一种AFP和Free-β-HCG荧光双标的定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于医学检测【技术领域】。本发明公开了一种AFP和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒，其包括荧光定量检测试纸条和示踪探针，其特征在于，所述荧光定量检测试纸条为PVC薄板上依次搭接并粘贴滤纸、玻璃纤维素膜、划有两条检测线和一条质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完毕后剪切成试纸条；所述检测线，其中一检测线为固定有Free-β-HCG一抗的T1线，另一检测线为固化有AFP一抗的T2线；所述质控线为固化有羊抗兔IgG的C线；所述示踪探针为荧光纳米微球标记兔抗AFP抗体和兔抗Free-β-HCG抗体。本发明所述试剂盒可用于检测人血清中AFP和Free-β-HCG，AFP检测定量限为0.3IU/mL，线性范围0.3IU/mL～20IU/mL:Free-β-HCG定量检测限位0.5mIU/ml，样品添加回收率在80%～120%以内，整个检测过程仅需10min，实现了血清样品中快速定量检测。
【专利说明】—种AFP和Free- β -HCG荧光双标的定量检测试剂盒【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测【技术领域】，具体属于甲胎蛋白和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基定量检测领域；
【背景技术】
[0002]孕妇血清AFP是由胎儿肝脏产生的一种特殊蛋白，约90%的无脑儿78%~88%的开放性脊柱裂胎儿的母血AFP升高。1984年Merkatz首先提出了母血AFP过低与胎儿Down’ s综合征关系密切，随后Milunsky等提出早孕期母血测定AFP有助于筛选21、13、18三体及Tu rn er’ s综合征等染色体异常胎儿。
[0003]hCG是胎盘滋养层分泌的糖蛋白，β -hCG升高是多种胎儿染色体异常的特征，常伴有胎儿自然流产。1987年Bogart最先报道了孕中期β-hCG变化与Dow n’ s综合征的发生有关。Hsu发现β -hCG≥2.5M时，Dow n’s综合征检出率为40%。王晓雯等发现在孕中期，胎儿为Dow n’ s综合征的孕妇血清中β-hCG水平高出正常值两倍以上。
[0004]出生缺陷是我国围产儿死亡的主要原因之一，如在妊娠早、中期筛查出异常胎儿并及时终止妊娠，能有效降低由出生缺陷所引起的围产儿死亡。
[0005]目前，常用的血清学免疫检测方法主要有以下3种:
[0006]1.放射免疫检测:该方法灵敏度高、特异性强，在医学及其他生物学科的研究领域中应用广泛。近年来，有学者研究了针对自身抗原的液相放射免疫，结果表明检测特异性有所提高。但由于本方法假阳性率较高且存在对人体的放射性损伤等因素现已较少应用
[0007]2.化学发光免疫检测:是一种将发光分析和免疫反应结合起来的测定技术。主要有化学发光酶免疫技术、化学发光标记免疫技术和电化学发光免疫技术。化学发光免疫测定法有较高的敏感性与特异性，且本底低，是一个较为活跃的研究领域。近期有研究表明，应用化学发光法检测应将被测血清做100倍稀释才能避免钩状效应的产生，得到更准确的结果。该法具有高敏感性和高特异性。测定范围宽、试剂稳定、无毒害、无污染、操作简单、耗时短等优点但因其价格昂贵，在国内应用较少。
[0008]3.酶联免疫检测:是一种敏感的技术，可以在微克乃至纳克水平对所测物质进行定量检测，具有快速、敏感、简便、易于标准化、投入低、基层实验室也可开展等优点。但也存在固有缺陷，主要表现为:其一，传统包被模式，抗体分子有效利用率降低，不仅浪费抗体增加试验成本，且无效抗体分子占用固相表面的有限面积，导致抗体包被量不足影响检测的敏感度和检测范围；其二，抗体分子包被量受固相表面积限制，包被抗体量相对不足，导致不能形成双抗体夹心复合物，抗原分子只与酶结合抗体反应，此时虽然待测抗原含量很高，没产生较高的检测信号。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题在于提供一种甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β-HCG)荧光双标定量检测试剂盒及其制备方法。采用荧光定量免疫层析分析方法制备成本发明的荧光定量检测试纸条，它可对人血清中甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β-HCG)进行快速定量检测，整个检测时间仅需lOmin，完全满足孕中期血清中甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-P-HCG)的大规模筛查检测。
[0010]本发明公开了一种甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-^-HCG)荧光双标定量检测试剂盒，其包括荧光定量检测试纸条和示踪物；
[0011]所述的荧光定量检测试纸条，采用以下方法组装而成:在PVC薄板上依次搭接并粘贴滤纸、玻璃纤维素膜、划有两条检测线(固定有Free-β-HCG —抗的Tl线和固化有AFP一抗的Τ2线)和一条质控线(羊抗兔IgG，C线)的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完毕后剪切成试纸条，即得本发明的时间分辨荧光双标定量检测试纸条。
[0012]该试纸条的示踪物采用时间分辨荧光纳米微球进行标记，并用西林瓶冻干之后单独保存。
[0013]所述检测线与质控线相隔0.5cm-l.0Ocm ；
[0014]所述荧光纳米微球标记示踪物为兔抗AFP抗体、兔抗Free- β -HCG抗体及羊抗兔二抗；
[0015]优选的，所述纳米微球粒径范围为100_300nm ;
[0016]所述荧光纳米微球的荧光发光物为铕、钐、铽、镝等稀有元素；优选的，粒径范围为150_250nm。`
[0017]所述荧光纳米微球表面电荷为50-250 μ eq/g ；
[0018]所述荧光纳米微球羧基密度为为25-35.7sq.A/grp。
[0019]本发明的的荧光定量检测试纸条可用于检测血清中甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β-HCG)，定量限甲胎蛋白(AFP)为0.3IU/mL，检测线性范围0.3IU/mL~20IU/M1:游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β -HCG)定量检测限位0.5mIU/ml，样品添加回收率在80%~120%以内，整个检测过程仅需lOmin，实现了血清样品中快速定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明的定量荧光定量试纸条的结构示意图。
[0021]其中，图1中的标号说明如下:(1)为PVC薄板，(2)为滤纸，(3)为玻璃纤维素膜，
(4)为硝酸纤维素膜，(5)为Free-β -HCG检测线，(6)为AFP检测线，(7)为质控线，(8)为吸水纸，(9)为西林瓶，(10)为荧光纳米微球示踪物
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0023]实施例1
[0024]荧光微球标记的甲胎蛋白(AFP)和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free- β -HCG)抗体的制备
[0025]I)荧光微球的活化
[0026]取纯化后的荧光微球20mg溶于0.01M pH4.8的硼酸缓冲液中，超声波处理30秒后调节荧光微球浓度为5.0X IO12~1.0X IO13个/mL，磁力搅拌下缓慢加入lmL100mg/mL的碳二亚胺(EDC)和200ull00mg/mL的氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温匀速搅拌温育30min后，10000-150000g离心15分钟，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸缓冲液反复洗涤离心3次即得活化的的荧光微球。
[0027]2)荧光素微球标记的兔抗甲胎蛋白(AFP)抗体、兔抗游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β -HCG)抗体及羊抗兔IgG的制备
[0028]将活化的荧光微球溶于0.01M ρΗ7.4的磷酸缓冲液中，超声波处理30min后调节荧光微球的浓度为1.0X IO13~5.0X IO13个/mL，加入50 μ g甲胎蛋白(AFP)抗体或游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-13-HCG)抗体或羊抗兔IgG，4°C匀速搅拌反应12h后，10000-15000g离心15分钟,收集沉淀,复溶于含1.5% (m/v)海藻糖、2% (m/v)牛血清白蛋白、0.05% (v/v)的吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得荧光微球标记的甲胎蛋白(AFP)抗体、游离人绒毛膜促性腺激素β亚基(Free-β -HCG)抗体和羊抗兔IgG，置于4 °C保存备用。
[0029]实施例2
[0030]荧光纳米微球探针的冻干
[0031]将实施例1中所制 备的荧光探针分别用冻干稀释液(含4%蔗糖、2%牛血清白蛋白、1%甘露醇的0.05M pH7.4的PBPS缓冲液)稀释200倍和300倍，然后按1:1 (v/v)混合均匀，再150 μ L每孔分装于Iml西林瓶中，采用冷冻真空干燥方式将其干燥(冻干工艺见表I )，然后用硅胶塞压塞，铝箔盖锁盖密封保存。
[0032]表1冻干曲线
[0033]
【权利要求】
1.一种AFP和Free- β -HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒，其包括荧光定量检测试纸条和示踪探针，其特征在于，所述荧光定量检测试纸条为PVC薄板上依次搭接并粘贴滤纸、玻璃纤维素膜、划有两条检测线和一条质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完毕后剪切成试纸条；所述检测线，其中一检测线为固定有Free-P-HCG—抗的Tl线，另一检测线为固化有AFP —抗的Τ2线；所述质控线为固化有羊抗兔IgG的C线；所述示踪探针为荧光纳米微球标记兔抗AFP抗体和兔抗Free- β -HCG。
2.根据权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述示踪探针为冻干粉。
3.根据权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述检测线Tl、检测线Τ2及质控线C相隔均为0.5cm距离。
4.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述检测线和质控线相互平行，其中检测线靠近滤纸、玻璃纤维素膜端，质控线靠近吸水纸端。
5.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜上的检测线Tl线包被Free- β -HCG 一抗、Τ2线包被AFP —抗和质控线C线包被羊抗兔IgG。
6.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光纳米微球的粒径范围为100_300nmo
7.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光发光物为铕、钐、铽、或镝稀有元素。
8.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光纳米微球表面电荷为50-250 μeq/g。
9.如权利要求1所述定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光纳米微球羧基密度为为25-35.7sq.A/grp。
【文档编号】G01N33/76GK103760368SQ201310161101
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】庄捷, 徐秀, 肖理文 申请人:上海溯源生物技术有限公司