Prrsv基因标记疫苗株elisa鉴别诊断试剂盒及方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，以PRRSV基因标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)特异性标记区域缺失的25aa多肽作为包被抗原，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，可快速、准确地区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，同时可快速、准确地鉴别诊断出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，对于PRRS基因标记疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。
【专利说明】PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测【技术领域】，具体涉及一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的全球范围内严重危害养猪业的传染病。1987年首先在美国发现该病，以各年龄段母猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征症状的传染性疾病在美国和加拿大地区发现，并迅速向世界各地蔓延；1996年我国首次分离出PRRSV，2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合(HP-PRRS)大范围爆发，给我国养殖业带来巨大损失，PRRS的监测和防控成为重要课题。目前，猪繁殖与呼吸综合征流行毒株包括PRRS经典毒株、PRRS经典疫苗株、PRRS高致病性毒株、PRRS高致病性疫苗株等，众多毒株并存使我们对该病监测的难度加大。该病的流行特点及其病原特性决定其高度传染性，疫苗是目前预防该病的主要手段。国内使用的疫苗主要包括弱毒疫苗和灭活疫苗，其中弱毒疫苗由于其具有抗体产生快、持续时间长和保护力强等特点，在临床上被广泛使用于控制PRRS的流行，但传统的弱毒疫苗在抗体监测过程中无法区分野毒和疫苗毒感染。基于此，本实验室在PRRSV弱毒疫苗HuM-Fl 12株反向遗传平台的基础上，将NSP2的复制非必须区域(Λ 508-532)进行缺失，同时在该区域插入新城疫病毒NP蛋白末端49个氨基酸(ΝΡ49)作为标记，成功构建了双标记基因工程弱毒疫苗株(rHN4- Δ 25+NP49株)，该疫苗株由于具备缺失和插入正、负双标记，这就为特异性区分野毒感染和实现PRRS有效防控奠定了坚实基础。
【发明内容】
[0003]本发明要解决目前由于众多种类PRRS疫苗的广泛使用，加大了对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染鉴别诊断难度的技术问题，提供一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，该试剂盒以基因工程标记疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa)作为包被抗原，不仅能有效区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，而且能有效区分出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，其灵敏度高、特异性强、重复性好。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0005]在本发明的一个方面，提供了一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本发明采用特异性标记区域缺失的25个氨基酸(25aa)多肽作为包被抗原，保证抗原的特异性和纯度，避免了其他杂蛋白混杂存在干扰。而且25aa相对分子量小、结构简单，降低了与其他病毒细菌抗体交叉反应的可能性，该25aa合成肽抗原呈水溶性，可较好的包被于酶标板，操作省时方便。该25aa特异性多肽抗原不同于PRRSV全病毒抗原或高表达量的融合蛋白抗原，由于PRRSV感染猪产生的抗体大部分是针对N蛋白，血清样品中针对25aa多肽抗原的抗体相对较少，因此选择纯度高的25aa多肽作为包被抗原可以明显提高针对25aa抗体检测的敏感度和特异性。
[0007]所述试剂盒还包含ELISA酶标板、封闭液、血清稀释液、酶标二抗、显示液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清。
[0008]优选的，25aa多肽抗原的包被浓度为500ng/孔。
[0009]优选的，所述封闭液为5%重量浓度的脱脂乳。
[0010]优选的，所述血清稀释液为2%重量浓度的牛血清白蛋白；所述血清稀释液对血清的稀释度为1: 40。
[0011]优选的，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪抗体，其稀释度为I: 8000。
[0012]在本发明的另一方面，还提供了一种非诊断目的的PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别方法，包括以下步骤:
[0013]用25aa多肽抗原包被ELISA酶标板，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0014]将待测血清与包被抗原作用后，依次加入酶标二抗、显色液和终止液；
[0015]利用酶标仪读取吸光度值0D45(lnm，并按公式:S/P =(待测血清样品OD-阴性对照0D) / (阳性对照OD-阴性对照0D)，计算待测血清样品的S/P值；
[0016]待测血清样品S/P值>临界值的判为阳性，5外值<临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。
[0017]所述待测血清的稀释度为1: 40。
[0018]在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备鉴别诊断PRRS基因工程标记疫苗免疫猪的产品中的应用。
[0019]本发明PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，以基因工程标记疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa)作为包被抗原，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，可快速、准确地区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，同时可快速、准确地鉴别诊断出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，对于PRRS基因标记疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0021]图1是本发明实施例2的25aa_ELISA反应条件优化结果图；
[0022]图2是本发明实施例3的25aa_ELISAROC曲线图；
[0023]图3是本发明实施例6的25aa_ELISA检测HuN4_F112血清样品结果图。
【具体实施方式】
[0024]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京:科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0025]猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) rHN4- Δ 25+NP49株是一种用于预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征的新型基因标记弱毒疫苗候选株，为了配合该基因标记疫苗株的免疫效果评价，本发明以基因工程标记疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa，SEQ ID NO: I)作为包被抗原，建立一种简便、特异的25aa_ELISA方法。本发明通过对25aa-ELISA反应条件的优化，确定抗原最适包被浓度为500ng/孔，5 %脱脂乳4°C过夜封闭，血清最佳稀释度为1: 40，酶标二抗最佳稀释度为1: 8000，抗体最佳作用时间及底物选择和显色条件和时间等，同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15，批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10%，表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示本发明方法及试剂盒与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84%，采用25aa负标记ELISA试剂盒检测HuM-Fl 12疫苗免疫猪血清，结果显示从免疫后第21天可检测25aa特异性抗体，该抗体至少可持续存在126天。本发明建立的25aa负标记ELISA检测方法和试剂盒为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株的临床应用提供了有利保障。
[0026]实施例1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
[0027]1.血清和试剂
[0028]PRRS 阴性血清、PRRSV HuN4_F112 阳性血清、PRRSV rHN4- Δ 25+NP49 株阳性血清、猪伪狂犬(PRV)阳性血清、猪瘟(CSFV)阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清，均为本实验室保存。猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪圆环2型病毒(PCV-2)阳性血清为哈尔滨兽医研究所猪病研究室提供；
[0029]辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪IgG购自Sigma公司；脱脂乳购于BD公司；TMB显色液、脱脂乳、牛血清蛋白(BSA)购自AMRESC0公司。PRRSV抗体检测试剂盒HerdCheckPRRS X3 购自 IDEXX 公司。
[0030]2.抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
[0031]将特异性缺失区域25aa多肽抗原(SEQ ID NO:1)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成10倍梯度进行包被(?ο μ g/mL至0.125 μ g/mL)，每孔包被100 μ L ;4°C包被过夜；5%脱脂乳于37°C封闭2h。PRRSV HuN4_F112株阳性血清、阴性血清分别I: 20、1: 40、I: 80,1: 160稀释，每孔100 μ L，37°C孵育Ih进行ELISA方阵试验。HRP标记的山羊抗猪IgG抗体1: 10000倍稀释，每孔100yL，37°C孵育lh。加入100 μ L TMD显色底物，室温避光显色lOmin。50 μ L2mol/L H2S04终止反应。测定各孔OD45(lnm值,确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。
[0032]3.结果
[0033]抗原的初始浓度为lmg/ml，通过棋盘法确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。由表I可知，抗原和抗体稀释倍数的增加，阳性血清的OD值存在下降趋势，阴性血清的OD值变化不显著。选择阴性血清的OD45Qnm值彡0.100，阳性血清的OD45(lnm值彡0.200，阳性血清和阴性血清OD45(lnm比值P/N彡2的最大稀释度，即血清的稀释度为1: 40，抗原的稀释浓度为1: 200，每孔包被量为500ng抗原为最佳包被量。
[0034]表I棋盘法测定阳性血清和阴性血清的0D450nm值
【权利要求】
1.一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ELISA酶标板、封闭液、血清稀释液、酶标二抗、显示液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述25aa多肽抗原的包被浓度为500ng/ 孔。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5%重量浓度的脱脂乳。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为2%重量浓度的牛血清白蛋白。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液对血清的稀释度为I: 40。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪抗体，其稀释度为1: 8000。
8.一种非诊断目的的PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤: 用25aa多肽抗原包被ELISA酶标板，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； 将待测血清与包被抗原作用后，依次加入酶标二抗、显色液和终止液； 利用酶标仪读取吸光度值OD45(lnm，并按公式:S/P =(待测血清样品OD-阴性对照0D) /(阳性对照OD-阴性对照0D)，计算待测血清样品的S/P值； 待测血清样品S/P值>临界值的判为阳性，3外值<临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测血清的稀释度为1: 40。
10.权利要求1所述试剂盒在制备鉴别诊断PRRS基因工程标记疫苗免疫猪的产品中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104165998SQ201310240060
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年6月17日 优先权日:2013年6月17日
【发明者】童光志, 周艳君, 孙晶, 姜一峰, 童武 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所