一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法
【专利摘要】本发明提供一种研究氮磷对微囊藻毒素生成的影响的方法。该方法通过对添加不同浓度的氮磷培养铜绿微囊藻，检测微囊藻毒素的量以及微囊藻毒素产毒基因mcyB的拷贝数，建立了不同氮或磷的浓度、微囊藻毒素含量以及藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数之间的相关性。从而可以通过检测基因拷贝数来研究藻毒素的含量。本发明建立了一种通过对基因拷贝数的检测来研究氮磷对藻毒素生成的影响的方法。运用该方法检只需要检测产毒基因的拷贝数以及氮磷的浓度即可，所需时间比较短、操作比较简单，所需仪器设备和试剂相对简单。
【专利说明】一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法，具体涉及到蓝藻中的铜绿微囊藻，包含藻液总DNA提取方法、藻毒素提取以及检测方法。
【背景技术】
[0002]随着工农业生产的发展，大量氮、磷被排入水体中，导致水体富营养化不断加剧。水体的富营养化危害最大的一个表征就是蓝藻水华的出现。铜绿微囊藻是蓝藻水华的优势藻种，其释放的次级代谢产物尤其是藻毒素，对人类和生物的安全构成了严重的威胁。藻毒素(尤其是微囊藻毒素)因能引起动植物中毒，诱发人类肝癌而引起人们的高度重视。微囊藻毒素(microcystins，MCs)是一类环式七肽化合物，其分子量为500~4000 Da，目前为止已发现80多种微囊藻毒素异构体，其中含量较多、毒性较大的有MC-LR、。多年来，美国、澳大利亚、巴西等国都报道过微囊藻毒素所致的人畜中毒事件。在我国太湖、巢湖、滇池也频繁发生蓝藻水华。世界卫生组织通过制定严格的各类水中藻毒素-LR的限量标准来减轻其危害。
[0003]影响藻毒素产生的因素很多，主要集中在遗传因素和环境因素。而环境因素中氮、磷是引起水体富营养化的主要因素，同时也能影响藻毒素的产生。磷通常是湖泊中的限定因子，因而较小的磷的变化就能影响蓝藻生长和毒素的产生。通常在磷浓度较低时毒素含量较低，也有报道在磷限定的条件下，单位干重藻细胞毒素含量增加。氮元素对铜绿微囊藻的影响，主要是在氮浓度比较高的条件下，藻毒素的含量最高。也有人认为氮为微囊藻产生藻毒素提供所需要的氮源。而与藻毒素合成有关的基因mcyB，仅存在于产生藻毒素的微囊藻株系中，可以通过检测基因mcyB的拷贝数来检测藻毒素的产生。虽然很多人研究了氮磷对铜绿微囊藻产生藻毒素的影响，但很少与藻毒素合成酶基因联系起来。本发明提出了一种利用藻毒素合成酶基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法，综合考虑了氮磷对微囊藻产生藻毒素的影响以及藻毒素合成酶基因拷贝数，发现两者之间存在一定的相关性，利用其相关性可以直接通过检测藻毒素合成酶基因的拷贝数来计算不同培养条件下藻毒素生成量，大大简化了测定藻毒素的过程，简单方便。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种研究氮磷对微囊藻毒素生成影响的方法。该方法通过添加不同的氮磷培养铜绿微囊藻，通过检测微囊藻毒素量以及微囊藻毒素产毒基因mcyB的拷贝数，建立了一种通过对基因拷贝数的检测来研究氮磷对藻毒素生成影响的方法。该方法检测所需时间比较短、操作比较简单，所需仪器设备和试剂相对简单。
[0005]为达到上述目的，本发明具体步骤如下:
[0006]1、取不同氮磷浓度条件下培养的10~20 ml铜绿微囊藻的藻液，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液；
[0007]2、加入l_5ml无菌的去离子水，充分混匀，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液，得到藻细胞；
[0008]3、利用植物基因组DNA提取试剂盒对步骤2中的藻细胞进行基因提取。
[0009]4、加入mcyB基因的引物，引物信息如下:
[0010]F: 5’ - TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA -3’
[0011]R: 5’ -AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC-3’
[0012]用DNA聚合酶链式扩增反应(PCR)仪，进行DNA扩增；采用下列参数:95 °C预变性5 min，随后95 V 30 S，退火温度56 V 30 s和72 °C延伸45 S，进行30个循环，最终72°C延伸10 min。通过1.2% (wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。
[0013]5、对目标基因进行纯化:利用QIAquick Gel Extract1n Kit凝胶回收试剂盒进行凝胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.2% (wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
[0014]6、质粒转化过程:将步骤5中纯化后的DNA插入质粒载体pMD18_T中，并进一步转化到ToplO大肠杆菌感受态细胞中，随后涂布到加入了 IPTG、X-Gal和Amp的LB固体平板上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
[0015]7、利用步骤6中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品。对环境样品进行定量PCR的测定。定量PCR (ABI7300，USA)采用SYBRgreen I法,选用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq?试剂盒,按照说明书采用20 μ I反应体系，2 μ I DNA样品。采用3步法，在定量PCR仪上进行，95 V预变性30 s，95 V 15 s,退火30 S，温度同普通PCR，72 °C延伸30 s，此时采集荧光信号，40个循环后，再接溶解程序，95 0C 15 s, 60 0C I min, 95 °C 15 S。标准曲线要求相关系数大于0.99，融解曲线Tm值一致，根据标准曲线确定样品中的mcyB基因的拷贝数。
[0016]8、藻毒素的提取及定量。
[0017]取5(T100 ml藻液，用溶剂过滤器过滤，滤膜上的细胞用于提取细胞内毒素。滤膜于-20。(^下保存。
[0018]水中藻毒素的提取:采用预先活化的固相萃取C18小柱(使用前用1mL色谱纯甲醇、10 ml超纯水进行活化，活化过程中C18小柱中的吸附剂不能与空气接触)对滤液进行富集。然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80%甲醇溶液分3次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下,定容至0.5 ml,高效液相色谱仪检测。
[0019]细胞内毒素的提取:采用反复冻融法进行胞内藻毒素的提取。在-20 °〇下冷冻，室温下融化，反复三次后，用80 %甲醇溶液振荡提取3次，收集3次溶液，水浴使溶液中的甲醇挥发，经C18小柱富集，然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80 %甲醇溶液分三次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下，定容至0.5 ml，高效液相色谱仪检测。
[0020]9、对步骤7和步骤8的结果进行相关性分析。建立不同氮磷浓度培养的铜绿微囊藻中藻毒素产生量与mcyB基因的拷贝数的关系。
[0021]10、利用上述藻毒素产生量与mcyB基因拷贝数的关系，可以通过测定mcyB基因拷贝数来确定不同培养条件下藻毒素的产生量。
[0022]本发明将不同氮磷浓度对微囊藻毒素产生量与藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数相关联。建立了氮磷浓度、藻毒素含量以及藻毒素合成酶基因mcyB之间的相关性。建立相关性之后，可以通过测定藻毒素合成酶基因的拷贝数快速监测氮磷对微囊藻产生藻毒素的影响。可以省去提取以及检测藻毒素的繁琐过程，省时省力。
[0023]【具体实施方式】1:
[0024]1、不同磷浓度培养的铜绿微囊藻，其产生微囊藻毒素量与藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数之间的相关性为:y =kx + b，其中y为藻毒素量，单位为ng/ml，x为藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数，单位为coys/ml, k, b为常数。
[0025]2、取用一定浓度磷培养的10 ml~20 ml铜绿微囊藻的藻液,用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液；
[0026]3、加入1-5 ml无菌的去离子水，充分混匀，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液，得到藻细胞；
[0027]4、利用植物基因组DNA提取试剂盒对步骤3中的藻细胞进行基因提取。
[0028]5、加入mcyB基因的引物，引物信息如下:
[0029]F: 5’ - TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA -3’
[0030]R: 5’ -AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC-3’
[0031]用DNA聚合酶链式扩增反应(PCR)仪，进行DNA扩增；采用下列参数:95°C预变性5min，随后95°C 30s、退火温度56°C 30s和72°C延伸45s，进行30个循环，最终72°C延伸1min0通过1.2%(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。
[0032]6、对目标基因进行纯化:利用QIAquick Gel Extract1n Kit凝胶回收试剂盒进行凝胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.2% (wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
[0033]7、质粒转化过程:将步骤6中纯化后的DNA插入质粒载体pMD18-T中，并进一步转化到ToplO大肠杆菌感受态细胞中，随后涂布到加入了 IPTG、X-Gal和Amp的LB固体平板上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
[0034]8、利用步骤7中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品。对环境样品进行定量PCR的测定。定量PCR (ABI7300，USA)采用SYBRgreen I法,选用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq?试剂盒,按照说明书采用20 μ I反应体系，2 μ I DNA样品。采用3步法，在定量PCR仪上进行，95 V预变性30 s，95 °C 15 s,退火30 S，温度同普通PCR，72 °C延伸30 s，此时采集荧光信号，40个循环后，再接溶解程序，95 0C 15 s, 60 0C I min, 95 °C 15 S。标准曲线要求相关系数大于0.99，融解曲线Tm值一致，根据标准曲线确定样品中的mcyB基因的拷贝数。
[0035]9、藻毒素的提取及定量。
[0036]取5(T100 ml藻液，用溶剂过滤器过滤，滤膜上的细胞用于提取细胞内毒素。滤膜于-20。(^下保存。
[0037]水中藻毒素的提取:采用预先活化的固相萃取C18小柱(使用前用1mL色谱纯甲醇、10 ml超纯水进行活化，活化过程中C18小柱中的吸附剂不能与空气接触)对滤液进行富集。然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80 %甲醇溶液分3次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下,定容至0.5 ml,高效液相色谱仪检测。
[0038]细胞内毒素的提取:采用反复冻融法进行胞内藻毒素的提取。在-20 °〇下冷冻，室温下融化，反复三次后，用80 %甲醇溶液振荡提取3次，收集3次溶液，水浴使溶液中的甲醇挥发，经C18小柱富集，然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80 %甲醇溶液分三次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下，定容至0.5 ml，高效液相色谱仪检测。
[0039]10、由步骤8和步骤9的结果，进行相关性分析。结果表明，该磷浓度条件下培养的铜绿微囊藻，其藻毒素产生量与mcyB基因拷贝数之间符合线性关系y = kx + b，其中k=7X10_8，b =5.1218。
[0040]【具体实施方式】2:
[0041]1、不同氮浓度培养的铜绿微囊藻，其产生微囊藻毒素量与藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数之间的相关性为:y =kx +b，其中y为藻毒素量，单位为ng/ml，x为藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数,单位为coys/ml, k, b为常数。
[0042]2、取用一定浓度氮培养的1(T20 ml铜绿微囊藻的藻液，用7000转/分钟离心5
分钟,去掉上清液；
[0043]3、加入1-5 ml无菌的去离子水，充分混匀，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液，得到藻细胞；
[0044]4、利用植物基因组DNA提取试剂盒对步骤3中的藻细胞进行基因提取。
[0045]5、加入mcyB基因的引物，引物信息如下:
【权利要求】
1.一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行: A.取不同氮磷浓度条件下培养的10πm20 ml铜绿微囊藻的藻液，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液； B.加入1-5ml无菌的去离子水，充分混匀，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液，得到藻细胞； C.利用植物基因组DNA提取试剂盒对步骤B中的藻细胞进行基因提取。 D.加入mcyB基因的引物，引物信息如下:
F: 5’ - TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA -3’
R: 5’ -AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC-3’ 用DNA聚合酶链式扩增反应(PCR)仪，进行DNA扩增；采用下列参数:95 °C预变性5min，随后95 V 30 S，退火温度56 V 30 s和72 °C延伸45 S，进行30个循环，最终72 V延伸10 min。通过1.2 %(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。 E.对目标基因进行纯化:利用QIAquickGel Extract1n Kit凝胶回收试剂盒进行凝胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.2% (wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。 F.质粒转化过程:将 步骤E中纯化后的DNA插入质粒载体pMD18-T中，并进一步转化到ToplO大肠杆菌感受态细胞中，随后涂布到加入了 IPTG、X-Gal和Amp的LB固体平板上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。 G.利用步骤F中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品。对环境样品进行定量PCR的测定。定量PCR (ABI7300, USA)采用SYBRgreen I法,选用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq?试剂盒,按照说明书采用20 μ I反应体系，2 μ I DNA样品。采用3步法，在定量PCR仪上进行，95 V预变性30 s，95 V 15s，退火30 S，温度同普通PCR，72 °C延伸30 s，此时采集荧光信号，40个循环后，再接溶解程序，95 V 15 S，60 V I min, 95 V 15 S。标准曲线要求相关系数大于0.99，融解曲线Tm值一致，根据标准曲线确定样品中的DNA浓度。 H.藻毒素的提取及定量。 取5(T100 ml藻液，用溶剂过滤器过滤，滤膜上的细胞用于提取细胞内毒素。滤膜于-20。(^下保存。 水中藻毒素的提取:采用预先活化的固相萃取C18小柱(使用前用10 ml色谱纯甲醇、10 ml超纯水进行活化，活化过程中C18小柱中的吸附剂不能与空气接触)对滤液进行富集。然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10%甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80 %甲醇溶液分3次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下,定容至0.5 ml,高效液相色谱仪检测。 细胞内毒素的提取:采用反复冻融法进行胞内藻毒素的提取。在_20°C下冷冻，室温下融化，反复三次后，用80 %甲醇溶液振荡提取3次，收集3次溶液，水浴使溶液中的甲醇挥发，经C18小柱富集，然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用1(T20 ml 80%甲醇溶液分三次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下，定容至0.5 ml，高效液相色谱仪检测。 1.对步骤G和步骤H的结果进行相关性分析。建立不同氮磷浓度培养的铜绿微囊藻中藻毒素产生量与mcyB基因的拷贝数的关系。 J.利用上述藻毒素产生量与mcyB基因拷贝数的关系，可以通过测定mcyB基因拷贝数来确定不同培养条件下 藻毒素的产生量。
【文档编号】G01N30/06GK104131066SQ201310159569
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】刘会娟, 苏春风, 柏耀辉, 赵旭, 兰华春, 曲久辉 申请人:中国科学院生态环境研究中心