究表明，DBP可致雄性啮齿类动物睾丸标志酶活性下降、重量减轻、曲细精管变萎缩、生殖道畸形等。2006年11月起,DBP被列入California Proposition65 (1986)可疑致畸物清单中，是一种可疑的内分泌干扰素，曾用在指甲油中。所有主要生产商都从2006年秋季开始减少这种物质在指甲油中的使用。DBP在儿童玩具和儿童保育用品中被永久禁止使用超过IOOOppm的浓度,在《2008年消费品安全改善法》(Consumer Product SafetyImprovement Act of 2008, CPSIA)中sectionl08已有规定。DBP已广泛渗透到人类生活的各个领域，所带来的危害逐步被认可，因此DBP测试方法及测试技术的研究也在逐步的深入。DBP与其他邻苯二甲酸酯一样，能引起中枢神经和周围神经系统的功能性变化，进一步引起组织上的改变，有趋肝性，可引起轻度致敏作用。对人:最敏感的人可嗅到的阈浓度为0.00026mg/L，对眼的光感反射作用的阈浓度为0.00016mg/L，对脑生物电活动的阈浓度为0.00011 0.00012mg/L。对皮肤和眼睛的作用:可经完整皮肤吸收少量；皮肤及眼粘膜一次接触后，并不引起刺激作用，而反复接触则可见到严重的刺激。某些实验资料表明，它可引起烃度的致敏作用。对动物:小白鼠吸入2小时气雾剂的LD50 = 25mg/L。中毒期间可见对眼粘膜及上呼吸道粘膜的强烈刺激，呼吸困难，共济失调，后肢麻痹；部分动物呈现浅表的麻醉，阵挛性惊厥。DBP还具有中等程度的蓄积作用和轻度刺激作用。因此建立简便、快捷的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)检测方法显得尤为重要。近年来国内外对食品塑料包装材料中PAEs分析比较重视，研究较多，主要是提高检测效率。其中前处理技术主要有净化体积阻滞色谱(SEC)、凝胶色谱(GPC)、超临界萃取(SFE)、固相萃取(SPE)、加速容积萃取(ASE);测试技术主要采用液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱发(LC-MS)、气相色谱发(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等，但检测费用昂贵，需要专业人员操作，样品前处理繁琐，难以进行批量处理，很难满足酒水、饮料行业快速诊断的需求。为此，研发灵敏度高、检测线低、操作简便的快速诊断试剂盒显得极为迫切。对城市污水和工业废水中邻苯二甲酸酯类物质的测定已有不少报道。然而，这些内分泌干扰物在饮用水中的浓度通常在ng/L甚至更低，通常的气相色谱和液相色谱方法由于灵敏度有限难于检测。常用的方法是经过溶剂萃取等富集手段后，采用GC/MS或GC/MS-MS测定。这种方法用于测定极性较强的酚类和高沸点的组分时，往往需要进行烦琐的前处理过程，难于适应快速分析的需要。随着生物技术的不断发展，免疫分析越来越受青睐，但国内外有关免疫分析检测邻苯二甲酸酯类的较少。免疫分析具有特异性强，灵敏度高，方便快捷，分析容量大检测成本低，安全可靠等优点可满足简单、快速、灵敏检测的需要。因此，开发了快速检测邻苯二甲酸二丁酯试剂盒。本试剂盒的灵敏度可达0.09ppm，在低浓度的饮用水、饮料、酒类的检测中很占优势。
发明内容
为了检测在酒水中常见增塑剂污染现状，解决现有技术存在的不足，本发明提供一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒， 同时提供其制备方法及检测方法。该方法简捷、快速、准确、灵敏，检测限和适用范围完全满足目前检测限量的要求。本发明的一个目的是提供一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。试剂盒的实现形式:其中，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，所述DBP抗试剂为DBP抗体，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，所述包被液为碳酸盐缓冲液，所述酶稀释工作液为含TWeen20的PBS溶液，所述终止液含浓硫酸，所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。优选地，所述抗原为邻苯二甲酸二丁酯的高亲和力的完全抗原优选地，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的DBP抗抗体优选地，DBP酶标物的浓度:250ng/mL优选地，DBP抗体浓度:200ng/ml优选地，样品稀释液:PH9.6所述底物显色液含有:四甲基联苯胺(TMB)所述包被液含有:碳酸钠0.1 0.3%碳酸氢钠0.2 0.5%PH8.5 10优选地，所述包被液含有:碳酸钠0.15%碳酸氢钠0.30%
PH9.6所述酶稀释工作液含有:Teen20PBS优选地，所述酶稀释工作液含有:含0.1 % Teen20 的 PBS 溶液所述终止液含有:硫酸5% 25%优选地，所述终止液含有:硫酸15%所述浓缩洗涤液含有:
权利要求
1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，所述DBP抗试剂为DBP抗体，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，所述包被液为碳酸盐缓冲液，所述酶稀释工作液为含TWeen20的PBS溶液，所述终止液含浓硫酸，所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述抗原为邻苯二甲酸二丁酯的高亲和力的完全抗原，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的DBP抗抗体，DBP酶标物的浓度:250ng/mL, DBP 抗体浓度:200ng/ml，样品稀释液:PH9.6。
4.根据权利要求1 3任一项所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有:
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有:
6.一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: A.制备固相载体:将0.05mol/L的包被液与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以适当比例混合，将混合液负载与载体上，用洗涤液清洗酶标板，拍干后用酶标板保护液封闭保护上述洗涤后的载体。
B.制备辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗:采用棋盘滴定法选择最佳的酶标记物的工作浓度。酶标二抗溶于酶稀释液中以制备二抗工作液。
C.制备DBP抗试剂:用一抗稀释液配制200ng/ml的一抗溶液。
D.制备底物显色液:以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。
E.制备浓缩洗涤液: 所述浓缩洗涤液含有:
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩液含有: Na2HPO4-12H20 2.2% (重量) NaH2PO4-2HzO 0.2% (重量) NaCl8.5% (重量)。
Tween200.5% (体积) Procl in 3000_1% (体积)
8.—种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法，所述方法包括以下步骤: A.样品前处理: a.瓶装或桶装饮用水 加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.5倍即为待测液。
b.瓶装或罐装饮料、酒 取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液Iml挥干，用Iml的35%的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。
B.使用前述试剂盒及微孔板酶标分析仪检测定量样品液邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
优选地，所述步骤B包括: a.加标准品或样品:加标准品或样品40 60ii L到对应微孔板中，加入DBP抗试剂40 60 ii L/孔，再加入酶标物40 60 ii L/孔，混匀，用盖板膜盖板后室温或37 V反应30 60min。
b.洗板:揭开膜后，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200 400u L/孔，充分洗涤数次，每隔30s,用吸水纸拍干。
c.显色:加入显色液50 IOOiiL/孔,用盖板膜盖板后室温或37°C反应10 15min。
d.测定:加入终止液40 60ii L/孔,混勻，设定酶标仪于450nm处,测定每孔OD值。
e.结果判定:在微孔板酶标仪上测定OD值，与根据标准品OD值的标准曲线对比，确定样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤B中反应温度为37°C，所述DBP标准品或样品的加入体积50 u I/孔,所述DBP抗试剂的加入体积为50 u I/孔,所述酶标物加入体积为50 u L/孔，所述显色液的加入体积为100 u L/孔，所述洗涤工作液加入体积为300 u L/孔，所述终止液的加入体积为50 u L/孔，所述反应时间40min，所述显色时间IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种检测邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)的酶联免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。本发明还公开了一种邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫分析测定试剂盒的制备方法及检测方法。使用本发明制备的邻苯二甲酸二丁酯试剂盒，具有操作简单，灵敏度高，特异性好，线性好等特点。
文档编号G01N21/63GK103226144SQ20131008721
公开日2013年7月31日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者时国庆, 李谷丰, 孙清 申请人:北京普赞生物技术有限公司