Chip蛋白在胰腺癌早期诊断以及预后判断中的用途
【专利摘要】本发明涉及CHIP蛋白在胰腺癌早期诊断以及预后判断中的用途。进一步地，本发明提供了一种CHIP蛋白在用于制备诊断胰腺癌患者的试剂盒中的用途。更特别地，本发明提供了CHIP蛋白在制备用于评估胰腺癌患者预后的试剂盒中的用途。
【专利说明】CHIP蛋白在胰腺癌早期诊断以及预后判断中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及CHIP蛋白作为诊断胰腺癌患者以及评估胰腺癌患者预后的血清标记 物的用途。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是最难早期发现、恶性程度最高和预后最差的肿瘤之一。美国癌症协会对 美国肿瘤发病率及死亡率的统计结果表明，胰腺癌占全部肿瘤死亡原因的第四位，5年生存 率在5%以下。其死亡的主要原因是超过50%患者在发现时已处于晚期，肿瘤已包绕血管或 发生远处转移，且对传统的放化疗或靶向治疗具有一定耐受性。因此，提高胰腺癌的早期诊 断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键 因素。
[0003] 由于胰腺癌临床发病隐匿，发展迅速，具有较高的侵袭性，而且通常在出现临床症 状时已进入晚期，此时进行手术及放化疗效果极差，而改变这种情况的关键在于早期的诊 断和治疗。因此，对于胰腺癌的肿瘤标记物的研究有助于肿瘤的早期发现，有助于对胰腺 的良性病变或恶性肿瘤的鉴别诊断，为早期手术治疗提供诊断依据。由于血清中可能含有 较多的肿瘤标记物，同时血样的采集安全可靠，因此，通过血清学样本对无症状患者进行胰 腺癌的筛选具有很大的潜力。目前临床上常用的胰腺癌肿瘤学标志物是CA19-9和CA142。 CA19-9是一种唾液酸Lewis血型类粘蛋白糖蛋白抗原，与Lewis血型成分有关，用于鉴别正 常人和胰腺癌患者的敏感性为79% (70%-90%)，特异性为82 (68%-91%)，其中约5%-14%的 人群缺乏Lewis抗原糖基转移酶而不能合成CA19-9,即使发生胰腺癌后其CA19-9的表达并 不升高；而急性胆管炎，胰腺炎胆汁淤积等非胰腺肿瘤疾病均可导致CA19-9表达的增加。 因此，CA19-9表达水平的改变更多的是作为手术或放化疗后肿瘤复发的依据。CA242也是 一种唾液酸化的粘蛋白类型糖抗原，由于同时受到Lewis血型的影响所以灵敏度与CA19-9 相似，约为75% (65%-82%)，特异性为90% (65%-95%)，在与慢性胰腺炎、良性肝病、胆汁淤积 等方面诊断效率略好于CA19-9。这些标志物用于鉴别诊断的准确性并不高，常需要联合使 用。因此，还需要寻找一些敏感性或特异性更好的肿瘤学标志物用于早期诊断。
[0004] C末端Hsc70反应蛋白（命名为CHIP)是一个种属间高度保守的胞浆蛋白，在平滑 肌细胞、心肌细胞、骨骼肌和大脑中高度表达。它含有三个功能区，N末端的TPR功能区、 C-末端的U-盒子功能区和中间的正负电荷富集区。CHIP作为一个陪伴蛋白（chaperone) 即可通过TPR基序（motif)与热休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用，辅助新生蛋白折叠，形 成具有正常结构和功能的蛋白，抑制变性蛋白的聚集；又可通过U-盒子功能区作为E3连 接酶，促进蛋白底物的泛素化降解。目前已经发现CHIP在多种肿瘤中发挥重要的作用。可 与CHIP结合并发生降解的蛋白包括突变的p53,雌激素受体，erbB2, SMAD3, HIF-1，SRC-3， NF-κ B，c-Myc，以及磷酸化的AKT等，这些底物都与肿瘤的增殖、侵袭或转移均密切相关。 另一方面，CHIP在乳腺癌、胃癌及脑神经胶质瘤中的表达水平要明显低于癌旁的正常组织， 这些结果均提示CHIP在多种肿瘤中发挥抑癌的作用，目前关于肿瘤患者血清中CHIP表达 水平国内外并没有相关的报道。
[0005] 本发明来源于一个惊人的方法，S卩，本发明人发现正常人、慢性胰腺炎患者和胰腺 癌患者三者血清CHIP表达水平有显著性差异。这一结果为胰腺疾病的鉴别诊断以及预后 提供了一个新的思路。
【发明内容】
[0006] 本发明人发现，癌组织表达水平高于癌旁组织，其表达与肿瘤淋巴结转移和术后 转移负相关；CHIP高表达患者预后相对较好，是影响胰腺癌预后的可能危险因素。CHIP在 慢性胰腺炎，胰腺癌患者血清中表达水平明显降低；在胰腺癌患者中，其表达水平与肿瘤远 处转移相关，CHIP可作为鉴别正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患者有效的血清学标志物。
[0007] 一方面，本发明提供了一种CHIP蛋白在用于制备诊断胰腺癌患者的试剂盒中的 用途。
[0008] 进一步地，本发明提供了一种CHIP蛋白作为区分正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患 者的有效的血清学标志物中的用途。
[0009] 进一步地，本发明提供了一种CHIP蛋白作为区分正常人、胰腺良性肿瘤和胰腺癌 患者的有效的血清学标志物中的用途。
[0010] 进一步地，本发明提供了一种CHIP蛋白作为区分胰腺良性肿瘤、胰腺内分泌肿瘤 与正常人的有效的血清学标志物。进一步地，所述的试剂盒用于ELISA方法中。
[0011] 另一方面，本发明提供了 CHIP蛋白在制备用于评估胰腺癌患者预后的试剂盒中 的用途。
[0012] 进一步地，其中CHIP蛋白高表达患者预后相对较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1显示了 CHIP和Hsp70在癌和癌旁组织中的表达水平。N代表癌旁胰腺组织， T代表胰腺癌组织。
[0014] 图2显示了 CHIP在癌组织及癌旁组织表达水平比较。
[0015] 图3显示了血清CHIP表达水平鉴别正常人和慢性胰腺炎患者的价值。
[0016] 图4显示了血清CHIP表达水平鉴别正常人和胰腺良性肿瘤患者的价值。
[0017] 图5显示了血清CHIP表达水平鉴别正常人和胰腺内分泌肿瘤患者的价值。
[0018] 图6显示了血清CHIP表达水平鉴别正常人和胰腺导管腺癌患者的价值。
[0019] 图7显示了血清CHIP表达水平鉴别慢性胰腺炎患者和胰腺良性肿瘤患者的价值。
[0020] 图8显示了血清CHIP表达水平鉴别慢性胰腺炎患者和胰腺内分泌肿瘤患者的价 值。
[0021] 图9显示了血清CHIP表达水平鉴别慢性胰腺炎患者和胰腺导管腺癌患者的价值。
[0022] 图10显示了血清CHIP表达水平鉴别胰腺良性肿瘤患者和胰腺内分泌肿瘤患者的 价值。
[0023] 图11显示了血清CHIP表达水平鉴别胰腺良性肿瘤患者和胰腺导管腺癌患者的价 值。
[0024] 图12显示了血清CHIP表达水平鉴别胰腺内分泌肿瘤患者和胰腺导管腺癌患者的 价值。
【具体实施方式】
[0025] 本发明涉及的SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用 的分离蛋白质的电泳技术。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结 构，蛋白质同SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结 合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子 团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合 是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子大小，因此可 以根据蛋白分子量大小将不同的蛋白拉出不同的梯度进而检测。
[0026] Western blot即蛋白质印迹。被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记 的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如PVDF薄膜)上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶或同位素标 记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。发光值得高低反映蛋白浓度的高低水平。
[0027] ELISA检测人血清中的CHIP表达水平是结合在固相载体(如96孔板)表面的抗体 仍保持其免疫活性，受检标本中的抗原可以与固相载体表面的抗体发生抗原抗体反应，用 洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体符合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记 的抗体，使之也通过反应而结合在固体载体上。此时固相上的酶含量即与标本中受监测物 质的量呈正比，通过酶催化的底物颜色即可确定标本中抗原的含量。
[0028] 本部分实验主要通过免疫组化研究CHIP在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水 平，通过CHIP的表达水平与临床指标的联系寻找可能影响预后的因素，通过CHIP表达水平 与总生存期和无瘤生存期观察其是否可以作为预测预后的指标；通过在正常人和不同患者 血清中CHIP表达水平的差异观察其是否可以作为胰腺癌鉴别诊断的有效肿瘤学标志物。
[0029] 实施例1、实验材料的采集
[0030] 1、组织病理标本：
[0031] 收集北京协和医院2006年1月至2010年7月收治的经病理检查确诊的胰腺导管 腺癌的病例标本，标本于北京协和医院基本外科-80°C标本库保存。研究样本的纳入和排除 标准如下：
[0032] 1)纳入标准：病理诊断为胰腺导管腺癌的标本，行手术切除的病例。
[0033] 2)排除标准：未行肿瘤切除，或仅行胰腺组织活检；病例资料不完整，无法获得随 访信息；标本无法制备成免疫组化切片。
[0034] 本次共有58例胰腺癌患者被纳入本次研究，其中男性25人，女性33人，男女比例 为1:1. 32 ;年龄< 65岁者38例，> 65岁者20例；位于胰头者36例，位于胰体尾者22例； 低分化者25例，高中分化者33例；肿瘤--Μ分期1-2期44例，3-4期14例；R0切除者47 例，R1切除11例。所有患者在术前均未接受放化疗或免疫治疗。本项研究已经获得北京 协和医院伦理委员会的批准。
[0035] 2、血清标本：
[0036] 收集北京协和医院2008年1月至2012年1月进行检查的健康志愿者47例，经临 床诊断为慢性胰腺炎患者的血标本18例，经病理检查确诊为胰腺良性肿瘤的血标本29例， 经病理检查确诊为胰腺内分泌肿瘤的血标本19例，经病理检查确诊为胰腺导管腺癌患者 的血标本47例。行手术患者其血清样品均为手术如获取样品，标本保存于北点协和医院基 本外科-80°C冰箱中。研究样本的纳入和排除标准如下：
[0037] 1)纳入标准：
[0038] 健康志愿者：无肝炎，结核，慢性炎症以及肿瘤的健康人群。
[0039] 慢性胰腺炎：根据内外分泌不足的临床症状和体征、影像学诊断作为临床诊断纳 入标准。
[0040] 胰腺良性肿瘤：包括浆液性囊性肿瘤，粘液性囊性肿瘤，导管内乳头状粘液性肿 瘤，实性假乳头性肿瘤患者。
[0041] 胰腺内分泌肿瘤：包括胰岛素瘤和胰腺内分泌癌患者。
[0042] 胰腺癌：胰腺导管腺癌患者，包括未手术切除仅行病理穿刺确诊患者。
[0043] 2)排除标准：伴有肝炎，胆囊炎或其他合并症；血清标本发生降解；术后获取的血 清样品；病例资料不完整，无法获得随访息。
[0044] 本项研究已经获得北京协和医院伦理委员会的批准。
[0045] 实施例2、实验方法
[0046] 采用本领域公知的技术进行组织蛋白的提取、组织蛋白SDS-PAGE和 Westernblot、免疫组化检测、ELISA检测人血清中的CHIP表达水平。其中CHIP蛋白的 ELISA试剂盒购自武汉华美生物有限公司，试剂盒号CBS-EL022887HU。
[0047] 免疫组化结果的判定如下：
[0048] 按染色阳性细胞百分比分为四个等级
[0049] -阴性
[0050] +< 30%阳性细胞数
[0051] ++30-60%阳性细胞数
[0052] +++>60%阳性细胞数
[0053] 以阳性细胞百分比为60%分为CHIP低表达和CHIP高表达两组。评分由两位病理 科医师独立完成。
[0054] 统计分析：
[0055] 对于计数资料采用卡方检验（Chi-square test)或Fisher精确检验；单因素分析 用Log-rank检验组间生存曲线差异，多因素分析采用Cox比例风险回归模型分析相对危险 度；Kaplan-Meier法进行生存时间分析；采用R0C曲线评估指标的诊断价值以及诊断敏感 性和特异性。统计软件采用SPSS13. 0,取p〈0. 05为有统计学差异。采用Graphpad Prism5. 0 进行统计作图。
[0056] 实施例3、实验结果
[0057] 1 )、SDS-PAGE和Western blot检测CHIP和Hsp70在胰腺癌和癌旁组织的表达水 平
[0058] 结果发现，CHIP在第一和第三例病人中的胰腺癌组织中表达水平是升高的，在第 二和第四例病人中表达水平明显降低。Hsp70表达水平差别并不明显，第一例和第三例患者 表达水平升高，第二例表达水平无明显差异，第四例表达水平降低。（图1)
[0059] 2)、免疫组化检测CHIP蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织的表达水平
[0060] CHIP蛋白表达主要在胞浆中，表现为淡黄色至深棕色。癌旁组织CHIP蛋白阴性表 达37例，有表达21例。癌组织阴性表达19例，有表达39例。胰腺癌组织中CHIP表达水 平明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义。（P=〇. 001)。（图2)
[0061] 3)、人胰腺癌组织中CHIP表达水平与临床特征的关系
[0062] 以阳性细胞百分比60%分为低表达和高表达组，进行免疫组化染色进行评分和统 计学分析。结果发现，CHIP表达水平与N分期有相关性，p=0. 041，胰腺癌中低表达CHIP发 生淋巴结转移的风险是高表达CHIP发生淋巴结转移风险的3. 06倍。另外，CHIP表达水平 也与术后肿瘤转移有相关性，P=〇. 01，低表达CHIP发生术后转移的风险是高表达CHIP发生 术后转移的4. 18倍。CHIP表达和性别、年龄、肿瘤部位、手术方式、肿瘤分化程度、是否根治 切除、T分期、远处转移、术后是否复发并无相关性。
[0063] 表1胰腺癌组织CHIP蛋白表达水平与临床指标的相关性
[0064]
【权利要求】
1. CHIP蛋白标志物在制备用于诊断膜腺癌患者的试剂盒中的用途。
2. 根据权利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白标志物作为区分正常人、慢性胰腺炎 和胰腺癌患者的有效的血清学标志物。
3. 根据权利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白标志物作为区分正常人、胰腺良性肿 瘤和胰腺癌患者的有效的血清学标志物。
4. 根据权利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白标志物作为区分胰腺良性肿瘤、胰腺 内分泌肿瘤与正常人的有效的血清学标志物。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中将所述试剂盒用于ELISA方法中。
6. -种CHIP蛋白在制备用于评估胰腺癌患者预后的试剂盒中的用途。
7. 根据权利要求6所述的用途，其中CHIP蛋白高表达患者预后相对较好。
【文档编号】G01N33/68GK104142403SQ201310172510
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2013年5月10日
【发明者】赵玉沛, 张太平, 王天笑, 由磊, 周立, 廖泉, 戴梦华, 舒红, 徐建威, 李建, 曹喆 申请人:中国医学科学院北京协和医院