一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法
【专利摘要】本发明提供了一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，包括：1）取低聚半乳糖样品，用超纯水溶解后用微孔滤膜过滤，得到待测液；2）使用钙型阳离子交换柱对待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果算得到低聚半乳糖样品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度为5及以上的多糖的百分比含量；3）使用氨基柱对待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果计算得到二糖中乳糖、半乳二糖和异乳糖的百分比含量；4）计算聚合度为2的低聚糖在总糖中的百分比含量；5)计算不同聚合度的低聚半乳糖组分在总低聚半乳糖中的百分比含量；6)计算所述低聚半乳糖样品中低聚半乳糖的平均聚合度。本发明方法可准确检测出低聚半乳糖的平均聚合度。
【专利说明】一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定平均聚合度的方法，尤其适用于测定低聚半乳糖的平均聚合 度。
【背景技术】
[0002] 低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，G0S)是一种功能性低聚糖，主要具有如 下的生理功能：促进双歧杆菌的增值，改善矿物质元素的吸收和防止骨质减少，预防、治疗 便秘；改善脂质代谢，降低血清胆固醇的含量；生成营养物质，改善营养状况。我国卫生部 已经批准G0S为新资源食品，允许添加在婴幼儿食品、乳制品、饮料、焙烤食品、糖果中。
[0003] 在生产中，以乳糖为原料，通过β-半乳糖苷酶的转糖苷作用生产的G0S，所以G0S 的分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/ Gal (η为(Γ6)。因此，商业化的G0S通常会是葡萄糖、半乳糖、乳糖、半乳二聚糖、半乳三聚 糖、半乳四聚糖和半乳五聚糖的混合物。影响形成的低聚糖结构和比例的主要因素依赖于 生产使用的β-半乳糖苷酶的来源和生产工艺。目前已经测得的G0S不同聚合度的糖苷键 结构式超过15种。
[0004] G0S组分较多，用外标法检测G0S时，存在不清楚其中有几种组分，购买不到标准 品等问题。所以，美国A0AC官方公布的标准方法--A0AC2001. 02中采用来源于米曲霉的 β -半乳糖苷酶把乳糖和G0S水解，利用离子色谱检测水解前和水解后样品中的半乳糖、乳 糖的含量，然后用总水解液中半乳糖含量减掉样品中游离的半乳糖和乳糖水解来源的半乳 糖含量，计算出来源于G0S的半乳糖含量，再通过对样品中G0S的平均聚合度计算得到样品 中G0S的含量。在实际检测中，由于G0S组分的复杂性，G0S的聚合度没有办法准确得到， 因此不适合实际使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，可准确检测出低聚 半乳糖的平均聚合度。
[0006] 本发明提供了一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，包括： 1) 取低聚半乳糖样品，用超纯水溶解后用微孔滤膜过滤，得到待测液； 2) 使用钙型阳离子交换柱对待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果计算得 到低聚半乳糖样品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度为5及以上的多糖的百分 比含量； 3) 使用氨基柱对待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果计算得到二糖中乳 糖、半乳二糖和异乳糖的百分比含量； 4) 由公式计算聚合度为2的低聚糖在总糖中的 百分比含量，式中：怂为聚合度为2的低聚糖在总糖中的百分比含量为半乳二糖在二糖 中的百分比含量;r#为异乳糖在二糖中的百分比含量为乳糖在二糖中的百分比含量； A为二糖在总糖中的百分比含量； 5) 由公式兄计算不同聚合度的低聚半乳糖组分在总低聚 半乳糖中的百分比含量，式中:兄为聚合度为η的低聚半乳糖组分在总低聚半乳糖中的百 分比含量&为聚合度为η的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量为聚合度为2的 低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量;r,为聚合度为3的低聚半乳糖组分在总糖中的百 分比含量;A为聚合度为4的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量;&为聚合度为5的 低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； 6) 由公式十算低聚半乳糖样品中低聚 半乳糖的平均聚合度，式中:/?为低聚半乳糖的平均聚合度;^为组分i的百分比含量，％ ; 为组分i的聚合度。
[0007] 在测定低聚半乳糖平均聚合度的方法的一种示意性实施方式中，所述使用钙型 阳离子交换柱对待测液进行高效液相色谱法检测的条件为：色谱柱为CH0-620分析柱，规 格为6. 5X300mm ;示差折光检测器；流动相为超纯水；色谱柱温度为80°C ;流动相流量为 0. 5ml/min ;检测器温度为50°C ;进样量为20 μ L ;在正式进样检测前，以超纯水作为流动 相，以0. 5mL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。
[0008] 在测定低聚半乳糖平均聚合度的方法的一种示意性实施方式中，所述使用氨基柱 对待测液进行高效液相色谱法检测的条件为：色谱柱为氨基柱，规格为4. 6X 250mm ;示差 折光检测器；流动相为乙腈：超纯水=70 : 30 ;色谱柱温度为35°C ;流动相流量为1. 0ml/ min ;检测器温度为40°C ;进样量为20 μ L ;在正式进样检测前，以超纯水作为流动相，以 1. OmL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。
[0009] 本发明提供的一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，可准确检测出低聚半乳糖 的平均聚合度。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。
[0011] 图1是本发明第一实施例用CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的色谱图。
[0012] 图2是本发明第一实施例用氨基柱分析低聚半乳糖的色谱图。
【具体实施方式】
[0013] 为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明 本发明的【具体实施方式】。
[0014] 第一实施例。
[0015] 1材料与方法。
[0016] 1.1实验材料 分别采购了 6份低聚半乳糖糖楽或糖粉样品。氨基色谱柱（ZORBAX Carbohydrate，4. 6 mmX150 mm，70 --)，美国Agilent公司；CH0-620糖分析柱（6. 5X300mm)，上海安谱科学仪 器有限公司；超纯水；乙腈(色谱纯)，天津市天昊化工有限公司。
[0017] 1.2主要仪器 美国AgilentllOO高效液相色谱仪；自动进样器；美国AgilentllOO示差折光检测器； Millipore超纯水处理装置；电子分析天平。
[0018] 1.3实验方法。
[0019] 1.3.1样品处理 分别称取低聚半乳糖原料l.OOOOg，用超纯水溶解转移到l〇〇mL容量瓶中，并稀释到刻 度，摇勻，制成1%的样品待测溶液，用〇. 2 μ m微孔滤膜过滤，得到待测液。
[0020] 1. 3. 2 CH0-620分析柱根据聚合度分析低聚半乳糖色谱条件 色谱柱为CH0-620分析柱（6. 5X300mm);示差折光检测器；流动相为超纯水；色谱柱 温度为80°C ;流动相流量为0. 5ml/min ;检测器温度为50°C ;进样量为20 μ L。在正式进样 检测前，以超纯水作为流动相，以〇. 5mL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。
[0021] 1. 3. 3氨基柱分析低聚半乳糖中二糖的组成色谱条件 色谱柱为氨基柱（4. 6X250mm);示差折光检测器；流动相为乙腈：超纯水=70 : 30; 色谱柱温度为35°C ;流动相流量为1. 0ml/min ;检测器温度为40°C ;进样量为20 μ L。在 正式进样检测前，以超纯水作为流动相，以1. 〇mL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进 样。
[0022] 1. 3. 4计算方法 采用面积归一法完成低聚半乳糖样品中各种组分相对百分含量的计算。
[0023] 2结果与讨论。
[0024] 2. 1 CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的结果 CH0-620分析柱使用Transgenomic树脂作为填料，根据配体交换（ligand-exchange) 原理分析糖类物质，即糖分子端基异构碳上所带羟基可被去质子化后带上强的负电荷，这 些负电荷与Transgenomic糖柱的树脂表面金属离子所带的正电荷之间的相互作用可使糖 分子被保留，低聚糖在洗脱时根据保留性质的强弱和分子量的大小达到分离。
[0025] 用CH0-620分析柱检测时，以超纯水作流动相。出峰顺序依次是五糖(含聚合度5 以上的糖)、四糖、三糖、二糖、葡萄糖、半乳糖。用CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的色谱图 如图1所示。采用面积归一法，由仪器自带的软件系统计算6种商业化的低聚半乳糖原料 中各聚合度糖组分所占的比例，见表1。
[0026] 表1不同公司生产的低聚半乳糖原料的组成和比例
【权利要求】
1. 一种测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其特征在于，包括： 1) 取低聚半乳糖样品，用超纯水溶解后用微孔滤膜过滤，得到待测液； 2) 使用钙型阳离子交换柱对所述待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果计 算得到所述低聚半乳糖样品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度为5及以上的多 糖的百分比含量； 3) 使用氨基柱对所述待测液进行高效液相色谱法检测，并根据检测结果计算得到所述 二糖中乳糖、半乳二糖和异乳糖的百分比含量； 4) 由公式计算聚合度为2的低聚糖在总糖中的 百分比含量，式中： 怂为所述聚合度为2的低聚糖在总糖中的百分比含量； 为所述半乳二糖在所述二糖中的百分比含量； 为所述异乳糖在所述二糖中的百分比含量； 为所述乳糖在所述二糖中的百分比含量； &为所述二糖在总糖中的百分比含量； 5) 由公式兄计算不同聚合度的低聚半乳糖组分在总低聚 半乳糖中的百分比含量，式中： 兄为聚合度为η的低聚半乳糖组分在总低聚半乳糖中的百分比含量； Α为聚合度为η的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； Α为聚合度为2的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； r,为聚合度为3的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； &为聚合度为4的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； A为聚合度为5的低聚半乳糖组分在总糖中的百分比含量； 6) 由公式十算所述低聚半乳糖样品中 低聚半乳糖的平均聚合度，式中： /?为低聚半乳糖的平均聚合度； 為.为组分i'的百分比含量，％; 为组分i的聚合度。
2. 如权利要求1所述的测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其中，所述使用钙型阳离 子交换柱对所述待测液进行高效液相色谱法检测的条件为：色谱柱为CH0-620分析柱，规 格为6. 5X300mm ;示差折光检测器；流动相为超纯水；色谱柱温度为80°C ;流动相流量为 0. 5ml/min ;检测器温度为50°C ;进样量为20 μ L ;在正式进样检测前，以超纯水作为流动 相，以0. 5mL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。
3. 如权利要求1所述的测定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其中，所述使用氨基柱 对所述待测液进行高效液相色谱法检测的条件为：色谱柱为氨基柱，规格为4. 6 X 250mm ; 示差折光检测器；流动相为乙腈：超纯水=70 : 30 ;色谱柱温度为35°C ;流动相流量为 1. Oml/min ;检测器温度为40°C ;进样量为20 μ L ;在正式进样检测前，以超纯水作为流动 相，以1. OmL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。
【文档编号】G01N30/02GK104155389SQ201310176139
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】张志国, 王彩霞, 史玉东, 生庆海 申请人:内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司