专利名称：一种脑膜炎球菌多糖中ctab含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及测试分析领域，具体地涉及一种利用高校液相色谱测定脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。
背景技术：
CTAB，全称为十六烷基三甲基溴化铵，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在多糖纯化过程中，CTAB作为螯合剂使复合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而使人体受到危害。近年来，在生物制品申报过程中，国家规定应明确CTAB等有机物质残留量以降低制品风险。因此准确测定脑膜炎多糖原液中CTAB的残留量对疫苗生产有着重要影响，对疫苗产品质量控制具有重要的意义。目前，国内外尚无文献报道脑膜炎球菌多糖原液及脑膜炎球菌多糖疫苗中CTAB残留量的测定方法，因此如何对脑膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB进行检测尚不确定。
发明内容
本发明目的是提供一种快速而准确的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。为实现本发明目的，提供的测定方法包括以下步骤:取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。具体地，包括以下步骤:(I)制取CTAB标准溶液作为样I，其浓度标记为Cl ; (2)取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2 ; (3)样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱；(4)记录色谱图并进行积分计算；(5)根据公式计算样2中CTAB的浓度。其中，凝胶色谱柱为TSKgel G5000色谱柱。其原理是根据样品分子大小不同进行分离，CTAB与肺炎多糖分子大小间存在差异，可被有效分离。其中，流动相为(0.8-0.9%) NaCl溶液。其中，上样体积分别为20-100μ I ;洗脱流速为0.4-0.6ml/min。其中，在检测波长为214nm下记录色谱图。其中，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌中的任意一种。其中，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度:将CTAB标准溶液作为样I，其浓度标记为Cl ;将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样2 ； 根据公式(I )计算样2中CTAB的浓度:C2= (S2 + S1) XC1，其中，S2为样2对应的峰面积，SI为样I对应的峰面积；
根据公式(II)计算样2中CTAB的百分含量:F= (C2 + C0) X 100%，其中，CO为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。在本发明优选的实施方案中，检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的具体步骤为:
(I)精密制取CTAB标准溶液作为样I，其浓度标记为Cl ；(2)取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2 ；(3)充分平衡色谱柱后，将样I上样于凝胶色谱柱进行洗脱，记录色谱图:洗脱峰开始所对应时间标记为tl，洗脱峰结束所对应时间标记为t2 ；(4)对样I色谱图进行积分，积分窗口为从tl到t2，得到样I对应的峰面积为SI ；(5)将样2上样于高效凝胶色谱柱进行洗脱；(6)对样2色谱图进行积分，积分窗口为从tl到t2，得到样2对应的峰面积为S2 ；(7)根据公式(I):C2= (S2 + S1) XCl(I)计算样2中CTAB的浓度；(8)测定待检脑膜炎球菌多糖溶液中的多糖浓度，标记为CO ；(9)根据公式(II):F= (C2 + C0) X100%(II)计算样2中CTAB的百分含量。本发明根据CTAB分子与脑膜炎多糖分子间大小存在差异，利用二者在凝胶层析时的保留时间不同，采用高效液相色谱法将CTAB与脑膜炎球菌多糖分离，利用已知浓度的CTAB作为标准对照，从而准确测定脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量。本发明的有益效果为:本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法，当CTAB浓度在6.25-100 μ g/ml时，线性相关系数r大于0.9990，变异系数CV小于3%，平均回收率在98%以上，从而建立了评价脑膜炎球菌多糖原液质量的新方法。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1检测方法的考察1.1线性关系考察精密称取CTABlOmg，用0.85%NaCl溶解并定容至10ml，作为对照品贮备液(浓度为lmg/ml)。精密吸取CTAB对照品贮备液10ml，定容至IOOml容量瓶，作为对照品工作液(浓度为100 μ g/ml)。将对照品工作液依次稀释至浓度100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、
12.5 μ g/ml,6.25 μ g/ml，吸取不同浓度的对照品溶液，依次进样20 μ 1，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品溶液X (μ g/ml)为横坐标进行线性回归，得其回归方程。结果见表I。表I线性关 系试验结果
权利要求
1.一种脑膜炎球菌多糖中十六烷基三甲基溴化铵含量的测定方法，包括以下步骤:取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为TSKgelG5000色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相为0.8-0.9%NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上样体积为20-100μ I。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱流速为0.4-0.6ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱图在检测波长为214nm下记录。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌中的任意一种。
8.根据权利要求1 -7任一项所述的方法，其特征在于，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度: 将CTAB标准溶液作为样I，其浓度标记为Cl ;将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样2 ； 根据公式(I )计算样2中CTAB的浓度: C2= (S2 + S1) XC1，其中，S2为样2对应的峰面积，SI为样I对应的峰面积； 根据公式(II )计算样2中CTAB的百分含量: F= (C2 + C0) X 100%，其中，CO为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。
9.权利要求1-8任一项所述方法在检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的测定方法，包括以下步骤取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。
文档编号G01N30/02GK103245738SQ20131013613
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者王婷婷, 魏文进 申请人:北京民海生物科技有限公司