Cystatin S和AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（Cystatin?S）与甲胎蛋白（AFP）的联合应用，具体为Cystatin?S与AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中应用，本发明还公开了肝癌标志物的捕获剂，将捕获剂与常规试剂组合形成肝癌检测试剂盒，所得试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于肝癌的早期诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，其判断结果早于临床症状。
【专利说明】Cystatin S和AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测领域，涉及Cystatin S和AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是世界上第五大常见的肿瘤，根据世界卫生组织的报告，肝癌死亡率的增速在所有癌症中增速第二。全球每年超过50万人患肝癌，其中一半以上在中国。肝癌的发生率和死亡率几乎是一致的，预示着肝癌总体生存期比较差。因此寻找到合适的肿瘤分子标志物实现肝癌早期诊断，疗效评估以及复发监控，对降低肝癌死亡率、改善肝癌患者的生存状态具有非常高的价值。
[0003]肝硬化是肝癌发展中重要的危险因素，因此临床上建议对肝硬化患者进行肝癌风险筛查。目前对于肝癌的检测的方法主要是基于影像学方法CT或者MRI扫描，但是检测肝组织横断面成像需要组织病理来确定是否为肝癌，而这样的创伤性诊断方式，给患者带来非常大的生理的疼痛，因此患者不易接受。
[0004]标志物检测是今年发展起来的用于诊断疾病的方法，具有快速、创伤性小等特点。甲胎蛋白(AFP)是最常用的监视全球肝癌的肿瘤分子标志物，但是新发病例中AFP阴性肝癌比例的不断增加，AFP诊断肝癌的特异性及敏感度已不能满足监视肝癌的作用。因此，急需开发一些新的具有诊断价值的肝癌血清标志物，理想的肝癌标志物需要在肝脏结节恶变的早期阶段即能敏感和特异性地从外周血中检出。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂S (Cystatin S)和甲胎蛋白(AFP)在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供肝癌标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有捕获剂的试剂盒；本发明的目的之四在于提供利用试剂盒建立计算诊断和预示肝癌阈值的方法。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2.肝癌标志物的捕获剂，所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]优选的，所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白的特异性抗体。
[0011]3.含有所述捕获剂的试剂盒。
[0012]优选的，所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白浓度的试剂盒。
[0013]更优选的，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
[0014]更优选的，所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
[0015]最优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
[0016]4.利用所述试剂盒建立计算诊断和预示肝癌阈值的方法，用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白浓度，根据P=exp (-2.323+0.539X1+4.008X2) / [1+exp(-2.323+0.539X1+4.008X2)]计算阈值P，当P > 0.5时，判断为阳性；当P≤0.5时，判断为阴性；
[0017]其中X1SCystatin S的浓度，单位为pg/mL ;X2为甲胎蛋白的浓度，单位为ng/mL。
[0018]本发明的有益效果:本发明公开了诊断和预示肝癌的新标志物，即将Cystatin S和AFP联合用于制备诊断和预示肝癌的标志物，利用两个标志物联合检测肝癌的灵敏度和特异性高于单独检测其中一种标志物；本发明还公开了检测肝癌标志物的捕获剂，将捕获剂与常规试剂制成检测试剂盒，制成的试剂盒具有使用方便，重复性好，便于携带等特点，可用于肝癌的早期诊断、疗效 评估或转移复发监控等，并且具有特异性好、灵敏度高等特点，检测肝癌的灵敏度为81.4%，特异性为90.42%，其检测结果早于临床症状，为医生提前治疗和干预提供指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0020]图1为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S蛋白的标准曲线。
[0021]图2为Cystatin S-AFP联合检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0023]本发明使用的试剂如下:Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗体(货号为:11542_RP02)、Cystatin S蛋白标准品(货号11542-H08H)购自北京义翘神州生物技术有限公司，AFP血清ELISA检测试剂盒购自北京热景生物技术有限公司(货号:1003)。
[0024]实施例1建立Cystatin S血清检测反应体系及其优化
[0025]用浓度为5 μ g/mL鼠抗人Cystatin S单克隆抗体包被ELISA板,于4°C条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时,洗板；将浓度分别为Opg/mL,50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin S 蛋白标准品(Cystatin S编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.1)和样品加入封闭板中，于37°C反应I小时，洗板；然后用浓度为0.5 μ g/mL HRP标记的兔抗人Cystatin S多克隆抗体，在37°C条件下反应I小时，洗板；再与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值(图1)。结果显示，Cystatin S线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990，回收率在90%~110%范围内。
[0026] 检测体系优化，比对由美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS B10L0GICALS3个不同公司生产的Cystatin S单克隆抗体、美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S蛋白标准品和R&D公司，英国Abcam和北京义翅神州生物技术有限公司生产的Cystatin S多克隆抗体。结果表明，Cystatin S单抗优选R&D公司提供的产品,最佳工作浓度为5 μ g/mL ；Cystatin S蛋白标准品和Cystatin S多克隆抗体优选北京义翅神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0.5 μ g/mL,在最佳条件下，可实现背景OD值< 0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0027]固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较，结果显示，美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0028]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0029]稀释剂的选择:通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKFO17-1);上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的终浓度如下:3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0030]稳定剂的选择:使用3种稳定剂(具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂II1:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示，稳定剂III效果最佳，具体组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%胎牛血清和质量分数为0.2%硫柳萊。
[0031]通过以上研究确定了检测体系的主要组分，然后建立Cystatin S血清检测体系。
[0032]实施例2 Cystatin S酶联免疫检测试剂盒
[0033]根据实施例3中建立Cystatin S血清检测体系构建Cystatin S酶联免疫检测试剂盒，具体组分如表1所示:
[0034]表1.Cystatin S酶联免疫检测试剂盒组分
【权利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.肝癌标志物的捕获剂，其特征在于:所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根据权利要求3所述的捕获剂，其特征在于:所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白的特异性抗体。
5.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白浓度的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
10.利用权利要求5-9任一项所述试剂盒建立计算诊断和预示肝癌阈值的方法，其特征在于:用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和甲胎蛋白浓度，根据P=exp(-2.323+0.539X1+4.008X2) /[1+exp (-2.323+0.539X1+4.008X2)]计算阈值 P，当 P > 0.5时，判断为阳性；当P < 0.5时，判断为阴性； 其中X1为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的浓度，单位为pg/mL ;X2为甲胎蛋白的浓度，单位为 ng/mL0
【文档编号】G01N33/543GK103926409SQ201310164710
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申请人:上海良润生物医药科技有限公司