一种检测蛋白水解酶活性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测蛋白水解酶活性的方法，该方法包括将含有蛋白水解酶的待测样品与香豆素衍生物荧光探针接触，得到接触后的物料，检测接触后的物料在激发光下发出的荧光的强度，其中，所述香豆素衍生物荧光探针为式（1）或式（2）所示结构的非肽香豆素衍生物；其中，在式（1）中R1为甲基或乙基。通过上述技术方案，本发明提供了一种灵敏、简单、经济的蛋白水解酶活性检测方法、蛋白水解酶活性检测试剂盒以及香豆素衍生物荧光探针在制备检测样品中蛋白水解酶活性的试剂盒中的用途。式（1）------------------------?式（2）。
【专利说明】一种检测蛋白水解酶活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测蛋白水解酶活性的方法。
【背景技术】
[0002]现有测定蛋白水解酶活性的方法主要有三种。第一种是传统的高效液相色谱法(HPLC)，该方法可以直接用于监测蛋白水解酶的对底物的水解反应。但是，高效液相色谱法的实验过程繁琐、周期长，并且很难做到抑制剂的筛选。第二种是紫外吸收光谱法，这种方法因其简单、快速的优点获得广泛的使用，但是紫外吸收光谱法仍然有着一定的缺陷。首先，这种方法背景干扰大导致灵敏度低。另外，参与分析的底物都是多肽衍生物，难于合成导致制备成本很高。第三种是荧光发射光谱法，这是一种比较新颖的方法，灵敏度高，方法简单，并且可以用于高通量筛选。遗憾的是，目前使用的荧光探针仍是多肽，在常规条件下大都稳定性差，储存和运输条件苛刻，原子利用率很低。因此，设计开发基于非肽荧光探针的灵敏、简单、经济的检测方法是非常迫切和必要的。然而目前为止，国内外较少关于非肽荧光探针用于检测弹性蛋白酶(EC号:3.4.21.37)、胰蛋白酶(EC号:3.4.21.4)、胰凝乳蛋白酶(EC号:3.4.21.1)和羧肽酶(EC号:3.4.17.1)活性的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术中的多肽类荧光探针稳定性差，储运条件苛刻，原子利用率低的缺点，提供一种灵敏、简单、经济的的蛋白水解酶活性检测方法。
[0004]本发明提供了一种检测蛋白水解酶活性的方法，该方法包括将含有蛋白水解酶的待测样品与香豆素类衍生物荧光探针接触，得到接触后的物料；检测接触后的物料在激发光下发出的荧光的强度；其中，所述香豆素类衍生物荧光探针为式(I)或式(2)所示结构的非肽香豆素衍生物；
[0005]
【权利要求】
1.一种检测蛋白水解酶活性的方法，该方法包括将含有蛋白水解酶的待测样品与香豆素衍生物荧光探针接触，得到接触后的物料，检测接触后的物料在激发光下发出的荧光的强度，其特征在于，所述香豆素衍生物荧光探针为式(I)或式(2)所示结构的非肽香豆素衍生物；
其中，在式(I)中R1为甲基或乙基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在式(I)中R1为乙基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述香豆素衍生物为式(I)所示结构，所述蛋白水解酶为弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述香豆素衍生物为式(2)所示结构，所述蛋白水解酶为弹性蛋白酶。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，相对于Iμ M的蛋白水解酶，所述香豆素衍生物的用量为1-100 μ Μ。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，接触的条件包括:温度为25-37°C，pH值为6-8，时间为5-30min。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中,所述激发光的波长为360-405nm,所述荧光的发射波长为500-520 nm。
8.—种检测样品中蛋白水解酶活性的试剂盒，该试剂盒包括:香豆素衍生物荧光探针以及待测蛋白水解酶的标准品；所述香豆素衍生物荧光探针为式(I)或式(2)所示结构的非肽香豆素衍生物；
式(I)式(2) 其中，在式(I)中R1为甲基或乙基。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，在式(I)中R1为乙基。
10.香豆素衍生物荧光探针在制备检测样品中蛋白水解酶活性的试剂盒中的用途，所述香豆素衍生物荧光探针为式(I)或式(2)所示结构的非肽香豆素衍生物；
式(I)式(2)其中，在式(I)中R1为甲基或乙基。
【文档编号】G01N33/52GK104165869SQ201310184727
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】杨光富, 杨文超, 孙琦, 李俊, 刘万年 申请人:华中师范大学