专利名称：基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多元生物检测芯片，具体是基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，属于多元生物检测技术领域。
背景技术：
目前有多种方法可以用于微粒子的操控，其原理和应用也不尽相同，以下是几种常见的控制粒子的方法:机械式控制方法、化学控制方法、激光控制方法、磁学控制方法、电场机制控制方法。磁分离技术需要加入一定的磁性材料，有一定的局限性和破坏性，并且步骤较为繁琐；化学分离技术往往有不可逆性和破坏性；而传统的介电泳分离技术虽然对分离对象没有破坏性，但是分离的速度效率低，无法满足人们现在的要求。行波电介泳分离技术是在传统电介泳技术的基础上，引进和利用了行波电介泳，使得分离更加的快速、高效，同时大大减少了实验设备的体积，使仪器更加的便捷。同时，在多元生物检测中，目前也主要是流式细胞仪等的检测仪器，这类多元检测虽然也能同时对多种检测样品进行检测，却无法起到分离的效果，从而使其在后续的检测研究中具有一定的局限性。微流控芯片(microfluidic),又称微型全分析系统(Miniaturized TotalAnalysis Systems, TAS)或芯片实验室(Lab-on_a-Chip),是通过分析化学、微机电加工(MEMS)、计算机、电子学、材料学及生物学、医学的交叉实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化和便携化。微流控芯片技术是指采用微细加工技术，在一块几平方厘米的芯片上制作出微通道网络结构和其他功能单元，把生物和化学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离和检测等基本操作单元集成或基本集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术。它的目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，且可多次使用，因此较生物芯片有更广泛的适用性及应用前景。它不仅使生物样品与试剂的消耗降低至纳升(nl)甚至皮升(Pl)级，而且使分析速度大大提高，分析费用大大降低，从而为分析测试技术普及到户外、家庭开辟了一条新路。它充分体现了当今分析设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。现已成为国内外生物化学、分析化学、分子毒理学、环境医学和预防医学等领域的研究热点。以微流体平台代替台式的化学分析主要有以下优点:I)微流控系统减少了无用流体的量一该量与具有大尺寸腔室和联接器的化学分析系统有关。2)微流控系统减少了所需要的化学分析和溶液的数量，因此对同样的分析，则由于节省分析中所用昂贵的化学药剂和生物样品而降低了成本。3)微电子式批量加工会降低复杂系统的成本。光刻和并行加工技术降低了制造复杂流体管道系统和反应网络的难度。4)微流控系统可达到高水平的多通道复用和并行操作，从而提高了化学和生物发现的效率。 微尺度流体部件不仅用于生物和化学分析中，还在其他领域得到了广泛应用。如正在试用的有:光通信、触摸显示器(盲文点字显示器)，IC芯片的冷却以及流体逻辑学。微流体还用于新颖的微制造和纳米制造。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高、样品需要量小，基于行波介电泳微颗粒分离的微流控生物芯片。技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，其特征在于:该生物芯片由一个封闭的一级通道和两个及以上的封闭的二级通道所组成；在一级通道的前端为上下左右对应的设有四片梯形电极的第一电极区，而在一级通道的后端为设有交替的分离电极的第二电极区，在第一电极区和第二电极区之间为一非电极区，在第二电极区的后端连接所述的二级通道，在每个二级通道外面设置有由激光发射器和接收器组成的计数装置，在每个二级通道后方设有一个出口 ；四片梯形电极中上下两片梯形电极所加电压的相位差为180°，左右两片梯形电极所加电压的相位差也为180° ;同一层的分离电极上的电压的相位差为90°，竖直方向上同一位置的上下两个分离电极电压的相位差为180°。一级通道长为1.2 2cm,分离电极长为0.8 1.1cm,梯形电极长0.2 0.4cm,二级通道宽为l/3mm,长为2cm。一级通道长为1.5cm,分离电极长为Icm,梯形电极长0.3cm。本发明是将与目标检测物反应后的载体流经检测芯片的由一级通道和二级通道形成的微通道，在受到微通道里行波介电泳力、传统介电泳力、重力、流体阻力等多种力的共同作用后进行分离，分离后的载体由一对激光发射器和接收器对其进行计数。如此，通过这一微流控生物检测芯片，我们可以直接从分离后的载体的大小、形状、材质等分辨目标检测物，进行编码，通过激光计数来确定目标检测物的量，从而实现多元生物检测。有益效果:根据本发明，利用上下加有微米级别电极的微通道，来产生行波介电泳力，从而对不同大小、材质、形状的载体进行分离，实现利用分离出来的载体对不同探针分子、目标检测物进行编码，通过二级微通道内的一对激光发射器和接受器对目标检测物进行定量检测。利用此多元生物检测芯片具有以下优点:(I)检测速度快:行波电介泳力强于载体在微通道里受到的其它力，使载体能在较快的时间和较短的距离分离开来；(2)多元化检测:可以通过改变电压的大小以及频率，增加二级通道来实现多种载体的分离；(3)样品需要量小:由于微通道和微球都是微米级的，因此可以实现纳升级的进样；(3)灵敏度、精度高:由于载体间细微的差别都将引起载体所受力的改变和不同，所以细微差别的载体也能进行分离；(4)芯片小型化:利用行波介电泳力能有效的降低分离距离，从而减小芯片尺寸；(5)可扩展性高:由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流控芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化。
本发明的目的是将充分利用多元生物芯片、介电泳技术和微流控芯片的优势，采用不同大小、形状、材质的微球固定不同的探针，与目标分子结合后，在微流控通道内进行分离检测，能更加高效、快速的对样品进行分离、定量计数，减小了装置的体积。本发明是基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测方法。它不但利用了简单、有效、精确的行波介电泳力，同时结合了微流控技术，是一种检测速度快、灵敏度高、样品需要量小的微流控生物芯片，在多元生物检测的过程中，还能进行分离样品，对后续的研究具有重大价值。
图1为本发明芯片的的俯视图。图2是本发明芯片梯形电极的布置示意图。图3是本发明芯片分离电极的布置示意图。图4为本发明芯片使用时，整个装置的结构示意图。以上的图中有:梯形电极1、分离电极2、进口 3、激光发射器(4、6、8)、激光接收器(5、7、9)、二级通道(10、11、12)、不同大小载体13、微蠕动泵和微注射器14、毛细管15、基片
16、可调信号发生器17、编码腔18、导线19。
具体实施例方式下面结合附图，对本发明作详细说明:本发明多元生物检测芯片如图1所示，由一个封闭的一级通道A和两个以上的封闭的二级通道B所组成；在本实施例中，二级通道为三个。在一级通道A的前端为上下左右对应的设有四片梯形电极I的第一电极区，见图2所示。而在一级通道A的后端为设有交替的分离电极2的第二电极区，参见图3。在第一电极区和第二电极区之间为一非电极区，在第二电极区的后端连接所述的二级通道B，在每个二级通道B外面设置有由激光发射器(4、6、8)和接收器(5、7、9)组成的计数装置，在每个二级通道B后方设有一个出口 ；四片梯形电极中上下两片梯形电极所加电压的相位差为180。，左右两片梯形电极所加电压的相位差也为180 ;同一层的分离电极上的电压的相位差为90 ,竖直方向上同一位置的上下两个分离电极电压的相位差为180°。当粒子进入一级通道以后受到上下梯形电极的作用，会排列在同一位置、同一高度；然后进入装有能产生行波介电泳力电极的通道，此时，由于同时受到传统介电泳力、行波电介泳力、重力、阻力等多种力的共同作用，不同大小、材料、性质的粒子将会发生不同大小的偏移。此处，传统介电泳力(Fdep)是由于电极间的梯度电场的大小不均而引起的力，被称为传统介电泳力；而行波介电泳力(twFDEP)是由于电极间相位角变化的不均匀电场产生的力，被称为行波介电泳力。我们在开始的梯形电极的上面电极分别加上相位为0°和180°的相同幅值的电压，下面电极分别加上相位为180。和O。的相同幅值的电压，如此，就会形成一个向中间挤的负介电泳力(nDEP)，相对于其他重力、阻力而言，nDEP更大，会把粒子挤到通道的中间，使所有粒子处于同一个位置。而在由第二电极区形成的分离通道里，分离通道的上下都有电极，同一侧面的分离电极上依次加上相位相差90。的相同幅值的正旋电压，上下两个相邻的分离电极相位差相差180°。当粒子经过分离电极通道后进入二级通道，在二级通道外面我们安装了一个激光发射器，其对面安装了一个接收器，用来对微粒进行计数，达到一个定量的分析。最后，在每个二级通道最后做一个收集装置，用以收集各种分离好的粒子，以便根据大小或形状进行编码。同时，如果需要对二级通道里的颗粒进行再次分离，同样可以根据第一通道进行连接，只需改变特定的电压幅值、频率等参数。本发明检测芯片检测时微颗粒在电场里会发生极化，从而会受到介电泳力的作用，同时我们有规律的改变电极上电压的频率以及相位，极化的微颗粒不但受到传统的介电泳力，还会受到一种新的力:行波介电泳力DEP。当微颗粒受到行波介电泳力、传统介电泳力、重力以及流体阻力等的多种作用，就会改变其运动轨迹，而不同的微颗粒的受力情况不同，这就导致了不同微颗粒的运动轨迹不同，从而进行了分离。对于在电场中无法极化的微颗粒，比如金属颗粒等非极化材料，我们可以对其表面进行修饰，从而是它能够在电场中极化，达到分离的效果。同时，在分离后的每个二级通道里，我们都安装了激光发射器以及接收器，使其不但能够分离微颗粒，同时还能对分离到的微颗粒进行计数，达到定量的分析检测。本发明能分离到微米、纳米等微小级别的微颗粒，并对其进行定量检测和分析。这使得这项技术不但可以在污水处理中得以应用，同时也能在生物检测、临床医学等领域中得到广泛的应用。研究细胞种类或是细胞变化时，可以应用本技术进行直接分离、定量计数，从而进行研究；而研究不同抗原抗体等多肽、蛋白质时，可以利用生物检测免疫微球等检测载体对抗原抗体等多肽、蛋白质进行分离、定量计数。这就使得本发明在多元生物检测中具有良好的应用前景。值得注意的是，由于我们是用于微颗粒的分离，所以需要把装置做的比较小，分离设备的整体长度也就几个厘米、宽度在几毫米左右，而通道内的高度也就几十微米，分离区的电极宽度也就几十微米，都达到较小的级别。我们以Kimble glass作为整体基片的材料，以SiO2光子晶体作为微球载体，以Cr和Au作为电极材料，在一定频率和电压的作用下具体的分离和编码，进行多元检测的步骤如下:I,微通道的制备:利用光刻技术在Kimble glass制造出宽为1mm、高为25um、长为
3.5cm的通道。其中，一级通道长为L 5cm,分离电极长为Icm,梯形电极长0.3cm, 二级通道宽为l/3mm,长为2cm。2，微电极的制备:利用微加工技术、光刻技术制作电极。微电极由两层构成，底层为Cr材料，厚度为30nm;其上渡了 Au，厚度为200nm。3，载体上固定探针:利用以上技术制作微流控芯片以后，我们以SiO2光子晶体作为编码载体，并在不同大小的微球上固定好不同的探针分子。4，微球载体与目标检测物的混合:在芯片外部将微球载体和目标检测物进行混合，使不同的目标检测物结合到不同探针的微球上。5，微流控芯片的连接:见可调信号发生器按前面所述的参数值对各个电极加电压和改变电压相位。同时，打开激光发射器和接收器对微球进行计数。值得注意的是，在对芯片加电压之前使芯片内的微通道充满微球载体和目标检测物混合液的溶剂，以防后后续实验时因微通道内缺少液体而使开始时粒子分离失败。6，混合液的注入:在芯片加电压后，将微球载体和目标检测物混合后的液体利用微蠕动泵驱动推动微注射器，将混合液注入到芯片入口处。7，编码，检测，分析:利用分离后微球的大小、形状进行编码，实现对目标检测物的检测和分析；利用激光发射器和接受器对微球计数，从而对目标检测物进行定量分析。对于电极上电压的施加，为了达到不同的控制作用，需要加入不同电压进行调控:首先，在梯形电压阶段，我们只需要把微颗粒控制在同一个位置，使得后续能更好的分离，所以我们所加的电压的相位是上下电极相位差为180°，左右电极相位差也为180。。再次，到了分离区，对于同一层的电极上的电压相位依次增加(减少)90。，而另一层电极也是如此，不过同时，竖直方向上同一位置上的上下两个电极相位差为180°。电压的幅值需要根据具体的实验参数做出合理的选择，如此，才能在分离区产生行波电介泳力，使得粒子高效、快速的分开。下面结合两个具体的检测实例，来说明本发明检测芯片的检测效果:1、以对红细胞和葡萄球菌进行分离实验设备①颗粒分离设备自制:我们采用的第一级通道的内通道宽为Imm,高为25um,长为1.4cm (其中梯形电极沿通道方向长度为0.3cm，分离区的电极宽为12.5um，与电极相间的空白区宽也为12.5um)；②可调信号发生器:用于调节电压幅值、频率、以及相位；③微蠕动泵和微注射器:用于控制液体的流速；④激光发射器和接收器:把光信号转换为脉冲，用以对颗粒计数。首先我们提供梯形电极幅值为24Vp_p、频率为500kHZ的电压，而分离区的电压幅值为12VP_P、频率为500kHZ，而电压的相位按上述要求改变。红细胞和葡萄球菌所在的溶液是低电导率的加入PBS缓冲液的D-甘醇露溶液，液体流速为4 μ 1/min。在上述条件下，红细胞明显向上偏移，而葡萄球菌则保持在中间移动。最后，红细胞通过上方的二级通道流出，而葡萄球菌由中间的二级通道流出。在颗粒流经二级通道时，通过激光发射器和接收器对其计数。通过最后的分析，可以得到，分离正确率达到了 98.7%，而计数正确率达到了99.2%，同时，分离的速度也是很快。2对同种材料、不同大小的微颗粒进行分离设备同上，此次实验分离的对象是不同大小的脂质体。我们采用:1)梯形电极上的电压幅值为24VP_P、频率为3MHZ ;2)而分离区上的电极的电压幅值为12VP_P、频率为3MHZ ；3)液体流速为6 μ 1/min的去离子水。实验结果表明:直径在一个范围内的粒子分离到同一个二级通道，比如直径为380nm-710nm以及2.lum-4.6um的粒子进入了上面的通道，并通过计数器对其进行了计数，其分离以及计数的正确率同样很高，分离速度也是很快。
权利要求
1.一种基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，其特征在于:该生物芯片由一个封闭的一级通道(A)和两个以上的封闭的二级通道(B)所组成；在一级通道(A)的前端为上下左右对应的设有四片梯形电极(I)的第一电极区，而在一级通道(A)的后端为设有交替的分离电极(2)的第二电极区，在第一电极区和第二电极区之间为一非电极区，在第二电极区的后端连接所述的二级通道(B)，在每个二级通道(B)外面设置有由激光发射器(4、6、8)和接收器(5、7、9)组成的计数装置，在每个二级通道(B)后方设有一个出口 ；四片梯形电极中上下两片梯形电极所加电压的相位差为IMf ,左右两片梯形电极所加电压的相位差也为Ιβ Τ ;同一层的分离电极上的电压的相位差为Me ,竖直方向上同一位置的上下两个分离电极电压的相位差为18T。
2.根据权利要求1所述的一种基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，其特征在:一级通道长为1.2 2cm,宽为Imm,高为25um,分离电极长为0.8 1.1cm,梯形电极长0.2 0.4cm, 二级通道宽为l/3mm,长为2cm,高为25um。
3.根据权利要求2所述的一种基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，其特征在:一级通道长为1.5 cm,分离电极长为1cm,梯形电极长0.3cm。
全文摘要
本发明公开了一种基于行波介电泳微颗粒分离的多元生物检测芯片，由一个封闭的一级通道和两个及以上的封闭的二级通道所组成；在一级通道的前端为上下左右对应的设有四片梯形电极的第一电极区，而在一级通道的后端为设有交替的分离电极的第二电极区，在第一电极区和第二电极区之间为一非电极区，在第二电极区的后端连接所述的二级通道，在每个二级通道外面设置有计数装置，在每个二级通道后方设有一个出口。本发明检测芯片行波电介泳力强于载体在微通道里受到的其它力，使载体能在较快的时间和较短的距离分离开来；由于载体间细微的差别都将引起载体所受力的改变和不同，所以细微差别的载体也能进行分离，具有灵敏度和精度高的优点。
文档编号G01N15/10GK103170385SQ201310137280
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者赵祥伟, 陶庆东, 顾忠泽 申请人:东南大学