专利名称：一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法
技术领域：
本发明涉及疫苗质量检测技术，具体涉及一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法。
背景技术：
目前，禽流感在全世界范围内的流行给养禽业以严重打击，同时也对公共卫生事业构成重大威胁。防控禽流感已经成为国际社会的共同责任，世界各国均给予了高度重视，投入大量的人力物力进行防控禽流感的研究。接种禽流感疫苗被证实是用于禽流感疫情预防和控制的最有效的方法。但事实上，近几年来对禽流感免疫监测的结果显示，仍有不少免疫群体抗体合格率较低，在一些免疫禽群体中仍然可以分离到病毒。究其主要原因，可能是疫苗本身所含抗原效价不高，或者是由于运输保存等条件的限制导致抗原衰减，此外，流行毒株抗原性与疫苗株差异较大也可能导致疫苗免疫保护效果不理想。目前，对于禽流感疫苗效力的检测，主要由生产厂家按照国家相关要求与规程进行质检。由于疫苗质量标准中规定效检必须免疫SPF鸡，对动物与实验设施要求较高，需要SPF动物房及专用隔离器，而且耗时长(21天以上)、资金花费大，多数生产厂家只能进行少数的抽检。多数养禽业疫苗用户没有相关的检测能力，只能通过对禽群免疫接种后的抗体检测情况和保护情况来衡量实际免疫效果。只有疫苗中含有足够的HA抗原，才能保证其免疫后产生足够的抗体水平。此外，不同谱系毒株抗原性 差异大，诱导的中和抗体通常难以有效交叉保护。免疫疫苗或感染病毒后的血清抗体只对相应谱系的抗原具有最高的HI滴度。以上这些特点为评价疫苗质量提供了重要的理论依据。禽流感油乳剂灭活疫苗的制作过程是将灭活病毒抗原水相与白油等佐剂乳化制成稳定的油包水(W/0)油乳剂疫苗。有报道用三氯甲烷作为破乳剂进行禽流感油乳剂灭活疫苗HA的效价检测，该方法存在以下几点弊端:1、三氯甲烷可使蛋白质变性，损害HA蛋白抗原性，影响HA效价的准确度；2、三氯甲烷在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气，不易安全存放；3、三氯甲烷作用于中枢神经系统，对心、肝、肾有损害，对人体具有致癌、致畸、致突变性；4、三氯甲烷对环境有危害，对水体可造成污染。还有报道利用有机溶剂苯甲醇、正戊醇、正己醇作为口蹄疫苗破乳剂，但这些有机溶剂也都存在有毒易燃、可使蛋白变性等影响HA效价直接测定的弊端。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其不破坏疫苗抗原的血凝效价与抗原性，能够准确快速测定禽流感油乳剂灭活疫苗成品的水相HA效价及分析其抗原性差异，所用试剂对人体和环境安全无毒害且价廉易取。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其特征在于包括以下步骤:
1)采用肉豆蘧异丙酯与禽流感油乳剂灭活疫苗充分振荡混均、离心，分离出水相层；
2)取步骤I)的禽流感油乳剂灭活疫苗水相，按照现有技术的血凝试验方法对疫苗水相进行HA效价检测；
3)按照现有技术的方法，根据步骤2)的疫苗水相HA效价检测结果，取步骤I)的禽流感油乳剂灭活疫苗水相配制成4HAU疫苗抗原稀释液；
4)按照现有技术的血凝抑制试验方法，利用步骤3)配制好的4HAU疫苗抗原稀释液进行血凝抑制实验，以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度为HI效价，依此比较疫苗成品所含抗原与疫苗标准抗原或者流行毒株抗原性差异。步骤I)禽流感油乳剂灭活疫苗与肉豆蘧酸异丙酯的体积比为1:0.5 1.5。步骤I)混匀、振荡过程使用漩涡振荡器剧烈振荡，时间为5min以上。步骤I)离心过程的转速为3500rpm以上，时间为5min以上。相比现有技术，本 发明的有益效果在于:
1、本发明采用肉豆蘧异丙酯作为破乳剂对禽流感油乳剂灭活疫苗成品进行破乳，不破坏疫苗抗原的血凝效价与抗原性，破乳得到的水相无需处理可直接用于HA和HI测定，且准确度高，保证了检测的快捷准确。2、本发明的方法在简单的实验条件下即可进行，无需将疫苗免疫SPF实验鸡，从而省去了长达21天的免疫抗体产生期和高标准的场地设施，大大降低了时间和资金成本；可在6小时内分析比较疫苗成品所含抗原效价及其与疫苗标准抗原或者流行毒株抗原性差异，方便广大养殖用户从不同来源疫苗中有针对性地选择优质高效的疫苗，并在使用疫苗前确定其抗效价，避免使用低效价疫苗，确保预期防控效果，同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的禽流感油乳剂灭活疫苗质量进行实时监控。3、本发明的方法所用肉豆蘧异丙酯本身为化妆品级表面活性剂，对人体和环境安全无毒害且价廉易取，疫苗破乳前后抗原水相HA效价高度一致，具有很好的重复性。
具体实施例方式下面通过具体实施例子对本发明一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法作进一步详细说明。实施例1
一、重组禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1亚型，Re — 6株)的抗原水相分离步骤I)取IOml重组禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1亚型，Re — 6株)，放入50ml离心管中，加入5 15ml肉豆蘧酸异丙酯，置于游涡振荡器剧烈振荡5分钟以上；
步骤2)以3500rpm以上的转速进行离心，时间为5分钟以上，可见油、水分离；
步骤3)分离出水相层约3ml。
二、取上述禽流感油乳剂灭活疫苗水相，按照现有技术的血凝试验方法对疫苗水相进行HA效价检测
I)在微量反应板的I孔 12孔均加入0.025 ml等渗磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，换滴头。2)吸取0.025ml待测疫苗水相加入第I孔，混匀。3)从第I孔吸取0.025ml疫苗水相加入第2孔，混匀后吸取0.025 ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之，换滴头。4)每孔再加入 0.025ml PBS。5)每孔均加入0.025ml体积分数为1%鸡红细胞悬液。6)振荡混匀，在室温(20°C -25°C)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4°C环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。7)结果判定:将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。三、按照现有技术的方法，根据步骤二的疫苗水相HA效价检测结果，取步骤一的禽流感油乳剂灭活疫苗水相配制成4HAU疫苗抗原稀释液,具体是:
根据HA试验结果，以完全血凝的病毒抗原最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀 释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64 (256除以4)。四、按照现有技术的血凝抑制试验方法，利用步骤三配制好的4HAU疫苗抗原稀释液进行血凝抑制实验，以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度为HI效价，具体是:
I)在微量反应板的I孔 11孔加入0.025ml PBS, H 12孔加入0.05ml PBS。2)吸取0.025ml血清加入第I孔内，充分混匀后吸0.025ml于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。3) I孔 11孔均加入含4HAU混匀的抗原液0.025ml，室温(约20°C)静置至少30mino4)每孔加入0.025ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min (室温约20°C，若环境温度太高可置4°C条件下进行)，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔
。5)结果判定
以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过I个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价等于41og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于51og2为阳性。
实施例2重组禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1亚型，Re — 6株)破乳前后抗原水相HA效价测定比较
步骤I)取同一批次已知HA效价的H5亚型Re-6株重组禽流感疫苗灭活后半成品胚液，分别用适量pH 7.2,0.01mol/L等渗磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)稀释到HA效价分别为9 log2、8 log2、7 log2、6 log2，编号依次为IA 4A，分别将其按照重组禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1亚型，Re-6株)制造及检验试行规程规定的配方和工艺制备4批疫苗，编号依次为1# 4# ο步骤2)将编号依次为1# 4#的4批疫苗分别按照实施例1所述方法进行破乳；取破乳后得到的水相，编号依次为IB 4B，采用实施例1的血凝(HA)试验方法，对4份水相进行HA效价检测，则计算出破乳后编号依次为IB 4B的水相HA效价分别为9 log2、8log2、7 log2、6 log2,与配制疫苗所用编号依次为IA 4A的水相HA效价完全一致。由此可见，疫苗破乳前后抗原水相HA效价高度一致，具有很好的重复性，说明本方法处理不影响疫苗成品中HA蛋白的血凝活性。
实施例3禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原性比较分析
步骤I)取市售H5亚型Re-6株重组禽流感疫苗、H5亚型Re_5株重组禽流感疫苗、H5亚型Re-1株重组禽流感疫苗以及H9型Re-2株重组禽流感疫苗各一瓶，分别按照实施例1所述方法进行破乳，分别得到编号为Re-6、Re-5、Re-U Re-2的疫苗水相。步骤2)按实施例1所述方法测定Re-6、Re-5, Re-1、Re-2的疫苗水相的HA效价分别是 9 log2、8 log2、8 log2、9 log2。步骤3)根据疫苗水相的HA效价检测结果，采用实施例1的4HAU疫苗抗原稀释液配制方法，分别取Re-6、Re-5、Re-1、Re-2的疫苗水相以及禽流感病毒H5N1亚型Re_6株血凝抑制标准抗原进行稀释，配制成相应的4HAU抗原。步骤4)从养殖场取采集免疫禽流感Re-6株疫苗后第21天的免疫鸡血清共计10份，分别利用上述5种配制好的4HAU的抗原，按照实施I所述的血凝抑制(HI)试验方法对10份血清进行HI测定，结果见表I。
表I不同来源4HAU抗原对Re-6株疫苗免疫鸡后21天血清HI检测结果
权利要求
1.一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)采用肉豆蘧异丙酯与禽流感油乳剂灭活疫苗充分振荡混均、离心，分离出水相层； 2)取步骤I)的禽流感油乳剂灭活疫苗水相，按照现有技术的血凝试验方法对疫苗水相进行HA效价检测； 3)按照现有技术的方法，根据步骤2)的疫苗水相HA效价检测结果，取步骤I)的禽流感油乳剂灭活疫苗水相配制成4HAU疫苗抗原稀释液； 4)按照现有技术的血凝抑制试验方法，利用步骤3)配制好的4HAU疫苗抗原稀释液进行血凝抑制实验，以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度为HI效价。
2.如权利要求1所述的禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其特征在于:步骤I)禽流感油乳剂灭活疫苗与肉豆蘧酸异丙酯的体积比为1:0.5 1.5。
3.如权利要求1所述的禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其特征在于:步骤I)振荡混匀过程使用漩涡振荡器剧烈振荡，时间为5min以上。
4.如权利要求1所述的禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其特征在于:步骤I)离心过程的转速为3500rpm 以上，时间为5min以上。
全文摘要
本发明公开了一种禽流感油乳剂灭活疫苗成品抗原快速检测方法，其包括以下步骤1)采用肉豆蔻异丙酯与禽流感油乳剂灭活疫苗充分振荡混均、离心，分离出水相层；2)对步骤1)的疫苗水相进行HA效价检测；3)根据步骤2)的疫苗水相HA效价检测结果，取步骤1)的禽流感油乳剂灭活疫苗水相配制成4HAU疫苗抗原稀释液；4)利用步骤3)配制好的4HAU疫苗抗原稀释液进行血凝抑制实验，以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度为HI效价。本发明不破坏疫苗抗原的血凝效价与抗原性，能够准确快速测定禽流感油乳剂灭活疫苗成品的水相HA效价及分析其抗原性差异，所用试剂对人体和环境安全无毒害且价廉易取。
文档编号G01N33/68GK103235139SQ201310124640
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者陈瑞爱, 赖汉漳, 刘玉鹏, 汤钦 申请人:肇庆大华农生物药品有限公司, 广东大华农动物保健品股份有限公司