专利名称：一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，属于植物生理生态学领域。
背景技术：
化感作用的英文为“Allelopathy”，它源于希腊语“Allelon (相互)”和uPathos (损害、妨碍)”。植物化感作用的理论是1937年由德国科学家H.Molish第一次提出，他把化感作用定义为:所有类型植物(含微生物)之间生物化学物质的相互作用。但是Molish认为，这种相互作用包括有害和有益两个方面。20世纪70年代中期E.L.Rice根据H.Molish的定义和对植物化感作用的进一步研究，界定植物化感作用是指植物(含微生物)通过释放到环境中的化学物质产生对其他植物(含微生物)的直接或间接的有害作用。Rice的定义中的化感作用物质是由植物所释放的化学物质，并强调了化感作用的结果对其他植物或微生物均是有害的。近年来，研究表明，化感物质作用的对象不仅仅是其他植物，有时甚至是同种植物。而化感作用的结果不仅包括有害的，同时也包括一些相互促进的效果。因此，又有人把化感作用称之为植物的相生相克。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中，将化感作用给出了较完整的定义:植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用。现在这个定义已被广泛的接受。化感物质(Allelochemical)是生物体内产生的非营养性物质，能影响其他植物生长、发育、行为或种群的关系，作为化感作用的媒介，其主要是植物的次生代谢物质。植物化感作用的媒介是化学物质，被称为“化感物质”。孔垂华提到“Allelochemical”是指植物所产生并影响其他生物生长、行为和种群的化学物质，不仅包括植物间的化学作用物质，也包括植物和动物间的化学作用物质，而且这些化学物质并没有被要求必须进入环境，也可以在体内进行。现已发现，许多化感物质不仅对植物，而且对微生物、动物特别是昆虫都有作用。叶绿素荧光分析具有观 测手续简便，获得结果迅速，反应灵敏，可以定量，对植物无破坏、少干扰的特点。它既可以用于叶绿体、叶片，也可以遥感用于群体、群落。它既是室内光合基础研究的先进工具，也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。现在人们可以通过叶绿素荧光分析估计量子效率、光合能力，利用荧光参数计算光合电子传递速率、胞间CO2浓度，并且试图利用荧光参数快速筛选遗传变异的植物。有人甚至预言，将来荧光分析可能会代替气体交换测定。20世纪80年代以来，调制荧光仪，特别是便携式荧光仪的商品化，使荧光分析在光合作用研究中得到这样广泛的应用。现有用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法主要存有验证效率低，判断不准等缺陷。
发明内容
本发明提出的是一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其目的旨在快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对植物光合作用的影响。本发明的技术解决方案:一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，包括如下步骤:一、植物叶绿素荧光的数据收集与分析；二、化感作用对植物叶绿素变化的验证。本发明的优点:可快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对植物光合作用的影响。
具体实施方式
实施例用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，包括如下步骤:
一、植物叶绿素荧光的数据收集与分析；
二、化感作用对植物叶绿素变化的验证。所述的步骤一、化感作用植物叶绿素荧光的数据收集与分析；具体包括，
1、实验材料:
基础型调制型叶绿素突光仪(Junior-Pam, Heinz Walz GmbH, D91090, Effeltrich)；一次性塑料培养皿15皿；预培养20天的井栏边草配子体；
2、实验处理设计:
1)取预培养20天的井栏边草配子体，放入IOmL设置质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及0%的根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；实验时间为10天，在第2、4、6、8、10天进行叶绿素荧光检测；
2)组装Junior-Pam突光仪:将光纤的一端插到Junior-PAM主机的光纤接口，轻轻的将光纤插到底，锁紧；将光纤另一端插到磁性叶夹，调节光纤末端到样品的距离为Imm ；用USB线将Junior-PAM主机和电脑(支持Windows 7)连接好；启动WinControl-3软件,软件启动后自动搜索仪器接口，搜索成功后直接进入WinControl-3主界面；
3)设置光化光光强(PAR)为66μ mo I photons.m_2.s-1 ;数据采样时间为2分钟；数据采样频率为5s/次；
4)将装有配子体的培养皿用黑色布料覆盖，暗处理5分钟；
5)用镊子取出一枚配子体，放入磁性叶夹中，固定，使用WinControl-3软件开始记录；记录数据内容为
固定突光Fo:当光系统II反应中心都处于开放状态时的最小突光值；
最大荧光产量Fm:暗适应后执行饱和脉冲当光系统II反应中心都处于关闭状态时的最大突光产量；
光下最小突光值Fo’ ；
光下最大荧光Fm’:光下执行饱和脉冲当光系统II反应中心都处于关闭状态时的最大突光产量；
中执行饱和脉冲前的实时突光产量F’ ；
沼泽模型qP和湖泊模型qL:光化学淬灭系数；基于跨膜质子梯度qN和玉米黄质梯度模型NPQ ;非光化学淬灭参数；
光系统II调节非能量耗散的量子产量Φ 和光系统II调节能量耗散的量子产量Φ.:非光化学淬灭的量子产量；
相对电子传递速率ETR;
实际光合量子产量ΦΚΙΙ ;
6)2分钟后，脉冲停止，保存数据；
7)选取具有代表性的5个参数进行分析:实际光合量子产量ΦΡΜΙ、相对电子传递速率ETR、基于跨膜质子梯度qN、湖泊模型qL和最大荧光产量的比值参数=可变荧光量Fv/最大突光产量Fm ;式中的Fv=Fm-Fo ；
3、数据分析:
权利要求
1.一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是该方法包括如下步骤: 一、植物叶绿素荧光的数据收集与分析； 二、化感作用对植物叶绿素变化的验证。
2.根据权利要求1所述的一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤一、化感作用植物叶绿素荧光的数据收集与分析；具体包括， .1、实验材料: 基础型调制型叶绿素突光仪(Junior-Pam, Heinz Walz GmbH, D91090, Effeltrich)；一次性塑料培养皿15皿；预培养20天的井栏边草配子体； .2、实验处理设计: 1)取预培养20天的井栏边草配子体，放入IOmL设置质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及0%的根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；实验时间为10天，在第2、4、6、8、10天进行叶绿素荧光检测； 2)组装Junior-Pam突光仪:将光纤的一端插到Junior-PAM主机的光纤接口，轻轻的将光纤插到底，锁紧；将光纤另一端插到磁性叶夹，调节光纤末端到样品的距离为Imm ；用USB线将Junior-PAM主机和电脑(支持Windows 7)连接好；启动WinControl_3软件,软件启动后自动搜索仪器接口，搜索成功后直接进入WinControl-3主界面； 3)设置光化光光 强PAR为66μ mo I photons.m_2.s—1 ;数据采样时间为2分钟；数据采样频率为5s/次； 4)将装有配子体的培养皿用黑色布料覆盖，暗处理5分钟； 5)用镊子取出一枚配子体，放入磁性叶夹中，固定，使用WinControl-3软件开始记录；记录数据内容为 固定突光Fo:当光系统II反应中心都处于开放状态时的最小突光值； 最大荧光产量Fm:暗适应后执行饱和脉冲当光系统II反应中心都处于关闭状态时的最大突光产量； 光下最小突光值Fo’ ； 光下最大荧光Fm’:光下执行饱和脉冲当光系统II反应中心都处于关闭状态时的最大突光产量； 中执行饱和脉冲前的实时突光产量F’ ； 沼泽模型qP和湖泊模型qL:光化学淬灭系数； 基于跨膜质子梯度qN和玉米黄质梯度模型NPQ ;非光化学淬灭参数； 光系统II调节非能量耗散的量子产量Φ 和光系统II调节能量耗散的量子产量Φ.:非光化学淬灭的量子产量； 相对电子传递速率ETR; 实际光合量子产量ΦΚΙΙ ; 6)2分钟后，脉冲停止，保存数据； 7)选取具有代表性的5个参数进行分析:实际光合量子产量ΦΡΜΙ、相对电子传递速率ETR、基于跨膜质子梯度qN、湖泊模型qL和最大荧光产量的比值参数=可变荧光量Fv/最大突光产量Fm ;式中的Fv=Fm-Fo ；.3、数据分析: (1)实际光合量子产量分析，实际光合量子产量在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的实际合量子产量没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，实际光合量子产量基本呈现12.5%>25%>50%>100%,即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高实际光合量子产量呈下降的趋势，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势； (2)相对电子传递速率ETR值的分析，相对电子传递速率ETR值在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的相对电子传递速率没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，相对电子传递速率基本呈现12.5%>25%>50%>100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高相对电子传递速率下降的趋势，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势； ( 3)非光化学淬灭参数qN的分析，非光化学淬灭参数qN是基于跨膜质子梯度和玉米黄质的非光化学淬灭相关性模型，反应叶绿素热耗散引起的荧光淬灭，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的非光化学淬灭参数qN没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，非光化学淬灭参数qN基本呈现12.5%〈25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高非光化学淬灭参数qN呈上升的趋势，说明三叶鬼针草根系分泌物能增加叶绿素的热耗散，造成光合效率降低，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势； ( 4)光化学淬灭系数qL的分析，光化学淬灭系数qL是基于湖泊模型的光化学淬灭系数，反应了 PSII反应中心的开放程度，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的光化学淬灭系数qL没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，光化学淬灭系数qL基本呈现12.5%>25%>50%>100%,即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高光化学淬灭系数qL呈下降的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物对井栏边草配子体光系统II反应中心产生抑制作用，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势； ( 5)比值参数Fv/Fm的分析，比值参数Fv/Fm体现了光系统II的最大量子产量，反应了植物的潜在最大光合能力和光合效率，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的比值参数Fv/Fm没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，比值参数Fv/Fm基本呈现12.5%>25%>50%>100%,即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高比值参数Fv/Fm呈下降的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物能减少井栏边草配子体的最大量子产量，并且能抑制井栏边草配子体的光合效率，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势。
3.根据权利要求1所述的一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤二、化感作用对植物叶绿素变化的验证，具体包括:.1、实验步骤: ( 1)取100%、50%、25%、12.5%以及0%的根系分泌物的水浸液的配子体0.025g，用无水乙醇-丙酮=1:1的混合液浸泡10h，至配子体完全变为无色； (2)使用可见光分光 光度仪(SP-2100)测定配子体的叶绿素提取液在470nm、647nm和663nm处的吸光值；.2、数据分析: 1)计算公式:叶绿素 a 含量(Chla) =12.21 X OD664 — 2.81 X OD647 ；叶绿素 b 含量(Chlb) =20.13 X OD647 — 5.03 X OD664 ；类胡萝卜素含量(Car) = (1000 X OD470 — 3.27Chla — 104Chlb)/229 ； 总叶绿素量=(叶绿素a+叶绿素b+类胡萝卜素)X 5/1000/0.025 ； 2)分析叶绿素a和叶绿素b与时间的变化，根据叶绿素a和叶绿素b与时间的变化能推断，三叶鬼针草根系分泌物对井栏边草配子体的叶绿素a和叶绿素b呈现随浓度和时间的增加相应减少的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势，同时也对叶绿素荧光参数分析进行了验证； 3)分析类胡萝卜素的含量与三叶鬼针草浓度和时间的变化，根据类胡萝卜素的含量与三叶鬼针草浓度和时间的变化能推断，随浓度和时间的推移，类胡萝卜素的含量呈下降趋势； 4)分析叶绿素 总量，从叶绿素总量的分析能得证三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势，与叶绿素荧光分析实验结论相同，同时也对叶绿素荧光参数分析进行了比对和验证。
全文摘要
本发明是一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，包括如下步骤一、植物叶绿素荧光的数据收集与分析；二、化感作用对植物叶绿素变化的验证。本发明的优点可快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对植物光合作用的影响。
文档编号G01N21/64GK103234947SQ20131012449
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者张开梅, 沈羽, 方炎明 申请人:南京林业大学